一種孔徑可控的細(xì)菌纖維素多孔微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種孔徑可控的細(xì)菌纖維素多孔微球的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多孔微球作為一種重要的新型材料，具有密度低、比表面積大、穩(wěn)定性好和表面滲透能力強等特點，因此在化學(xué)、生物、材料科學(xué)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。如在藥物新制劑的研發(fā)以及新劑型的改造方面能夠作為一種新型緩/控釋給藥載體，具有保護藥物免遭破壞、控制藥物釋放速度、延長藥物作用時間、減少藥物不良反應(yīng)及降低用藥量等優(yōu)點，還可用于特定組織和器官的藥物靶向釋放等。另外由于其高效細(xì)胞擴增性和可注射性等，多孔微球還為腫瘤的形成機制研究、抗腫瘤藥物的篩選和組織工程提供重要的平臺。利用性能優(yōu)良、可生物降解性且具有生物相容性的材料制備孔徑可控的多孔微球可使其在不同領(lǐng)域進行廣泛應(yīng)用。
[0003]細(xì)菌纖維素是由生長在液態(tài)含糖基質(zhì)中的細(xì)菌產(chǎn)生的，并分泌到基質(zhì)中的纖維素成分，是由葡萄糖以β_1，4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，因其天然的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性和降解性在生物醫(yī)藥材料、纖維素衍生物等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景，是一種良好的多孔微球制備材料。細(xì)菌纖維素不溶于一般溶劑，采用一般方法很難將其制備成多孔微球。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、穩(wěn)定性好，且能夠批量生產(chǎn)的孔徑可控的細(xì)菌纖維素多孔微球的制備方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0006]1)細(xì)菌纖維素的制備
[0007]首先，取具有細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力的微生物菌種活化，得活化菌種，將活化菌種擴大培養(yǎng)，得到種子液，將種子液接種至細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵得到細(xì)菌纖維素發(fā)酵液，然后，將細(xì)菌纖維素發(fā)酵液液面上層的細(xì)菌纖維素膜取出，水洗后于80?90°C，在堿性溶液中浸泡20?40min，取出，反復(fù)沖洗至細(xì)菌纖維素膜呈透明狀，吸干水分，干燥至恒重，得細(xì)菌纖維素；
[0008]2)細(xì)菌纖維素多孔微球的制備
[0009]將離子液體與1，3-二甲基-2-咪唑啉酮按8:2?6:4的質(zhì)量比混合得復(fù)合溶劑，然后將復(fù)合溶劑置于鼓風(fēng)干燥箱中于101?110°C干燥2?3h，取出，向細(xì)菌纖維素中加入細(xì)菌纖維素質(zhì)量4?8%的復(fù)合溶劑，于90?120°C油浴攪拌1?4h，得到透明的細(xì)菌纖維素溶液；
[0010]3)向細(xì)菌纖維素溶液中加入模板微粒，使模板微粒的質(zhì)量濃度為10%，置于超聲波分散機中，超聲使微粒分散均勻，得分散液；
[0011]4)將分散液和表面活性劑傾倒入有機溶劑中，均質(zhì)乳化，得w/o型細(xì)菌纖維素乳液，其中表面活性劑加量為有機溶劑的0.15?0.45wt%，所述分散液與有機溶劑質(zhì)量比為1:5 ?1:10;
[0012]5)向w/o型細(xì)菌纖維素乳液中加入沉淀劑正丁醇，沉淀劑與w/o型細(xì)菌纖維素乳液體積比為5:1?15:1，攪拌得微球懸浮液，將微球懸液減壓過濾，收集沉淀，將沉淀物依次使用正丁醇、丙酮、丙酮洗滌，再經(jīng)乙醇抽提，收集沉淀，冷凍干燥，得孔徑可控的細(xì)菌纖維素多孔微球。
[0013]所述的具有細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力的微生物菌種為木醋桿菌或木葡糖醋酸桿菌。
[0014]所述的菌種活化是將菌種接種于pH值為5.5?6.5的活化培養(yǎng)基中，在28?32°C下，一次培養(yǎng)28?32h，得到一次培養(yǎng)菌種，將一次培養(yǎng)菌株再次接種于活化培養(yǎng)基中，在28?32°C下，二次培養(yǎng)28?32h，得到活化的菌種；其中，所述的活化培養(yǎng)基中含有蔗糖40?50g/L，牛肉膏10?15g/L，磷酸氫二鈉4?5g/L，梓檬酸0.8?1.0g/L，乙醇8?10g/L，瓊脂15?20g/L。
[0015]所述的擴大培養(yǎng)是將活化菌種接種于pH值為5.5?6.5的擴培培養(yǎng)基中，在溫度為28?32°C，轉(zhuǎn)速為150?200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)18?22h，得到種子液;其中，所述的擴培培養(yǎng)基中含有蔗糖40?50g/L，牛肉膏10?15g/L，磷酸氫二鈉4?5g/L，檸檬酸0.8?1.0g/L，乙醇8?10g/L。
