0· 39mmol)、四（三苯基膦）把（30mg，0. 026mmol)、1N碳酸鈉（0· 4ml),氮?dú)庵脫Q，升溫 至85°C攪拌，反應(yīng)至TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。加入水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥， 減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到[1-(4-氟-苯基）-2-甲氧基-乙 基]-{6-[4-(4-甲基-哌嗪-1-甲基）-苯基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-基}-胺（70mg， 白色固體），收率：54. 7%。MSm/z(ESI) :492. 65[M+1]
[0242]^NMR(400Hz,DMS〇-d6) : 8. 36 (s, 1H), 8. 28 (d, 1H), 7. 77 (t, 3H), 7. 48 (m, 4H), 7. 13 (t, 2H),5. 62 (m, 1H),3. 75 (t, 1H),3. 58 (m, 1H),3. 48 (s, 2H),3. 29 (s, 3H),3. 37 (s, 8H),2. 1-5 (s, 3H).
[0243]實(shí)施例17
[0245] 第一步：
[0246] 將 2- (6-溴-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-氨基）-2-苯基-乙醇（767mg，2. 19mmol) 溶解于N，N-二甲基甲酰胺（15ml)中，向里依次加入4-[4-(4,4,5,5_四甲基_[1，3,2]二 雜氧戊硼烷-2-基）-芐基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯（970mg，2. 41mmol)、四（三苯基膦）鈀 (253mg，0. 219mmol)、1N碳酸鈉（5ml)，氮?dú)庵脫Q，升溫至85°C攪拌，反應(yīng)至TLC監(jiān)測原料反 應(yīng)完全。加入水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留 物，得到4-{4-[4-(2-羥基-1-苯基-乙胺）-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基]-芐基}-哌 啶-1-甲酸叔丁酯（1.lg，黃色固體），收率：92%。
[0247] 第二步：
[0248] 將4- {4- [4- (2-羥基-1-苯基-乙胺）-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基]-芐基}-哌 陡-1-甲酸叔丁酯（163mg，0.3mmol)溶解于四氫呋喃（10ml)中，依次加入醋酸酐（153mg， 1. 5mmol)、三乙胺（152mg，l. 5mmol)，升溫至30°C攪拌，反應(yīng)至TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。減壓 濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到4- {4- [4- (2-乙酰氧基-1-苯基-乙胺）-噻吩 并[3,2-d]嘧啶-6-基]-芐基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯（130mg，黃色固體），收率：73.9%。
[0249] 第三步：
[0250] 將4-{4-[4-(2_乙酰氧基-1-苯基-乙胺）_噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基]-芐 基卜哌陡-1-甲酸叔丁酯（130mg，0. 22mmol)溶解于鹽酸的乙酸乙酯溶液（2N)，室溫?cái)嚢瑁?至TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。減壓濃縮，加入水，冰浴下用2N氫氧化鈉溶液調(diào)PH至12,乙酸 乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到乙酸-2-苯 基-2-[6-(4-哌啶-4-甲基-苯基）-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-氨基]-乙酯（20mg，淡黃色 固體），收率：28%。MSm/z(ESI) :487·65[Μ+1]
[0251] ^NMR (400Hz, DMS〇-d6) : 8. 39 (s, 1H), 8. 32 (d, 1H),7. 83 (t, 3H),7. 49 (d, 4H),7. 32 (m, 2H), 7. 24 (m, 1H), 5. 72 (m, 1H), 4. 37 (d, 2H), 3. 25 (m, 2H), 2. 78 (m, 4H), L 99 (s, 3H), 1. 5-5~1. 30(m, 5H).
[0252] 實(shí)施例18
[0253]
[0254] 將2- (6-溴-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-氨基）-2-苯基-乙醇（350mg，lmmol)溶解 于N，N-二甲基甲酰胺（10ml)中，向里依次加入1-甲基-4-[4-(4, 4, 5, 5-四甲基-[1，3, 2] 二雜氧戊硼燒-2-基）-芐基]-哌嗪（348mg，1.lmmol)、四（三苯基膦）把（58mg， 0. 05mmol)、IN碳酸鈉（2ml)，氮?dú)庵脫Q，升溫至85°C攪拌，反應(yīng)至TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。 加入水，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到 2-{6-[4-(4-甲基-哌嗪-1-甲基）-苯基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-氨基}-2-苯基-乙 醇（287mg，黃色固體），收率：62.4%。
[0255] 將2- {6- [4- (4-甲基-哌嗪-1-甲基）-苯基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-氨 基}-2_苯基-乙醇（143mg，0.3mmol)溶解于四氫呋喃（10ml)中，依次加入醋酸酐（153mg, 1. 5mmol)、三乙胺（152mg，l. 5mmol)，升溫至30°C攪拌，反應(yīng)至TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。減壓 濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到乙酸-2-{6-[4-(4-甲基-哌嗪-1-甲基）-苯 基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-氨基}-2_苯基-乙酯（140mg，黃色固體），收率：89. 7%。 MSm/z(ESI) :502. 76[M+1]
[0256] ^NMR(400Hz,DMS〇-d6) : 8. 39 (s, 1H), 8. 32 (d, 1H), 7. 83 (t, 3H), 7. 49 (d, 4H), 7. 32 (m, 2H),7. 24 (m, 1H),5. 68 (m, 1H),3. 80 (m, 1H),3. 62 (m, 1H),3. 58 (s, 2H),2. 78 (m, 4H),2. 5-5 (m, 4H),2. 46 (s, 3H),1. 99 (s, 3H).
