Cs1-特異性嵌合抗原受體工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞的制作方法
【專利說明】CS1-特異性嵌合抗原受體工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年5月3日提交的美國臨時(shí)申請第61/819, 141號和2013年9 月有11日提交的美國臨時(shí)申請第61/876, 492號的權(quán)益，所述臨時(shí)申請由此通過引用整體 并入。
[0003] 背景
[0004] 多發(fā)性骨髓瘤（MM)是特征在于骨髓內(nèi)漿細(xì)胞（PC)的異常克隆擴(kuò)增的B細(xì)胞惡性 腫瘤，2012年在美國據(jù)估計(jì)有21，700例新病例和10, 710例MM造成的死亡被鑒定（Siegel R，等Cancer J Clin 2012 62:10 - 29)。在2013年，在美國估計(jì)有22, 350個(gè)個(gè)體被新診斷 為MM以及10, 710人將死于其，占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤死亡人數(shù)的20%。盡管使用已提 高總體存活率的蛋白酶體抑制劑和免疫調(diào)節(jié)藥物（Palumbo A，等Leukemia 2009 23:449 -456)，但MM仍然是無法治愈的惡性腫瘤（Podar K，等Leukemia 2009 23:10 - 24)，對于該 疾病迫切需要新型治療方法。
[0005] 概述
[0006] 本文公開了可與過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移一起用于靶向并殺死多發(fā)性骨髓瘤（MM)細(xì)胞的嵌 合抗原受體（CAR)多肽。細(xì)胞表面糖蛋白CSl高度和普遍地在骨髓瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)， 同時(shí)以極低水平在大多數(shù)免疫效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)。因此，公開的CAR多肽在胞外結(jié)構(gòu)域中含 有可結(jié)合表達(dá)CSl的MM細(xì)胞的抗CSl結(jié)合劑。與其它CAR -樣，公開的多肽還可含有跨膜 結(jié)構(gòu)域和能夠激活免疫效應(yīng)細(xì)胞的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。例如，該胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可含有細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和任選的共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域。
[0007] 抗CSl結(jié)合劑在某些實(shí)施方案中是特異性結(jié)合CSl的抗體片段或抗原結(jié)合片段。 例如，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是特異性結(jié)合CSl的抗體的Fab或單鏈可變片段（scFv)?？笴Sl 結(jié)合劑在某些實(shí)施方案中是特異性結(jié)合CSl的適體。例如，抗CSl結(jié)合劑可以是基于其結(jié) 合CSl的能力從隨機(jī)序列池中選擇的肽適體?？笴Sl結(jié)合劑還可以是CSl的天然配體、或 其變體和/或其能夠結(jié)合CSl的片段。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是⑶3 ζ (⑶3 ζ )信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，并 且共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)包含CD28、4-1BB的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，或其組合。在某些情況下，共刺激信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或共刺激分子的1、2、3或4個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
[0009] 還公開了編碼公開的CAR多肽的分離的核酸序列、包括這些分離的核酸的載體， 以及含有這些載體的細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞可以是選自由以下組成的組的免疫效應(yīng)細(xì)胞：T 細(xì)胞、自然殺傷（NK)細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案 中，當(dāng)CRA的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合CSl時(shí)，所述細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤免疫。
[0010] 還公開了在具有多發(fā)性骨髓瘤（MM)的受試者中提供抗腫瘤免疫的方法，該方法 包括向受試者施用有效量的利用公開的CSl特異性CAR遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)闡述于附圖和以下說明中。根據(jù)說明和附圖 以及權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。
