試驗(yàn)材料 (1)試驗(yàn)菌種：大腸桿菌，枯草芽抱桿菌，金黃色葡萄球菌，沙口氏菌。本實(shí)驗(yàn)所用菌種 大腸桿菌，枯草芽抱桿菌，金黃色葡萄球菌，沙口氏菌均由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué) 院實(shí)驗(yàn)中屯、提供。
[0047] (2)抑制菌：W上分離純化得到的連翅內(nèi)生細(xì)菌。
[0048] (3)培養(yǎng)基：肉汁腺培養(yǎng)基（BPA):牛肉浸膏3.Og、蛋白腺5.Og、酵母膏1.Og、葡萄 糖10.Og、瓊脂20g、蒸饋水1000ml。W上不加瓊脂即為肉汁腺液體培養(yǎng)基。0.IMPa, 115°C 高溫滅菌30min 2. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 (I)在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)挑取適量的分離純化得到的連翅內(nèi)生細(xì)菌，然后接種于 牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60小時(shí)使菌體達(dá)到平穩(wěn)期的 生長(zhǎng)狀態(tài)。用移液管吸Iml在離屯、機(jī)中，12000巧m下離屯、5min。
[0049] (2)在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)挑取適量大腸桿菌，枯草桿菌，金黃色葡萄球菌，沙 口氏菌等細(xì)菌培養(yǎng)物，然后接種于牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)12小時(shí)使菌體達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后用無菌水將原始菌液稀釋到不同的倍數(shù)，再用 722S型分光光度計(jì)在420nm處測(cè)其稀釋后的吸光值，使每種菌液的吸光值都達(dá)到0. 006,涂 布后菌落致密均勻分布。
[0050](3 )配制牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基（固體和液體） (4) 洗凈各種試驗(yàn)器皿，干燥，放入滅菌鍋中滅菌（12rC，30min 3.試驗(yàn)方法 (1) 將實(shí)驗(yàn)所用器材在局壓殺菌鍋內(nèi)滅菌（121 °C，30min) (2) 打開超凈工作臺(tái)的紫外燈開關(guān)，殺菌十五分鐘后，在低風(fēng)速鼓風(fēng)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0051] (3)用定量移液槍吸取150y1已稀釋好的菌液，在已倒好的平板上用涂布棒涂布 到均勻致密。
[0052](4)用無菌操作將滅菌的膠頭吸管(外徑為8毫米、孔徑與孔距均為7毫米，管的兩 端要光滑，也可用玻璃管、瓷管)，放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并W 火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合防菌液滲漏，影響結(jié)果） (5) 加樣：用移液槍吸20ul垂直加入孔中，使樣品加至滿而不溢為止。
[0053] (6)將平皿培養(yǎng)基置于37°C溫箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，觀察抑菌圈效果。
[0054] 4.試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過幾次重復(fù)試驗(yàn)，并沒有觀察到該菌株對(duì)枯草芽抱桿菌，沙口氏菌和大腸桿菌的抑 制現(xiàn)象，只觀察到它們對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制現(xiàn)象。
[00巧]二、連翅內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵上清液的防腐應(yīng)用實(shí)驗(yàn) 1、涂胺保鮮劑制備 收集連翅內(nèi)生細(xì)菌A發(fā)酵上清液，離屯、收集上清，0. 45ym濾膜過濾，濾液添加1%明膠 制成涂膜保鮮劑，同時(shí)用nisin作為陽性對(duì)照，配制成0. 2g/Lnisin、l%明膠的涂膜保鮮 劑，含1%明膠的PBS作為陰性對(duì)照。
[005引 2、試驗(yàn)分組 購(gòu)買新鮮蛋品，分為L(zhǎng)Q-A組，Nisin組和PBS組，每組樣品選用大小均勻的雞蛋30顆， 分別在沸水中煮沸5s，，再分別用不同的涂膜保鮮劑涂膜處理后，常溫下膽藏60天，分別在 第10天、20天、30天、40天，50天，60天觀察蛋品的新鮮度。
[0057] 3、試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第10天和20天，LQ-A組和Nisin組都保持較高的新鮮度，蛋黃完整，PBS對(duì)照組蛋黃出現(xiàn)小白點(diǎn)；到第40天，LQ-A組蛋黃出現(xiàn)小白點(diǎn)，Nisin組蛋黃保持完整，PBS 對(duì)照組蛋黃散開；第60天，=組蛋黃均散開，說明LQ-A發(fā)酵上清液具有較好的防腐保鮮效 果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株連翹內(nèi)生細(xì)菌LQ-A，其特征在于：分類命名為枯草芽孢桿菌（你 ，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2015 年05月13日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10805。2. 如權(quán)利要求1所述的連翹內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的分離與純化方法，其特征在于：包括以下 步驟： 1、 原料及用具的準(zhǔn)備 (1) 新鮮連翹葉：采新鮮連翹葉，用塑料袋包裹，置于〇-4°C冰箱中保存，備用； (2) 研缽和研棒：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； (3) 培養(yǎng)皿、錐形瓶和試管：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； (4) 10ml和lml移液管：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； (5) 50ml和100ml燒杯：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； 2、 培養(yǎng)基及化學(xué)試劑的配制 (1) 培養(yǎng)基：肉汁胨培養(yǎng)基：每1000mL培養(yǎng)基中添加牛肉浸膏3. 