[0257] 實(shí)施例19
[0258]
[0259] 將2- {6- [6- (4-甲基-哌嗪-1-基）-吡啶-3-基]-噻吩[3, 2-d]嘧啶-4-基 胺}-2_苯基-乙醇（134mg，(X3mmol)溶解于四氫呋喃（10ml)中，依次加入醋酸酐（153mg, 1. 5mmol)、三乙胺（152mg，l. 5mmol)，升溫至30°C攪拌，反應(yīng)至TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。 減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到（S)-乙酸-2-{6-[6-(4-甲基-哌 嗪-1-基）_吡啶-3-基]-噻吩[3,2-d]嘧啶-4-基胺}-2_苯基-乙酯（131mg，黃色固 體），收率：90 %。MSm/z(ESI) : 489. 6 [M+1]
[0260]iHNMRGOOHz，DMS0-d6) :8. 60 (d，1H)，8· 35 (s，1H)，8· 08 (d，1H)，8· 01 (dd，1H)，7· 66 (s, 1H), 7. 46 (d, 2H), 7. 29 (m, 3H), 6. 96 (d, 1H), 5. 44 (m, 1H), 3. 78 (m, 2H), 3. 62 (m, 4H), 2. 41 (m, 4H),2. 23 (s, 3H),2. 05 (s, 3H).
[0261] 實(shí)施例20
[0262]
[0263] 將2- {6- [6- (4-乙基-哌嗪-1-基）-吡啶-3-基]-噻吩[3, 2-d]嘧啶-4-基 胺}-2_苯基-乙醇（138mg，0.3mmol)溶解于四氫呋喃（10ml)中，依次加入醋酸酐（153mg， 1. 5mmol)、三乙胺（152mg，l. 5mmol)，升溫至30°C攪拌，反應(yīng)至TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。 減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到（S)-乙酸-2-{6-[6-(4-乙基-哌 嗪-1-基）_吡啶-3-基]-噻吩[3, 2-d]嘧啶-4-基胺}-2_苯基-乙酯（129mg，黃色固 體），收率：86%。MSm/z(ESI) : 503. 6 [M+1]
[0264] ^NMRC^OHz^MSO-dg) ：8. 60(s, 1H),8. 34(s, 1H), 8. 09 (d, 1H),8. 01(d, 1H), 7. 66 ( s, 1H), 7. 40 (d, 2H), 7. 24 (m, 3H), 6. 98 (d, 1H), 5. 44 (m, 1H), 3. 79 (m, 2H), 3. 64 (m, 4H), 2. 47 ( m, 6H), 2. 07 (s, 3H), 1. 07 (t, 3H).
[0265] 實(shí)施例21
[0266]
[0267] 將2-苯基-2- [6- (4-哌嗪-1-甲基-苯基）-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-氨 基]-乙醇（250mg，0. 56mmol)溶解于甲醇（10ml)中，加入醋酸酐（57mg，0. 56mmol),室 溫?cái)嚢瑁罷LC監(jiān)測原料反應(yīng)完全。減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘留物，得到 (S) -1- (4- {4-[4- (2-羥基-1-苯基-乙胺）-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基]-芐基}-哌 嗪-1-基）_ 乙酮（200mg，白色固體），收率：73· 26%。MSm/z(ESI) :488. 65[M+1]
[0268] ^NMRC^OHz,DMS0-d6) ：8. 37 (s, 1H), 8. 20 (d, 1H), 7. 82 (t, 3H), 7. 45 (t, 4H), 7. 32 ( t, 2H), 7. 22 (t, 1H), 5. 44 (m, 1H), 4. 99 (t, 1H), 3. 74 (m, 1H), 3. 56 (s, 2H), 3. 45 (d, 4H), 2. 33- 2. 40 (m, 4H),L99 (s, 3H).