[0012] 附圖概述
[0013] 圖IA至IC顯示CSl特異性CAR的產(chǎn)生及其在CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞中的表達(dá)。圖 IA是含有連接于⑶28和⑶3 ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的針對CSl的scFv的Pinco-CSl-CAR逆轉(zhuǎn)錄 病毒構(gòu)建體的示意圖。LTR，長末端重復(fù)序列；SP，信號肽；VH，可變H鏈；L，接頭；VL，可變L 鏈。在圖IB中，用⑶3和⑶28珠?；罨疨BMC (外周血單核細(xì)胞），并用Pinco-CSl-CAR或 Pinco構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。分選GFP陽性細(xì)胞，并在還原條件下使用抗人CD3G第一抗體將細(xì) 胞裂解物經(jīng)歷免疫印跡分析。在圖IC中，用生物素標(biāo)記的山羊抗-小鼠 Fab特異性抗體或 同種型匹配的對照抗體對來自健康供體的模擬物1或CSl-CARl轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞進(jìn)行染色，隨 后進(jìn)行鏈霉親和素和CD3抗體染色。
[0014] 圖2A至2C顯示CSl-重定向T細(xì)胞響應(yīng)于表達(dá)CSl的骨髓瘤細(xì)胞系比模擬T細(xì) 胞分泌更多的IFN-γ和IL-2。圖2A顯示骨髓瘤細(xì)胞系表面上的CSl表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù) 分析。用PE綴合的抗CSlmAb抗體（實(shí)線）或同種型匹配的對照抗體（虛線）對指示的4 個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行染色。圖2Β和2C是顯示單獨(dú)培養(yǎng)（無靶標(biāo)）或利用相等數(shù)量的表 達(dá)不同水平CSl的骨髓瘤細(xì)胞刺激24小時(shí)的模擬物或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的健康供體的T細(xì)胞 (2Χ IO5個(gè)）中的 IFN-γ (圖 2Β，ng/ml)和 IL-2(圖 2C，pg/ml)分泌的柱狀圖。
[0015] 圖3A至3D顯示CSl-重定向T細(xì)胞優(yōu)先消除明顯表達(dá)CSl蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。 在圖3A中，以指定的E/T比將 51Cr標(biāo)記的NCI-H929、頂9、MM.lS和RPMI-8226 骨髓瘤細(xì)胞 (5 X IO3個(gè)）與模擬物或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)，并測量靶裂解（51Cr釋放）。 在圖3B中，在與NCI-H929細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)后，模擬物-或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞上的脫 粒標(biāo)志物CD107a和T細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69的表達(dá)用流式細(xì)胞術(shù)來評估。與模擬物轉(zhuǎn)導(dǎo)的 T細(xì)胞相比，CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞響應(yīng)于表達(dá)CSl的NCI-H929細(xì)胞表現(xiàn)更優(yōu)的脫粒和更 高的T細(xì)胞活化。在圖3C中，對模擬物-和CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞進(jìn)行透化，以利用對于 顆粒酶B和穿孔素是特異的mAb進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
[0016] 圖4A至4D顯示CSl在麗細(xì)胞中的異位過表達(dá)在被CSl-CART細(xì)胞識別后觸發(fā) 增強(qiáng)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌。圖4A顯示過表達(dá)CS1(RPMI-8226_CS1，粗實(shí)線）或空 載體對照（RPMI-8226-PCDH，淺色實(shí)線）的RPMI-8226細(xì)胞的表面上的CSl蛋白或IgG同 種型對照（虛線）的流式細(xì)胞術(shù)染色。圖4B是顯示模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì) 胞針對RPMI-8226 - CSl和RPMI-8226 - P⑶H細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖。以指定的E/T比將 RPMI-8226-CS1和RPMI-8226-PCDH細(xì)胞與模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞一起孵育4 小時(shí)，并且使用標(biāo)準(zhǔn) 51Cr釋放測定來測定特異性裂解。圖4C和4D是顯示單獨(dú)培養(yǎng)的或用 相等數(shù)量的RPMI-8226-CS1或RPMI-8226-PCDH細(xì)胞刺激的模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T 細(xì)胞（IX IO5個(gè)）中的IFN-γ (圖4C，pg/ml)和幾-2(圖4D，pg/ml)的分泌的柱狀圖。
