孔板，每孔加100μ1細胞懸液。細胞在 37°C，100%相對濕度，5%C02培養(yǎng)箱中孵育24小時。
[0292]b)用培養(yǎng)基將待測化合物稀釋至500μΜ后梯度稀釋8次。按25μ1/孔加入細 胞?；衔镒饔媒K濃度從100μΜ至0μΜ，5倍梯度稀釋，共10個濃度點。
[0293]c)細胞置于37°C，100%相對濕度，5%C02培養(yǎng)箱中孵育72小時。
[0294] d)吸棄培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基置于37°C培養(yǎng)箱中孵育2-4小 時。
[0295] e)輕輕震蕩后在SpectraMaxM5MicroplateReader上測定450nm波長處的吸光 度，以650nm處吸光度作為參比，計算抑制率。
[0296] 數(shù)據(jù)處理
[0297] 按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率％ = [(4_AS)/ (Ac-Ab)]X100%
[0298] As:樣品的0A(細胞+CCK-8+待測化合物）
[0299] Ac:陰性對照的0A(細胞+CCK_8+DMS0)
[0300] Ab:陽性對照的0A(培養(yǎng)基+CCK_8+DMS0)
[0301] 采用軟件GraphpadPrism5擬合IC50曲線并計算出IC5。值。
[0302] 表2部分實施例化合物對酪氨酸激酶EGFR、HER2酶活抑制及A431細胞實驗結(jié)果
[0303]
[0304] "一"表示活性未測試
[0305] 上述生物活性結(jié)果表明，本發(fā)明包括的部分化合物均具有較好的酪氨酸激酶EGFR 抑制活性以及HER2抑制活性，而且在細胞水平上實施例1、4、21也顯示出明顯的抑制A431 細胞活性。
[0306] 單次靜脈或口服分別給予實施例1 (代號⑶DD-000261)和實施例21 (代號 CDDD-000257)在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究
[0307]本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^單次靜脈（IV)及口服（P0)給予SD大鼠供試品有效量的實施 例21化合物和實施例1化合物，于不同時間點采集血樣，LC/MS/MS測定給予供試品后大鼠 血漿中供試品的濃度并計算相關(guān)參數(shù)和生物利用度。
[0308] 供試品的配制
[0309] 供試品，實施例21化合物和實施例1化合物溶于注射用水中，得到濃度均為5mg/ mL的溶液，用于靜脈和灌胃給藥。
[0310] 動物分配
[0311] 從上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購入大約6-8周齡的20只雄性SD大鼠 (雄性體重130_150g)，12只動物用于試驗。在靜脈和口服給藥前，所有組別動物禁食過夜 (10-14小時），給藥4小時后給食。
[0312] 給藥
[0313] 供試品實施例21化合物和實施例1化合物通過靜脈或口服單次給藥。給藥信息 見下表
[0316] 樣品采集及處理
[0317]第 1-8 組動物采血時間點為：給藥前，5min，15min，30min，lh，2h，4h，6h，8h和 24h。 每只動物每次經(jīng)心臟穿刺采約〇. 25mL血液，K2EDTA抗凝。血液樣本采集后置于冰上，離心 分離血漿（離心條件：8000轉(zhuǎn)/分鐘，6分鐘，2-8°C)。收集的血漿分析前存放于-80°C。 此外，剩余沒有用于實驗研究的多余動物用于空白血的采集。離心后的空白血漿用于整個 研究中供試品的生物分析方法開發(fā)和生物樣品分析。
[0318] 藥物代謝動力學(xué)分析
[0319] 根據(jù)藥物的血藥濃度數(shù)據(jù)，使用藥代動力學(xué)計算軟件WinNonlin5. 2非房室模型 分別計算供試品的藥代動力學(xué)參數(shù)。任何小于定量下限（LL0Q=Ing/mL)的數(shù)據(jù)用0值替 換，其平均值和標準差根據(jù)替換值進行計算。計算個體動物PK參數(shù)時任何小于定量下限的 數(shù)值將被剔除。
[0320] 實驗結(jié)論
[0321] 雄性SD大鼠血漿中實施例21化合物藥代動力學(xué)：
[0322] 動物靜脈注射劑量為5mg/kg的實施例21化合物后，總清除率平均值2. 60L/hr/ kg。半衰期〇72)的平均值為1. 67hr。給藥后Cmax平均值為3218. 39μg/L，Tmax平均值 為0. 083hr。AUC(O-t)值為1903. 30hr*yg/L。終期相表觀分布容積平均值為6. 22L/kg。
[0323] 動物口服給予劑量為30mg/mL的實施例21化合物后，Cmax平均值為1528. 74μg/ L，Tmax平均值為0. 50hr，AUC(O-t)平均值為3736. 13hr*yg/L，半衰期（TV2)平均值為 2. 51hr。實施例21化合物平均生物利用度為33. 01%。
[0324] 雄性SD大鼠血漿中實施例1化合物藥代動力學(xué)：
[0325] 動物靜脈注射劑量為5mg/kg的實施例1化合物后，總清除率平均值3. 74L/hr/ kg。半衰期（TV2)的平均值為5.llhr。給藥后Cmax平均值為616. 65μg/L，Tmax平均值 為0. 083hr。AUC(O-t)值為1309. 41hr*yg/L。終期相表觀分布容積平均值為27. 66L/kg。