0g、蛋白胨5. 0g、酵 母膏1. 0g、葡萄糖10. 0g和瓊脂18-20g，余量為蒸餾水；0.IMPa，115°C高溫滅菌30min; 肉汁胨液體培養(yǎng)基：每1000mL培養(yǎng)基中添加牛肉浸膏3. 0g、蛋白胨5. 0g、酵母膏1. 0g和葡萄糖10. 〇g，余量為蒸餾水；0.IMPa，115°C高溫滅菌30min; (2) 化學(xué)試劑的配制 濃度為lmol/L的NaOH水溶液：稱取4gNaOH用80mL水溶解，定容至100mL; 7%Hcl:量取70%Hcl10mL，定容至100mL;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液：量取99%無水 乙醇75mL，用無菌去離子水定容至100mL;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.l%HgCl2水溶液：稱取0.lgHgCl2 用80mL水溶解，加水定容至100mL;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaC10水溶液：量取10%的NaCIO50mL， 加入定容至100mL;3. 操作方法 (1) 稱量并且表面消毒 稱連翹葉片5g，用自來水沖洗干凈，在無菌操作臺(tái)上，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶 液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇.lffigCl2水溶液對(duì)翹葉片的表面進(jìn)行消毒5分鐘，再用無菌水漂洗翹葉 片4次； (2) 檢驗(yàn)消毒效果 取最后一次無菌水沖洗液，涂布到肉汁胨培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)3天，檢驗(yàn)滅菌效 果；若發(fā)現(xiàn)皿中無菌落出現(xiàn)，證明該葉片表面滅菌徹底，否則該分離結(jié)果不能使用； (3) 樣品處理 用滅過菌的剪刀將葉片剪成l〇mm的正方形，置于研缽中，加15ml無菌水反復(fù)研磨搗 碎，靜置30min鐘后，用無菌移液管取lml上清液置于10ml試管中，加水梯度稀釋到濃度為 10LlO4,得到不同濃度的稀釋液；用無菌移液管分別取0. 2ml不同濃度的稀釋液涂布于肉 汁胨培養(yǎng)基平板上，每濃度涂平皿一個(gè)，重復(fù)3次，至于37°C溫箱中培養(yǎng)； (4) 純化 培養(yǎng)3-5d后，挑取不同形態(tài)的菌落在固體平板上劃線純化，直到分離得到單菌落； (5) 鏡檢 挑取單菌落固定在載玻片上，用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍 鏡下觀察菌落形態(tài)； (6)保存 挑取鏡檢時(shí)所用的單菌落接種于含有肉汁胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在37°C150r/min搖床中培養(yǎng)12h，至細(xì)菌長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，蘸取菌懸液接種于斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2d，在 試管中觀察到s型的菌種，再轉(zhuǎn)移到4°C的冰箱中斜面真空冷凍干燥保存，即得到連翹內(nèi)生 細(xì)囷L(fēng)Q_A。3. 如權(quán)利要求2所述的連翹內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的分離與純化方法，其特征在于：所述革蘭 氏染色法為，草酸銨結(jié)晶紫染色lmin，自來水沖洗，碘液染lmin，水洗，95%的酒精脫色20s， 水洗，番紅復(fù)染2min，水洗。4. 利用權(quán)利要求1所述的連翹內(nèi)生細(xì)菌LQ-A制備涂膜保鮮劑的方法，其特征在于：包 括步驟如下：收集連翹內(nèi)生細(xì)菌A發(fā)酵上清液，離心收集上清，0. 45μπι濾膜過濾；然后按照 濾液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的明膠的體積比為2:1，將濾液添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的明膠中，混合 均勻后，即制備出涂膜保鮮劑。
【專利摘要】一株連翹內(nèi)生細(xì)菌LQ-A及其分離、純化方法和應(yīng)用；所述連翹內(nèi)生細(xì)菌LQ-A，保藏編號(hào)為CGMCC？No.10805；該的連翹內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的分離與純化方法，稱連翹葉片，水沖洗，依次用乙醇水溶液和HgCl2水溶液對(duì)翹葉片的表面進(jìn)行消毒，無菌水漂洗翹葉片；將葉片剪成正方形，置于研缽中，加無菌水研磨搗碎，取清液進(jìn)行梯度稀釋，用無菌移液管取稀釋液涂布于BPA平板上培養(yǎng)；培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)的菌落在固體平板上劃線純化，直到分離得到單菌落；挑取鏡檢時(shí)所用的單菌落接種于含有BPA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床中培養(yǎng)，蘸取菌懸液接種于斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移到冰箱中斜面真空冷凍干燥保存。該菌可用于涂膜保鮮劑的制備，可應(yīng)用于食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)。CGMCC No.1080520150513
【IPC分類】C12R1/125, A23B5/16, C12N1/20, A23B5/06
【公開號(hào)】CN105296382
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510638009
【發(fā)明人】牛明福, 張婷婷, 萬鵬, 盧雪, 雷俊紅, 司晶麗, 馬軼芳
【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年9月30日