μL活化后的各指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙口氏菌）加入7mL、 45-50°C的營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基中，使其終濃度為108CFU/mU混勻后倒入上述已培養(yǎng)24h的 平板上，37Γ培養(yǎng)24h后，觀察抑菌圈并記錄和拍照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)Ξ次取算數(shù)平均值，結(jié) 果如表3所示。 陽(yáng)0化]
[0086] 表3H9菌株對(duì)各指示菌的抑菌作用
[0087] 注：表中數(shù)據(jù)為平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差，單位為cm。
[0088] 結(jié)果表明，H9菌株和嗜酸乳桿菌ATCC4356對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙口氏 菌均有抑制作用，且H9菌株的抑制活性顯著高于嗜酸乳桿菌ATCC4356,說(shuō)明H9菌株的抑菌 作用比較強(qiáng)烈。且H9菌株不產(chǎn)生細(xì)菌素，運(yùn)表明其抑菌活性源于乳酸和菌體本身。
[0089] 實(shí)施例6:畐[J干酪乳桿菌（Xactobacillusparacasei)H9降膽固醇的活性檢測(cè)
[0090] 1、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0091] 精確稱(chēng)量Img膽固醇標(biāo)品，用乙醇溶解，配成Img/mL的膽固醇母液。再將母液稀 釋?zhuān)玫?.Img/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0,0. 1，0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0.6血的膽固醇標(biāo) 準(zhǔn)溶液置于10血試管中，60°C水浴揮發(fā)盡溶劑后，加入2血的顯示劑（0. 5mg/血的鄰苯二 甲醒一冰醋酸溶液），室溫靜置lOmin后，緩慢加入ImL濃硫酸，混勻，于90min內(nèi)用可見(jiàn)光 分光光度計(jì)測(cè)定其在550nm波長(zhǎng)處的吸光值，用蒸饋水調(diào)零。WODse。值為橫坐標(biāo)，膽固醇 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為縱坐標(biāo)，得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。
[0092] 2、H9菌株降膽固醇的活性檢測(cè)
[0093] 將過(guò)夜培養(yǎng)的H9菌液W1 % (v/v)的比例接入MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)1她 后，8000gX10minX4°C離屯、，菌體用滅菌的生理鹽水洗涂Ξ次，并重懸于其中，121°C滅菌 15min。再將滅菌后的死菌體與過(guò)夜培養(yǎng)的H9活菌體分別W1 %的比例接入含終濃度為 lOOug/mL膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)24、48、7化后，8000gXlOminX4°C離屯、，得 上清液。W不添加菌體的含膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。
[0094] 取4mL上清液于25血的試管中，加入3血無(wú)水乙醇和0. 3血33% (w/v)的氨氧 化鐘溶液，混勻，60°C水浴15min;冷卻后，加入5mL正己燒，混勻，再加入3mL蒸饋水，混勻。 靜置15min，使溶液分層，取1血正己燒層于10血試管中，60°C水浴揮發(fā)盡溶劑，加顯色劑 2mU靜置lOmin后，加ImL濃硫酸，振蕩混勻，10-90min內(nèi)用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定其在 550nm波長(zhǎng)處的吸光值，W單獨(dú)加顯色劑和濃硫酸的處理組調(diào)零。測(cè)定結(jié)果如圖6所示。
[0095] 結(jié)果表明，無(wú)論是死菌體還是活菌體都有移除培養(yǎng)基中膽固醇的能力。顯著性分 析表明，活菌比死菌對(duì)膽固醇的降解率更高（P<〇. 05)。運(yùn)表明，冊(cè)菌株可能是通過(guò)吸附或 共沉淀機(jī)理來(lái)降解培養(yǎng)基中的膽固醇。
[0096] 實(shí)施例7 :副干酪乳桿菌（Xactobacillusparacasei)H9降血壓的活性檢測(cè)
[0097] 1、發(fā)酵上清液的制備：
[0098]將H9菌液W1% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接到滅菌的10% (w/v)的脫脂乳中活化2-3 次。然后再W4% (v/v)的接種量接入到10% (w/v)的脫脂乳中，37°C發(fā)酵24h得到發(fā)酵 乳。制備好的發(fā)酵乳，在7000gX4°C的條件下離屯、lOmin，獲得上清液，用5mol/L的化OH 調(diào)上清液的抑值為8. 3,再在7000gX4°C的條件下離屯、15min，得上清液，將上清液凍干，得 到含菌株代謝產(chǎn)物的上清液凍干粉。