[0326] 動物口服給予劑量為30mg/mL的實施例1化合物后，Cmax平均值為296. 20μg/ L，Tmax平均值為5. 33hr，AUC(O-t)平均值為3593. 95hr*yg/L，半衰期（TV2)平均值為 5. 67hr。實施例1化合物平均生物利用度為47. 71%。
[0327] 對人表皮樣癌A431裸小鼠皮下移植瘤的療效比較
[0328] 藥物名稱和批號
[0329] CDDD-000257(即實施例21化合物）為白色粉末，含量99. 7%，批號4010057-78 ; CDDD-000261(即實施例1化合物）為淡黃色粉末，含量99. 1%，批號4010071-08 ;陽性對照 物CDDD-000275 (即陽性對照物gefitinib)為白色粉末，含量99%，批號R020-06-130619。
[0330] 配制方法：均用20%PEG400蒸餾水配制。
[0331] 實驗動物
[0332] BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，早，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。合 格證號：SCXK(滬）2008-0016飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級。
[0333] 實驗步驟
[0334] 裸小鼠皮下接種人表皮樣癌A431細胞，待腫瘤生長至100-200mm3后，將動物隨機 分組（D0)。給藥劑量和給藥方案見表1。每周測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤體 積（V)計算公式為：
[0335] V=l/2XaXb2其中a、b分別表示長、寬。
[0336] T/C(% ) = (T-TOV(C-CO) 100其中T、C為實驗結(jié)束時的腫瘤體積；TO、C0為實 驗開始時的腫瘤體積。
[0337] 實施例21化合物、實施例1化合物、陽性對照物gefitinib(3、10、30mg/kg，P0,QD 21)均劑量依賴性地抑制高表達EGFR的人表皮樣癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生長；其中 實施例21化合物和實施例1化合物高劑量組分別引起3/6小鼠腫瘤部分消退。荷瘤小鼠 對以上藥物均能很好耐受，沒有體重減輕等癥狀發(fā)生?？傮w比較，3個化合物對人表皮樣癌 A431裸小鼠皮下移植瘤抑瘤活性排序為：實施例21化合物〉實施例1化合物〉陽性對照 物gefitinib。
[0338] 表 1.CDDD-000257、CDDD-000261、CDDD-000275 對人表皮樣癌A431 裸小鼠移植瘤 的療效。
[0339]
[0340] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種如式I所示的化合物：其中： R2各自獨立地選自下組：氫、取代或未取代的含1~6個碳原子的烷基、取代或未 取代的含1~6個碳原子的烷基?；?、取代或未取代的含3~6個碳原子的環(huán)烷基酰基、取 代或未取代的含2~6個碳原子的烯基?；?、取代或未取代的含6~10個碳原子的芳基酰 基、磺?；?、取代或未取代的含2~6個碳原子的酰胺基、取代或未取代的含1~6個碳原 子的胺基-酰基； 或RpR2與它們相連接的氮原子一起形成碳原子數(shù)為3至10個的取代或未取代的單環(huán) 或者多環(huán)含氮雜環(huán)基，或任意位置由氮原子、氧原子、硫原子置換的碳原子數(shù)為3至10個的 取代或未取代的單環(huán)或者雙環(huán)含氮雜環(huán)基； 或札、R2與相連的氮原子及氮原子的鄰位碳原子共同構(gòu)成5~7元含氮雜芳基； R3選自下組：氫、取代或未取代的含1~6個碳原子的烷基、取代或未取代的含1~6 個碳原子的烷基酰基、取代或未取代的含1~6個碳原子的酰胺基、取代或未取代的含3~ 6個碳原子的環(huán)烷基?；?、取代或未取代的含2~6個碳原子的烯基?；⑷〈蛭慈〈?含5~6個碳原子的芳基?；?、取代或未取代的含1~6個碳原子的烷基磷酸酯基； R為取代芳環(huán)或雜芳環(huán)上任意氫原子的一個或多個選自下組的取代基：鹵素、 C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、烷氧基、羥基、氨基、氰基、羥基-C1-C4烷基、C2-C10雜環(huán)烷基、 C2-C10雜環(huán)烷基-氧基、羧基，或C2-C6羧酸酯基； Ar2選自下組：苯基、鹵素取代的苯基、C1-C6烷基取代的苯基、聯(lián)苯基、鹵素取代的聯(lián)苯 基、萘基、吡啶基、噻吩基、鹵素取代的噻吩基、C1-C3烷基取代的噻吩基、呋喃基、鹵素取代的 呋喃基，或C 1-C3烷基取代的呋喃基； A、B、D各自獨立地選自下組：碳原子、氮原子、氧原子、硫原子或無；且A、B、D中至多僅 有一個為無； η = 0、1 或 2 ; 其中，除非特別說明，所述的取代指基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基 取代：鹵素、羥基、氧代、硝基、Cl~C6的鹵代烷基、Cl~C6的烷基、Cl~C6的烯基、Cl~ C6的炔基、C3~C12的芳基、C3~C12的芳基烷基、Cl~C6的烷氧基、C3~C12的芳基氧 基、氨基、Cl~C6的酰基氨基、Cl~C6的烷基氨基甲?