l · 6H2O 4.98lg,CaCl2 · H20 1.102g, NaHC〇3〇.192g，H3B03 0.026g，NaF 0.004g，用蒸餾水定容至1L。
[0027] 實(shí)施例1:培養(yǎng)基的選擇
[0028] 用高濃度金屬離子培養(yǎng)基脅迫培養(yǎng)桔青霉MNP12010101，采用HPLC指紋圖譜法分 析代謝產(chǎn)物的多樣性，四甲基偶氮唑法(MTT法)檢測發(fā)酵總浸膏抗腫瘤活性的變化，從而篩 選出一種金屬離子，加入到培養(yǎng)基后能促使桔青霉產(chǎn)生更多的抗腫瘤活性物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)的金 屬離子包括 182+、1112+、？63+、8& 2+、0)2+和〇12+等。結(jié)果表明，1%2+、111 2+、？63+』&2+和〇12+加入到 發(fā)酵培養(yǎng)基中，桔青霉的代謝產(chǎn)物多樣性基本沒有變化，發(fā)酵總浸膏的抗腫瘤活性也沒有 顯著提高，唯有發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1. 〇g/L氯化鈷(C〇Cl2)時，桔青霉的代謝產(chǎn)物多樣性增 加，發(fā)酵總浸膏的抗腫瘤活性增強(qiáng)，具體實(shí)驗(yàn)步驟和方法如下：
[0029] (1)將桔青霉MNP12010101接種于斜面培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)48h，得到活化后的斜面 菌種孢子，所述斜面培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯200g/L(煮沸30min后過濾去渣），葡萄糖20g/L， 瓊脂18g/L，人工海水定容，pH 7.0，高壓蒸汽121°C滅菌15min;
[0030] (2)將步驟（1)活化培養(yǎng)后的斜面菌種孢子接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三 角瓶裝中，于28°C、200r/min振蕩條件下培養(yǎng)48h，得種子液。所述的種子培養(yǎng)基組成為:葡 萄糖1(^/1，蛋白胨28/1，酵母浸膏以/1，用體積比1 :1.5的人工海水與蒸餾水混合液溶解， pH 7.0,高壓蒸汽121°C滅菌15min。
[0031] (3)將步驟(2)種子液以10 %體積濃度的接種量，移種到50mL含1. Og/L氯化鈷的發(fā) 酵培養(yǎng)基中（250mL三角瓶裝），于28°C、200r/min振蕩條件下培養(yǎng)5d后（菌體干重為10.7g/ L)，再于28°C下靜置4d，得到培養(yǎng)物。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L， 酵母浸膏2g/L，用體積比1:1.5的人工海水與蒸餾水混合液溶解，pH 7.0，高壓蒸汽121°C滅 菌15min〇
[0032] (4)將步驟(3)制備的培養(yǎng)液50mL用8層紗布過濾，分離菌體和發(fā)酵液，獲得濾液 45mL和濾餅，濾液用50mL乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液，萃取液45°C減壓蒸餾除去乙酸乙 酯，所得膏狀物即為發(fā)酵液提取物。濾餅用50mL甲醇浸泡12h，再于25°C、100KHz超聲提取 30min，過濾除去菌體，濾液50°C減壓蒸餾除去甲醇和水，得膏狀物用甲醇溶解，離心棄去沉 淀，上清液再次于50°C減壓蒸餾除去甲醇，反復(fù)1~3次，獲得菌體提取物。合并發(fā)酵液提取 物和菌體提取物，即為發(fā)酵總浸膏12.7mg。
[0033] (5)將步驟(4)制備的發(fā)酵總浸膏12.7mg用體積與質(zhì)量比（mL:g)為5:1的甲醇溶 解，經(jīng)0.22μπι濾膜過濾，濾液用HPLC分析代謝產(chǎn)物情況，并與未加氯化鈷的培養(yǎng)基培養(yǎng)桔青 霉ΜΝΡ12010101制備的發(fā)酵總浸膏中代謝產(chǎn)物比較，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出：上述 方法制備的桔青霉MNP 12010101發(fā)酵總浸膏（圖1中A)中，HPLC圖譜出峰數(shù)量明顯多于培養(yǎng) 基未加氯化鈷時（圖1中B)出峰數(shù)量，說明有新化合物合成。