[0017] 圖5A至顯示CSl-CAR T細(xì)胞離體特異性識別并消除表達(dá)CSl的人原代骨髓瘤 細(xì)胞。圖5A顯示用抗-⑶3和抗-⑶28珠粒活化的，用Pinco - CSl - CAR或Pinco構(gòu)建體 (模擬物）轉(zhuǎn)導(dǎo)的并用抗-小鼠 Fab和抗-人CD3抗體染色的來自具有麗的患者的PBMC 的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。顯示來自具有相似數(shù)據(jù)的4個(gè)患者之一的結(jié)果。圖5B顯示從具有MM 的患者新鮮分離的CD138+骨髓瘤細(xì)胞中的CSl蛋白的流式細(xì)胞術(shù)染色。顯示來自10個(gè)具 有相似數(shù)據(jù)的患者中的3個(gè)的結(jié)果。圖5C是一系列顯示以指定的E/T比與（A)中的自體 模擬物-或CSl - CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)的（B)中的CD138+骨髓瘤細(xì)胞的特異 性裂解（51Cr釋放測定）的圖。圖f5D是顯示除E/T比為1:1并且孵育時(shí)間被延長至24小 時(shí)外如（C)中一樣處理的細(xì)胞的IFN-γ分泌（pg/ml)的柱狀圖。
[0018] 圖6A和6B顯示CSl-重定向T細(xì)胞在原位MM. IS異種移植小鼠模型中抑制腫瘤 生長和延長小鼠存活期。圖6A是來自每一個(gè)指定組的5只代表性荷MM. IS腫瘤小鼠的背 部和腹部的一系列生物發(fā)光圖像。用8X IO6個(gè)表達(dá)熒光素酶的MM. IS細(xì)胞靜脈內(nèi)接種NSG 小鼠（第0天）。在接種后第7和14天，每一只小鼠接受PBS (安慰劑對照組）、10 X IO6個(gè) 模擬T細(xì)胞（模擬物對照組）或CSl-CAR T細(xì)胞（CAR處理組）。圖6B顯示用PBS、模擬T 細(xì)胞或CSl-CAR T細(xì)胞處理的荷MM. IS小鼠的卡普蘭-邁耶（Kaplan-Meier)存活曲線。
[0019] 圖7A至7E顯示表達(dá)CSl的293T轉(zhuǎn)化細(xì)胞容易被CSl-CAR T細(xì)胞識別并裂解。圖 7A顯示，293T親代細(xì)胞對于CSl表達(dá)呈陰性。用PE綴合的抗CSl mAb抗體（實(shí)線）或同 種型匹配的對照Ab (虛線）對293T細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。圖7B顯 示過表達(dá)CS1 (293T-CS1，深色粗實(shí)線）或空載體（293T-PCDH，灰色粗實(shí)線）的293T細(xì)胞的 表面上的CSl蛋白的流式細(xì)胞術(shù)染色。用IgG同種型（虛線）染色的表達(dá)CSl的293T細(xì) 胞用作非特異性結(jié)合對照。圖7C顯示模擬物-或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞針對293T-CS1和 293T-PCDH細(xì)胞的細(xì)胞毒性。以指定的E/T比將293T-CS1和293T-PCDH細(xì)胞與模擬物-或 CS I -CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞一起孵育4小時(shí)，并使用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放測定來測定特異性裂解。圖7D 和7E是顯示單獨(dú)培養(yǎng)的或利用293T-CS1或293T-PCDH細(xì)胞刺激的模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn) 導(dǎo)的T細(xì)胞中的IFN-γ分泌（圖7D，pg/ml)或IL-2分泌（圖7E，pg/ml)的柱狀圖。
[0020] 圖8A和8B顯示CD4+和CD8 +CS1-CAR T細(xì)胞響應(yīng)于骨髓瘤細(xì)胞而被活化。在圖8A 中，單獨(dú)培養(yǎng)模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞或用NCI-H929和MM. IS細(xì)胞刺激所述細(xì) 胞12小時(shí)，隨后通過流式細(xì)胞術(shù)評估⑶3和⑶8的表面表達(dá)，以及細(xì)胞內(nèi)IFN- γ。曲線是 針對CD3+淋巴細(xì)胞進(jìn)行門控。顯示具有相似結(jié)果的3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。在圖 8Β中，單獨(dú)培養(yǎng)或用NCI-H929和MM. IS細(xì)胞刺激模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，進(jìn)行 4小時(shí)，并且通過流式細(xì)胞術(shù)評估⑶3、⑶8和脫粒標(biāo)記物⑶107a的表達(dá)。曲線是針對活的 CD3+淋巴細(xì)胞進(jìn)行門控。顯示了具有相似結(jié)果的3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。
[0021] 圖9A和9B顯示CSl-重定向T細(xì)胞在原位頂-9異種移植小鼠模型中抑制腫瘤 生長和延長小鼠存活期。圖9A顯示來自每一個(gè)指定組的5只代表性荷頂9腫瘤小鼠的背 部和腹部生物發(fā)光圖像。用5X IO5個(gè)表達(dá)熒光素酶的頂9細(xì)胞i. V.接種NSG小鼠（第0 天）。在接種后第7和21天，每一只小鼠接受PBS (安慰劑對照組）、10 X IO6個(gè)模擬T細(xì)胞 (模擬物對照組）或CSl-CAR T細(xì)胞（CAR處理組）。白色十字" + "代表在成像時(shí)PBS處理 組中死于麗疾病的小鼠。圖9B是用PBS、模擬T細(xì)胞或CSl-CAR T細(xì)胞處理的荷頂9小鼠 的卡普蘭-邁耶存活曲線。