[0099] 2、菌株代謝產(chǎn)物的活性檢測(cè) 陽(yáng)100] 精確稱(chēng)量適量的上清液凍干粉，并分別配成25、20、15、10、5mg/mL的樣品溶液。將 10μL樣液（無(wú)抑制的反應(yīng)中W蒸饋水代替）與100μL5mM的HHL溶液（用抑為8. 3的棚 酸緩沖溶液配制）混合，37°C共育lOmin，然后加入20μL0. 1U的ACE酶液（用抑為8. 3 的棚酸緩沖溶液配制），振蕩混勻后置于37°C恒溫水浴鍋中反應(yīng)比，然后加入125μL1Μ的 肥L溶液終止酶反應(yīng)。將反應(yīng)后的混合液過(guò)0. 22μm的濾膜，再上HPLC的C18柱。洗脫程 序?yàn)椋?0%的乙臘和80 %的0. 08 %的乙酸溶液，等度洗脫，流速為0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 228皿，洗脫時(shí)間為15min，進(jìn)樣量為25μL。ACE抑制活性的計(jì)算公式為： 陽(yáng)101]ACE抑制率（％ ) = [(a-b)/a]Χ100， 陽(yáng)102] 式中，a表示W(wǎng)蒸饋水代替樣品無(wú)抑制反應(yīng)的峰面積；b表示添加了樣品后的峰面 積，測(cè)定結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，ACE抑制活性隨菌株代謝產(chǎn)物濃度的增加而增高，經(jīng) 計(jì)算得菌株代謝產(chǎn)物ACE活性的1C日。值為11. 667mg/mL。 陽(yáng)1〇；3] 實(shí)施例8 :畐[J干酪乳桿菌（Xactobacillusparacasei)H9抗氧化的活性檢測(cè)
[0104] 1、完整細(xì)胞菌懸液和無(wú)細(xì)胞提取液的制備 陽(yáng)105]稱(chēng)取1.Og副干酪乳桿菌H9凍干菌粉（實(shí)驗(yàn)室-20°C保存）接種到lOOmLMRS液 體培養(yǎng)基中37Γ培養(yǎng)12h，再W2% (v/v)的接種量接種活化一代（37Γ培養(yǎng)化）?；罨瘍?代后的菌液再W2% (v/v)的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，分為A、B兩組，37°C靜置培 養(yǎng)1地。取A組培養(yǎng)液140血，4400gX4°C離屯、lOmin后去除上清液，用PBS0). 85%化C1， 2.68mMKCiaOmMNa2HP〇4，1.76mMKH2PO4)洗涂沉淀，用同樣的條件離心洗涂Ξ次。得到 的菌體分別懸浮至l〇9CFU/mL、l〇SCFU/mL、l〇7CFU/mL的濃度并振蕩均勻即得到菌懸液。
[0106] 取B組培養(yǎng)液140血，4400gX4°C離屯、lOmin收獲菌體，然后用去離子水洗涂細(xì)胞 兩次，超聲破碎細(xì)胞（200W，20s每次，間隔時(shí)間10s，重復(fù)20次）。細(xì)胞碎片在10000gX4°C 離屯、lOmin后除去，得到的上清液即為無(wú)細(xì)胞提取液。在制備細(xì)胞提取液之前，細(xì)胞總數(shù)分 別調(diào)整到l〇9CFU/mL、l〇SCFU/mL、l〇7CFU/mL。
[0107] 采取同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC4356,得到ATCC4356菌株的不同濃度的菌懸 液和無(wú)細(xì)胞提取液。并對(duì)兩株菌的上述各濃度下的菌懸液分成兩組，一組加熱煮沸5min作 滅活處理，另一組不處理，分別用于抗氧化能力測(cè)定。 陽(yáng)108] 2、胞外黏多糖的提取
[0109] 20血發(fā)酵乳中添加10mlL2% (w/v)的氯化鋼溶液，混合均勻，15000gX4°C離屯、 20min，取上清液，加入15% (m/v)Ξ氯乙酸除殘余蛋白質(zhì)，靜置lOmin左右，25000gX4°C 離屯、20min;棄去沉淀，將上清液抑值調(diào)為中性，加入兩倍體積無(wú)水乙醇，并將該混合液置 于4°C靜置過(guò)夜，6000gX4°C離屯、30min，此時(shí)得到的沉淀即為粗多糖。再使用真空干燥 機(jī)-40°C下干燥，到恒重為止。精確稱(chēng)量，將其配成濃度為25, 50, 100, 150, 200mg/L溶液，用 W測(cè)定DPPH自由基清除能力。
[0110] 3、抗氧化活性測(cè)定 陽(yáng)111] (l)DPPH自由基清除試驗(yàn)
[0112]取500μL完整細(xì)胞菌懸液和500μL無(wú)細(xì)胞提取液分別與500μL99. 5%的乙醇、 125μL含有0. 02 %DPPH的99. 5 %的乙醇混合均勻。混合物在黑暗中反應(yīng)60min后，在 SOOOgX4°C下離屯、5min得上清液，在517nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，采用BHT(0. 2mM)作為 陽(yáng)性對(duì)照。自由基清除率的計(jì)算方法如下： 陽(yáng)11引DPPH自由基清除率（％ ) = (A對(duì)照+A空白-A樣品）/A對(duì)照X100%
[0114] 對(duì)照組：500μL去離子水巧00μL99. 5 %的乙醇和125μL含有0. 02 %DPPH的 99. 5%的乙醇。
[0115] 樣品組：500μL待測(cè)樣品巧00μL99. 5 %的乙醇和125μL含有0. 02 %DPPH的 99. 5%的乙醇。
[0116] 空白組：500μL待測(cè)樣品（完整細(xì)胞菌懸液和無(wú)細(xì)胞提取液）巧00μL99. 5%的乙 醇和125μL99. 5%的乙醇。
[0117] 冊(cè)菌株自產(chǎn)的胞外多糖清除DPPH自由基能力的測(cè)定結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明， H9菌株自產(chǎn)的胞外多糖清除DPPH自由基的能力隨著胞外黏多糖濃度的升高呈上升趨勢(shì)。 VC和胞外多糖的濃度為200mg/L時(shí)，二者清除率分別達(dá)到70. 8 + 0. 6%和62.