[0034] (6)測定步驟(4)制備的發(fā)酵總浸膏的抗腫瘤細(xì)胞活性，并與未加氯化鈷的培養(yǎng)基 培養(yǎng)桔青霉MNP12010101制備的發(fā)酵總浸膏的活性相比較，結(jié)果顯示:上述方法制備的桔青 霉MNP12010101發(fā)酵總浸膏抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，對人肺腺癌細(xì)胞(A549)抑制IC 5Q值由培養(yǎng) 基未加氯化鈷時的141.12yg/mL降低至61.23yg/mL，說明桔青霉MNP 12010101在濃度l.Og/ L氯化鈷的脅迫培養(yǎng)下，抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物濃度提高或種類增加。
[0035] 所述的發(fā)酵總浸膏抗腫瘤活性分析采用MTT法，測試的腫瘤細(xì)胞為人肺腺癌細(xì)胞 (A549)，具體方法是：
[0036]收集對數(shù)期A549腫瘤細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，每 孔加入100yL，每孔細(xì)胞數(shù)在5000~10000個，邊緣孔用無菌水填充。將待測樣品（即步驟4制 備的發(fā)酵總浸膏）用DMEM培養(yǎng)基溶解，并加1%。體積的二甲基亞砜(DMS0)助溶，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將待測樣品配制成終濃度為50yg/mL、100yg/mL、200yg/mL的樣品 液。試驗(yàn)組每孔加入樣品液lOOyL;空白組則僅加入200yL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；陰 性組則加入200yL細(xì)胞懸液；陽性對照組加入1 OOyL相同濃度的5-氟尿嘧啶。每個樣品設(shè)5個 復(fù)孔做重復(fù)。加樣后置于37°C，5%⑶2培養(yǎng)箱孵育48h后，每孔加入已過濾膜除菌的20yL 5mg/mL MTT溶液，繼續(xù)在原有條件下培養(yǎng)4h后，用移液槍小心吸掉上清，加入150yL DMS0， 小心振蕩lOmin，待結(jié)晶物充分溶解后，使用酶標(biāo)儀測定在490nm處的吸光值，并用以下公式 計算抑制率：
[0037]抑制率=(細(xì)翻一A爾a)/(細(xì){齟一Ase) X 100%。
[0038]按公式lg IC50 = Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)計算IC50，Xm:lg最大劑量，I:lg(最大劑 量/相臨劑量），P:抑制率之和，Pm:最大劑量抑制率，pn:最小劑量抑制率。
[0039] 實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.0g/L的氯化鈷，能顯著促進(jìn)桔青霉 MNP 12010101合成抗腫瘤活性的代謝產(chǎn)物。
[0040] 實(shí)施例2:發(fā)酵培養(yǎng)基鈷離子濃度的選擇
[00411改變發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈷的濃度，脅迫培養(yǎng)桔青霉MNP12010101，采用HPLC指紋圖 譜法分析代謝產(chǎn)物的多樣性，四甲基偶氮唑法(MTT法)檢測發(fā)酵總浸膏抗腫瘤活性的變化， 具體實(shí)驗(yàn)步驟和方法如下：
[0042] (1)按實(shí)施例1方法，制備桔青霉MNP12010101的種子液；
[0043] (2)將步驟(2)種子液以10%體積濃度的接種量，移種到50mL含不同濃度氯化鈷的 發(fā)酵培養(yǎng)基中（250mL三角瓶裝），氯化鈷濃度見表1，于28°C、200r/min振蕩條件下培養(yǎng)5d后 (不同氯化鈷濃度下菌體干重得率見表1)，再于28°C下靜置4d，得到培養(yǎng)物。所述的發(fā)酵培 養(yǎng)基組成為：葡萄糖2(^/1，蛋白胨58/1，酵母浸膏28/1，用體積比1 :1.5的人工海水與蒸餾 水混合液溶解，pH 7.0，高壓蒸汽121°C滅菌15min。