[0022] 圖IOA至IOC顯示CSl-CAR T細(xì)胞在植入了 MM. IS細(xì)胞的NSG小鼠的骨髓（BM) 中保留和增殖。在第0天用8X IO6個(gè)MM. IS細(xì)胞接種NSG小鼠，并在第7天用IOX 10 6個(gè) CSl-CAR T細(xì)胞處理小鼠。在第20天，用I. 5mg在DPBS溶液中的Brdu i. p.注射小鼠。第 二天處死小鼠，并分離BM細(xì)胞以用于按照制造商的方案利用CD45和CD3人特異性抗體和/ 或抗Brdu抗體（BD Biosciences)進(jìn)行表面染色。圖IOA顯示了代表性小鼠的BM中的人T 細(xì)胞（⑶457⑶3+)的百分比。在圖IOB中，用IgG(左圖）或抗Fab Ab (右圖）對被門控的 人T細(xì)胞（CD45+/CD3+)進(jìn)行染色，以驗(yàn)證CAR表達(dá)。在圖IOC中，用IgG(左圖）或抗Brdu Ab對門控的人T細(xì)胞（⑶457⑶3 +)進(jìn)行染色，并且顯示摻入了 Brdu的T細(xì)胞的百分比。
[0023] 圖IlA至IlC顯示展示低水平的針對原代NK和T細(xì)胞的反應(yīng)性的CSl-CAR T細(xì) 胞。以指定的效/靶（E/T)比將51Cr標(biāo)記的人原代NK和T細(xì)胞（5 X IO3個(gè)）與模擬物-或 CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)，并測量NK細(xì)胞（圖11A)和T細(xì)胞（圖11B)的靶裂 解（51Cr釋放）。圖IlC是顯示單獨(dú)培養(yǎng)的或用原代NK細(xì)胞、T細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞刺激24 小時(shí)的模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的IFN- γ分泌的柱狀圖。
[0024] 圖12顯示原代NK細(xì)胞或T細(xì)胞在CSl-CAR T細(xì)胞中不觸發(fā)表觀活化誘導(dǎo)的細(xì)胞 死亡（AICD)。將原代NK細(xì)胞和T細(xì)胞與相等數(shù)量的51Cr標(biāo)記的模擬物-或CSl-CAR-轉(zhuǎn) 導(dǎo)的T細(xì)胞一起孵育12小時(shí)。隨后使用 51Cr釋放測定來測定特異性裂解。
[0025] 圖13Α至13C顯示CSl特異性CAR的產(chǎn)生和其在CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞中的表達(dá)。圖 13A是CSl-CAR慢病毒構(gòu)建體的示意圖。圖13B顯示使用⑶3 ζ特異性Ab的CSl-CAR表達(dá) 的免疫印跡分析。所示數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的3個(gè)實(shí)驗(yàn)。圖13C顯示在用抗myc抗體或 IgGl同種型對照對細(xì)胞染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析的利用CSl-CAR構(gòu)建體或空載體（EV) 轉(zhuǎn)導(dǎo)的FACS分選的NK-92和NKL細(xì)胞的表面上的嵌合CSlscFv的表達(dá)。所示數(shù)據(jù)代表具 有相似結(jié)果的3次實(shí)驗(yàn)。
[0026] 圖14A至14D顯示CSl-CAR NK細(xì)胞消除CSl+而非CS廠MM細(xì)胞。圖14A顯示在 用抗-CSl mAb或同種型匹配的對照抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的L363、 頂9和U266麗細(xì)胞的表面上的CSl表達(dá)的測定。圖14B至13D顯示使用標(biāo)準(zhǔn) 51Cr釋放測 定的模擬物轉(zhuǎn)導(dǎo)的或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92或NKL細(xì)胞針對頂9 (圖14B)、L363 (圖14C) 和U266(圖13D)細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。NK-92-EV和NKL-EV分別表示空載體（EV)對照轉(zhuǎn) 導(dǎo)的NK-92和NKL細(xì)胞。NK-92-CS1-CAR和NKL-CS1-CAR分別表示利用CSl-CAR構(gòu)建體對 NK-92和NKL細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。*和#分別表示P〈0. 05和P〈0. 01。