[0016]所述的發(fā)酵是按照每100mL接種3?6mL的接種量將種子液接種至細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28?32°C下，發(fā)酵8?10天，得到細(xì)菌纖維素發(fā)酵液。
[0017]所述的離子液體為1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-甲基-3-乙基咪唑溴鹽、1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽或1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽。
[0018]所述的模板微粒采用粒徑為200nm?500μηι的聚苯乙稀微粒，超聲溫度為60?90°C，超聲時間為5?lOmin。
[0019]所述表面活性劑為司盤-80或聚硅氧烷，所述有機溶劑為正十六烷或真空栗油。
[0020]所述均質(zhì)乳化速度為3000?7000r/m，所述均質(zhì)乳化時間為5?lOmin。
[0021]所述步驟5)的攪拌轉(zhuǎn)速為200?300r/m，所述攪拌時間為10?20min。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0023]本發(fā)明利用微球制備過程中添加不同粒徑的模板微粒分散于細(xì)菌纖維素溶液中，可制成200nm?500μπι的任意孔徑細(xì)菌纖維素多孔微球，使其可應(yīng)用于不同分子大小的藥物緩釋載體的制備，不同組織細(xì)胞的粘附，以及不同分子大小目標(biāo)物質(zhì)的吸附，該制備工藝可滿足多種孔徑要求的多孔微球的制備，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0024]本發(fā)明還公開了細(xì)菌纖維素多孔微球的制備方法。該方法利用咪唑類離子液體(IL)與1，3_ 二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)作為細(xì)菌纖維素的復(fù)合溶劑，解決了細(xì)菌纖維素難以溶解的問題，使其制備成多孔微球成為可能，促進了細(xì)菌纖維素在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的高附加值應(yīng)用。同時在制備過程中所選擇的表面活性劑和沉淀劑能夠有效保證微球形成過程中的外觀穩(wěn)定性，克服了微球制備過程中易變形的問題，提高了微球的性能。該制備方法操作簡便，便于工業(yè)化生產(chǎn)，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性都較好，適宜進行大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明。
[0026]本發(fā)明的木糖葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterxylinus)，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株號acccl0215。
[0027]實施例1
[0028]1)細(xì)菌纖維素的制備
[0029]首先，取具有細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力的微生物菌種木葡糖醋酸桿菌(Gluconacetobacterxylinus)接種于pH值為5.5的活化培養(yǎng)基中，在30°C下，一次培養(yǎng)30h，得到一次培養(yǎng)菌種，將一次培養(yǎng)菌株再次接種于活化培養(yǎng)基中，在30°C下，二次培養(yǎng)30h，得到活化的菌種;其中，活化培養(yǎng)基中含有蔗糖40g/L，牛肉膏12g/L，磷酸氫二鈉4g/L，檸檬酸
0.98/1，乙醇98/1，瓊脂188/1;將活化菌種接種于?!1值為5.5的擴培培養(yǎng)基中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)18h，得到種子液;其中，所述的擴培培養(yǎng)基中含有蔗糖45g/L，牛肉膏12g/L，磷酸氫二鈉4.2g/L，檸檬酸1.0g/L，乙醇9g/L;按照每100mL接種5mL的接種量將種子液接種至細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下，發(fā)酵9天，得到細(xì)菌纖維素發(fā)酵液，然后，將細(xì)菌纖維素發(fā)酵液液面上層的細(xì)菌纖維素膜取出，水洗后于80°C，在堿性溶液中浸泡40min，取出，反復(fù)沖洗至細(xì)菌纖維素膜呈透明狀，吸干水分，干燥至恒重，得細(xì)菌纖維素；
[0030]2)細(xì)菌纖維素多孔微球的制備
[0031]將1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽(六厘頂(:1)與1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(011)按8:2的質(zhì)量比混合得復(fù)合溶劑，然后將復(fù)合溶劑置于鼓風(fēng)干燥箱中于101°c干燥3h，取出，向細(xì)菌纖維素中加入細(xì)菌纖維素質(zhì)量4%的復(fù)合溶劑，于100°C油浴攪拌3h，得到透明的細(xì)菌纖維素溶液；
[0032]3)向細(xì)菌纖維素溶液中加入粒徑為200nm的聚苯乙稀(polystyrene，PS)模板微