[0044] (3)將步驟（2)制備的培養(yǎng)液50mL用8層紗布過濾，分離菌體和發(fā)酵液，獲得濾液 45mL和濾餅，濾液用50mL乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液，萃取液45°C減壓蒸餾除去乙酸乙 酯，所得膏狀物即為發(fā)酵液提取物。濾餅用50mL甲醇浸泡12h，再于25°C、100KHz超聲提取 30min，過濾除去菌體，濾液50°C減壓蒸餾除去甲醇和水，得膏狀物用甲醇溶解，離心棄去沉 淀，上清液再次于50°C減壓蒸餾除去甲醇，反復(fù)1~3次，獲得菌體提取物。合并發(fā)酵液提取 物和菌體提取物，即為發(fā)酵總浸膏，不同氯化鈷濃度下，50mL培養(yǎng)液制備的發(fā)酵總浸膏得率 見表1。
[0045] (4)將步驟（3)制備的發(fā)酵總浸膏用體積與質(zhì)量比（mL:g)為5:1的甲醇溶解，經(jīng) 0.22μπι濾膜過濾，濾液用HPLC分析代謝產(chǎn)物情況，并與未加氯化鈷的培養(yǎng)基培養(yǎng)桔青霉 麗Ρ12010101制備的發(fā)酵總浸膏中代謝產(chǎn)物比較，結(jié)果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈷濃度在 0.5~2.5g/L范圍內(nèi)，上述方法制備的桔青霉ΜΝΡ12010101發(fā)酵總浸膏中，HPLC圖譜出峰數(shù) 量均多于培養(yǎng)基未加氯化鈷時出峰數(shù)量，但在氯化鈷濃度為lg/L時，出峰數(shù)量增加的最顯 著。
[0046] (5)測定步驟(3)制備的發(fā)酵總浸膏的抗腫瘤細(xì)胞活性，并與未加氯化鈷的培養(yǎng)基 培養(yǎng)桔青霉MNP12010101制備的發(fā)酵總浸膏的活性相比較，結(jié)果顯示:上述方法制備的桔青 霉MNP12010101發(fā)酵總浸膏抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，對人肺腺癌細(xì)胞(A549)抑制IC 5Q值由培養(yǎng) 基未加氯化鈷時的142.5yg · mL-1降低至61.43~125.6yg · mL-1，說明桔青霉MNP 12010101 在濃度0.5~2.5g/L氯化鈷的脅迫培養(yǎng)下，抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物濃度提高或種類增加。
[0047] 所述的發(fā)酵總浸膏抗腫瘤細(xì)胞活性測定方法同實(shí)施例1。
[0048] 表1發(fā)酵培養(yǎng)基不同氯化鈷濃度下的菌體得率和抗腫瘤活性
[0049]
[0050]比較表1中數(shù)據(jù)可以看出：在桔青霉MNP 12010101的發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈷濃度的不 同，對菌體得率、發(fā)酵總浸膏得率及對A549的抑制活性都有一定影響。在氯化鈷濃度為1~ 2g/L范圍內(nèi)，較在未加氯化鈷發(fā)酵培養(yǎng)中培養(yǎng)，菌體得率和發(fā)酵總浸膏得率沒有顯著下降， 但是發(fā)酵總浸膏對A549的抑制率則顯著提高，所以，脅迫培養(yǎng)桔青霉MNP12010101產(chǎn)生抗腫 瘤活性物質(zhì)的氯化鈷濃度范圍為1~2g/L。
[0051 ]實(shí)施例3:發(fā)酵總浸膏的制備
[0052]利用含1. Og/L的氯化鈷的發(fā)酵培養(yǎng)基，對桔青霉MNP 12010101大量發(fā)酵培養(yǎng)，制備 發(fā)酵總浸膏，具體步驟是：
[0053]將桔青霉MNP12010101接種于斜面培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)60h，得到活化后的菌種孢 子;挑取活化培養(yǎng)后的菌種孢子接種至裝有l(wèi)〇〇mL種子培養(yǎng)基(500mL的三角瓶裝）中，于28 °C、200r/min振蕩條件下培養(yǎng)36h，得到種子液;將種子液以10 %體積濃度的接種量，移種到 400mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（1L三角瓶裝），于28°C、200r/min振蕩條件下培養(yǎng)7d后（菌體干重為 12.2g/L)，再于28°C下靜置5d，得到培養(yǎng)物。按上述步驟，共發(fā)酵培養(yǎng)制備了80L培養(yǎng)物。 [0054] 上述80L桔青霉MNP12010101培養(yǎng)物用8層紗布過濾，分離菌體和發(fā)酵液75L。發(fā)酵 液于50°C下減壓濃