[0027] 圖15A至15C顯示CSl+MM細(xì)胞的識別誘導(dǎo)比來自對照NK細(xì)胞強(qiáng)的來自CSl-CAR NK細(xì)胞的反應(yīng)。圖15A至15C是顯示與相等數(shù)量的頂9(圖15A)、L363(圖15B)或U266(圖 15C)骨髓瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)的模擬物-轉(zhuǎn)導(dǎo)的或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92或NKL效應(yīng)細(xì) 胞的IFN-γ分泌的柱狀圖。NK-92-EV和NKL-EV分別表示空載體（EV)對照轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92 和NKL細(xì)胞。NK-92-CS1-CAR和NKL-CS1-CAR分別表示利用CSl-CAR構(gòu)建體進(jìn)行的NK-92 和NKL細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0028] 圖16A至16C顯示NK-92-CS1-CAR細(xì)胞的增強(qiáng)的靶識別依賴于CSl在MM細(xì)胞上的 表達(dá)。圖16A顯示過表達(dá)CSl (U266-CS1，粗實(shí)線）或空載體對照（U266-載體，淺色實(shí)線） 的U266細(xì)胞表面上的CSl蛋白或IgG對照（虛線）的流式細(xì)胞術(shù)染色。圖16B顯示模擬 物-或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92細(xì)胞（分別為NK-92-EV和NK-92-CS1-CAR)針對U266載體 和U266-CS1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。以不同的效/靶（E/T)比將U266-載體或U266-CS1細(xì)胞與 NK-92-CS1-CAR或NK-92-EV細(xì)胞一起孵育4小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放測定來測定特異性 裂解。*表示P〈〇. 05。（c)將NK-92-CS1-CAR或NK-92-EV細(xì)胞與相等數(shù)量的U266-載體或 U266-CS1骨髓瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。隨后收獲上清液以使用ELISA測量IFN- γ分泌。
[0029] 圖17Α至17C顯示CSl-CAR修飾的NK細(xì)胞的表型表征。在圖17Α中，單獨(dú)培 養(yǎng)或用頂9ΜΜ細(xì)胞培養(yǎng)模擬物-或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的ΝΚ-92細(xì)胞（分別為NK-92-EV和 NK-92-CS1-CAR)，進(jìn)行4小時(shí)。在用對應(yīng)的mAb染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)評估ΝΚρ30、ΝΚρ46、 NKG2C、NKG2D、CD69和HLA-DR的表面表達(dá)，并且記錄平均熒光強(qiáng)度（MFI)。*表示Ρ〈0. 05。 在圖17B中，對NK-92-EV和NK-92-CS1-CAR細(xì)胞進(jìn)行透化，以利用對于穿孔素和顆粒酶B 是特異的mAb進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。虛線代表利用對照IgG抗體 對NK-92-EV對照細(xì)胞進(jìn)行染色，粗實(shí)線表示利用穿孔素或顆粒酶B抗體對NK-92-CS1-CAR 細(xì)胞進(jìn)行染色，淺色實(shí)線表示利用穿孔素或顆粒酶B抗體對NK-92-EV對照細(xì)胞進(jìn)行染色。 圖17C顯示圖17B顯示的MFI的直方圖。*表示P〈0. 05。
[0030] 圖18A至18C顯示CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92細(xì)胞增強(qiáng)原代人骨髓瘤細(xì)胞的殺傷。圖 18A顯示CSl蛋白或IgG同種型對照的流式細(xì)胞術(shù)染色，表明⑶138 +原代骨髓瘤細(xì)胞高度 表達(dá)CSl。空心和實(shí)心直方圖表示分別利用同種型匹配的對照抗體和抗CSl抗體進(jìn)行的染 色。所顯示的數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的6個(gè)患者樣品中的兩個(gè)。圖18B顯示使用標(biāo)準(zhǔn) 51Cr 釋放測定的模擬物-或CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92細(xì)胞（分別為NK-92-EV和NK-92-CS1-CAR) 針對來自具有相似結(jié)果的6個(gè)患者中的3個(gè)的CD138 +原代骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。E/T 表示效/靶比。*表示Ρ〈〇· 05。圖18C顯示以5:1的E/T比與NK-92-EV或NK-92-CS1-CAR 細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)的CD138+原代骨髓瘤細(xì)胞的IFN-γ分泌。所示的數(shù)據(jù)代表具有相似 結(jié)果的3個(gè)患者樣品中的一個(gè)。
[0031] 圖19Α至19D顯示CSl-CAR NK細(xì)胞在體內(nèi)抑制原位人麗細(xì)胞的生長，并且延長 荷MM小鼠的存活期。圖19Α(左）是顯示在用頂9細(xì)胞i.v.注射后，一只表現(xiàn)后腿癱瘓的 代表性小鼠的腰椎骨病變中的人頂9細(xì)胞的大量浸潤（通過蘇木精-伊紅（H&E)染色檢測 的）的圖像。圖19A(右）顯示利用抗人CD138mAb對小鼠腰椎骨病變的免疫組織化學(xué)染 色。圖19B顯示荷頂9腫瘤的小鼠的背部生物發(fā)光成像。利用5X IO5個(gè)表達(dá)熒光素酶的 頂9細(xì)胞經(jīng)由尾靜脈注射接種NSG小鼠（第0天）。接種后7天，用模擬物轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92細(xì) 胞（NK-9