；?、C3~C12的芳基氨基甲?；?、 Cl~C6的氨基烷基、Cl~C6的?；?、羧基、Cl~C6的羥烷基、Cl~C6的烷基磺?；?、 C5~C12的芳基磺?；l~C6的烷基磺酰氨基、C5~C12的芳基磺酰氨基、C3~C12的 芳烷基磺酰氨基、Cl~C6的烷基羰基、Cl~C6的烯基羰基、Cl~C6的酰氧基、Cl~C6 的羥基-?；⑶杌?、脲基、Cl~C6的烷基?；l~C6的環(huán)烷基?；?、磺酰基、氨基甲酸 醋基； 虛線為化學(xué)鍵或無。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于： A、B、D均為碳原子； Ar2為未取代或鹵素取代的苯基；和/或 R1A2各自獨立地選自下組：氫、含1~6個碳原子的烷基或取代的烷基、含1~6個碳 原子的烷基?；?、含3~6個碳原子的環(huán)烷基?；?、取代或未取代的含2~6個碳原子的烯 基酰基、取代或未取代的含6~10個碳原子的芳基?；?、磺酰基、取代或未取代的含2~6 個碳原子的酰胺基、取代或未取代的含1~6個碳原子的胺基-酰基； 或RpR2與它們相連接的氮原子一起形成取代或未取代的C3~ClO的雜環(huán)基，其中，所 述的雜環(huán)基具有1~3個選自下組的雜原子：0、S或N ; 或札、R2與相連的氮原子及氮原子的鄰位碳原子共同構(gòu)成5~7元含氮雜芳基。3. 如權(quán)利要求1所述的式I化合物的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟： 在鈀催化劑的存在下，用式（1)化合物與式（Ia)化合物進行偶聯(lián)反應(yīng)，得到式I化合 物：式中，各基團的定義如權(quán)利要求1中所述。4. 如權(quán)利要求1所述的式I化合物的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟：用式 (3)化合物與R3X反應(yīng)，得到式I化合物 ：其中，X選自下組：Cl、OTs。5. -種酪氨酸激酶抑制劑，其特征在于，所述的抑制劑含有抑制有效量的如權(quán)利要求 1或2中所述的式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接 受的溶劑合物。6. -種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有治療有效量的如權(quán)利要求1 或2中所述的式I化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受 的溶劑合物。7. 如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物用于治療與酪氨 酸激酶過表達和/或酪氨酸激酶活性過高相關(guān)的疾病，或所述的藥物組合物用于治療與表 皮生長因子受體相關(guān)的疾病。8. 如權(quán)利要求5所述的抑制劑或如權(quán)利要求6中所述的藥物組合物，其特征在于： 所述藥學(xué)上可接受的鹽是式I化合物的選自下組的鹽：無機酸鹽、有機酸鹽、烷基磺酸 鹽、芳基磺酸鹽，或其組合；較佳地，所述的鹽選自下組鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、 磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬 酸鹽、甲基磺酸鹽、乙基磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽，或其組合； 所述藥學(xué)上可接受的溶劑合物，是指式I化合物與選自下組的溶劑形成的溶劑合物： 水、乙醇、異丙醇、乙醚、丙酮，或其組合。9. 如權(quán)利要求1或2任一所述的式I化合物的用途，其特征在于，用于： (a) 制備酪氨酸激酶抑制劑； (b) 用于體外非治療性地抑制酪氨酸激酶的活性； (c) 用于體外非治療性地抑制腫瘤細胞生長； (d) 用于制備治療表皮生長因子受體活性相關(guān)的疾病的藥物。10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述的表皮生長因子受體選自下組：EGFR 和/或HER2。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一類噻吩并嘧啶類衍生物、其制備方法及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明一種如式I所示的化合物，其中各基團的定義如說明書中所述。所述的化合物是一類有效的酪氨酸激酶抑制劑，特別適合用作EGFR和/或HER2抑制劑。
【IPC分類】C07D519/00, C07F9/6561, A61P35/00, A61P35/04, A61K31/675, A61K31/519, C07D495/04
【公開號】CN105418632
【申請?zhí)枴緾N201410483081
【發(fā)明人】安曉霞, 別平彥, 劉俊, 莊戈詩
【申請人】上海創(chuàng)諾醫(yī)藥集團有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2014年9月19日