[0269] 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0270]1、酪氨酸激酶EGFR酶活抑制IC5。評價(jià)實(shí)驗(yàn)
[0271]本實(shí)驗(yàn)采用CISBI0 公司的HTRFkinEASETKkit(Cat. 62TK0PEB,Cisbio)試劑盒 進(jìn)行候選化合物對EGFR酶活性抑制效果的測試，測試方法按照廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。 大致的實(shí)驗(yàn)流程如下：在1〇μL的酶反應(yīng)體系中，加入酶反應(yīng)底物TK-biotin，ATP，EGFR 酶（Cat.PV3872，Invitrogen)以及一定濃度的化合物在 50mMΗ印es/Na0HpH7.5，10mM MgCl2,ImMEGTA，0. 01%BRIJ-35的酶反應(yīng)緩沖溶液中室溫反應(yīng)30分鐘。待測化合物的每個(gè) 篩選濃度取復(fù)孔測試，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)不加EGFR激酶的陰性對照孔和不加化合物的陽性對 照孔。反應(yīng)完成后，向所有反應(yīng)孔中加入1〇μ1經(jīng)50mMΗ印es/Na0HpH7·0,0· 1%BSA，0.8M KF，20mMEDTA稀釋的Streptavidin_XL665和TKantibodyeuropiumcryptate(l:100)混 合檢測液，室溫反應(yīng)lh后，用 2104.E_nVi.siar#MultilabelReader(Perkinelmer)儀器檢 測熒光信號（320nm刺激，665nm，615nm發(fā)射）。通過全活性孔和背景信號孔計(jì)算出每個(gè)孔 的抑制率，復(fù)孔取平均值，同時(shí)用專業(yè)的畫圖分析軟件GraphPadPRISM5. 0對每個(gè)待測化 合物進(jìn)行半數(shù)抑制活性（IC50)的擬合。
[0272]2、HER2激酶活性測試方法
[0273]本實(shí)驗(yàn)采用CISBI0 公司的HTRFkinEASETKkit(Cat. 62TK0PEB，Cisbio)試劑盒 進(jìn)行候選化合物對HER2酶活性抑制效果的測試，測試方法按照廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。 大致的實(shí)驗(yàn)流程如下：在1〇μL的酶反應(yīng)體系中，加入酶反應(yīng)底物TK-biotin，ATP，HER2酶 (Cat:PV3366,Invitrogen)以及一定濃度的化合物在 50mMHepes/NaOHpH7. 5, 5mMMgCl2， ImMDTT，50nMSEB，lmMMnC12的酶反應(yīng)緩沖溶液中室溫反應(yīng)30分鐘。待測化合物的每個(gè) 篩選濃度取復(fù)孔測試，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)不加HER2酶的陰性對照孔和不加化合物的陽性對照 孔。反應(yīng)完成后，向所有反應(yīng)孔中加入1〇μ1經(jīng)50mMΗ印es/NaOHpH7. 0,0. 1%BSA，0. 8M KF，20mMEDTA稀釋的Streptavidin_XL665和TKantibodyeuropiumcryptate(l:100)混 合檢測液，室溫反應(yīng)lh后，用 2104EnVisioi#MultilabelReader(Perkinelmer)儀器檢 測熒光信號（320nm刺激，665nm，615nm發(fā)射）。通過全活性孔和背景信號孔計(jì)算出每個(gè)孔 的抑制率，復(fù)孔取平均值，同時(shí)用專業(yè)的畫圖分析軟件GraphPadPRISM5. 0對每個(gè)待測化 合物進(jìn)行半數(shù)抑制活性（IC50)的擬合。
[0274] 3、通過CCK-8檢測試劑盒檢測化合物對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431的細(xì)胞毒 性抑制IC5。值。
[0275] 細(xì)胞株：
[0276]A431人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞庫）
[0277] 試劑和耗材：
[0278]CellCountingKit~8(Cat#CK04-13,Dojindo)
[0279] 96 孔培養(yǎng)板（Cat#3599,CorningCostar)
[0280]胎牛血清（Cat#10099_141，GIBC0)
[0281]培養(yǎng)基（Invitrogen)
[0282]臺(tái)式酶標(biāo)儀SpectraMaxM5MicroplateReader(MolecularDevices)
[0283] 培養(yǎng)基的配制
[0284]
[0285] 化合物的制備：用DMS0稀釋化合物使終濃度為10mM。
[0286] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0287]a)收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，
[0288] b)調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度，接種96孔板，每孔接種100 μ 1細(xì)胞懸液。
[0289]c)細(xì)胞在37°C，100%相對濕度，5%C02培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
[0290]IC5。實(shí)驗(yàn)
[0291]a)收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適 濃度（依照細(xì)胞密度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果確定），接種96