)中描述。凝 膠中蛋白質(zhì)的濃度可以通過(guò)一維或二維蛋白質(zhì)凝膠分離及隨后的蛋白質(zhì)濃度光學(xué)鑒別而 使用合適的分析軟件確定。在棒狀細(xì)菌情況中，制備蛋白質(zhì)凝膠及鑒別蛋白質(zhì)的常規(guī)方法 是由Hermann et al · (Electrophoresis，22:1712-23(2001))描述的方法。蛋白質(zhì)濃度也可 以使用特異于待檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗體通過(guò)Western印跡雜交方法確定（Sambrook et al.， Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)，隨后使用合適的軟件對(duì)濃度進(jìn)行光學(xué)測(cè)定 (Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,Angewandte Chemie 321: 2630-2647( 1999))。采集的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過(guò)T檢驗(yàn)確定(Gosset ,Biometrika 6( 1): 1-25(1908))。
[0079] 使用本發(fā)明采用的操縱基因的ilvBN基因的過(guò)表達(dá)措施可以與其它過(guò)表達(dá)措施以 合適方式組合。
[0080] 為了實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)，在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域可利用多種方法。這些方法除了修飾管理或控 制基因表達(dá)的核苷酸序列之外，也包括增加拷貝數(shù)。
[0081] 拷貝數(shù)的增加可以通過(guò)在微生物的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的質(zhì)粒進(jìn)行。為此，在現(xiàn)有技術(shù) 中針對(duì)各種微生物描述了眾多質(zhì)粒，使用這些質(zhì)?？梢哉{(diào)芐基因拷貝數(shù)的所需增加。對(duì)于 棒桿菌屬的合適質(zhì)粒在例如Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3)，27_40， (2003))或者在Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71,5920-5928(2005))中描述。
[0082] 拷貝數(shù)增加至少一個(gè)（1)拷貝可另外通過(guò)將進(jìn)一步的拷貝插入微生物染色體中而 發(fā)生。對(duì)于棒桿菌屬合適的方法在例如專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)W0 03/014330、W0 03/040373和W0 04/ 069996中描述。
[0083] 可進(jìn)一步發(fā)生基因表達(dá)的增加，其中許多啟動(dòng)子位于希望的基因之前或者與待表 達(dá)的基因功能性連接，以此方式實(shí)現(xiàn)表達(dá)增加。這種方式例如在專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)W0 2006/ 069711中描述。
[0084] 延伸率(Geschwindigkeit der Elongation)受密碼子使用的影響；通過(guò)使用通常 在起始菌株中發(fā)生的t(轉(zhuǎn)移)RNA的密碼子可以增加翻譯。此外，起始密碼子置換為在許多 微生物中最常發(fā)生(在大腸桿菌中為77%)的密碼子ATG可以明顯改良翻譯，因?yàn)樵赗NA水 平，密碼子AUG比例如密碼子⑶G和UUG有效2-3倍(Khudyakov et al.，F(xiàn)EBS Letters 232 (2):369-71(1988)；Reddy et al. proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60(1985))。也可以優(yōu)化起始密碼子的序列環(huán)境，已經(jīng)描述了起 始密碼子與側(cè)翼區(qū)之間的相互作用影響（Stenstrom et al.，Gene 273(2): 259-65(2001); Hui et al.,EMB0 Journal 3(3):623-9(1984))〇
[0085] DNA處理、DNA的消化和連接、轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化和選擇的說(shuō)明見(jiàn)于已知的Sambrook等 的指南Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
[0086] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用這樣的微生物，其中希望的L_氨基酸或a_ 酮酸的生物合成途徑的其他基因另外以增加的形式存在，特別是過(guò)表達(dá)的。
[0087]對(duì)于L-纈氨酸、L-異亮氨酸、α-酮異戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或者α-酮異己酸的生 產(chǎn)，優(yōu)選選自如下一組的編碼L-纈氨酸、L-異亮氨酸、α_酮異戊酸、α_酮-β_甲基戊酸或者α_ 酮異己酸的生物合成的酶的一或多個(gè)基因或多核苷酸可以另外過(guò)表達(dá)：
[0088] a)多核苷酸（ilvC基因），其編碼異構(gòu)還原酶（IlvC，EC No. :1.1.1.86)，
[0089] b)多核苷酸（ilvD基因），其編碼二羥酸脫水酶（IlvD，EC No. :4·2·1·9)，
[0090] c)多核苷酸（ilvE基因），其編碼轉(zhuǎn)氨酶（IlvE，EC No. :2.6.1.42),
[0091] (1)多核苷酸（丨14基因），其編碼蘇氨酸脫水酶（114^1:4.3丄19)，
[0092] e)多核苷酸(hom基因），其編碼高絲氨酸脫氫酶(Hom，EC No.:1.2.1.11)，
[0093] f)多核苷酸(thrB基因），其編碼高絲氨酸激酶(ThrB，EC No. :2.7.1.39),
[0094] g)多核苷酸(thrC基因），其編碼蘇氨酸合酶(ThrC，EC No.:4.2.3.1)，
[0095] h)多核苷酸(leuA基因），其編碼異丙基蘋(píng)果酸合酶(LeuA，EC No. :2.3.3.13),
[0096] i)多核苷酸（leuB基因），其編碼異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶(LeuB，EC No. :1.1.1.85)，
[0097] j)多核苷酸（leuC基因），其編碼異丙基蘋(píng)果酸異構(gòu)酶(LeuC，EC No· :4·2· 1 ·33)的 大亞基
[0098] k)多核苷酸（leuD基因），其編碼異丙基蘋(píng)果酸異構(gòu)酶(LeuD，EC No· :4·2· 1 ·33)的 小亞基，
[00"] 對(duì)于異亮氨酸和繳氨酸，特別優(yōu)選的是基因 hom、ilvA、ilvC、ilvD和ilvE，對(duì)于α- 酮異戊酸(KIV)和α-酮-β-甲基戊酸(KMV)，特別優(yōu)選的是基因 ilvC和ilvD，對(duì)于α-酮異己酸 (KIC)，特別優(yōu)選的是基因 ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC和leuD。
[0100]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用其中降低希望的L-氨基酸或a-酮酸形成的代謝途 徑至少被部分弱化的微生物。
[0101]如果優(yōu)選產(chǎn)生纈氨酸或酮異戊酸，則可以弱化異亮氨酸(對(duì)于前體酮丁酸的形 成：;11￥4、1:11沾、1:111^、11〇111)和/或亮氨酸（161^、161113、1611〇0)的代謝途徑。如果優(yōu)選產(chǎn)生異亮 氨酸或酮甲基戊酸，則可以弱化亮氨酸的生物合成途徑。如果優(yōu)選產(chǎn)生亮氨酸或酮異己酸， 則可以弱化異亮氨酸(或者前體酮丁酸)的生物合成途徑。
[0102] 在本文中術(shù)語(yǔ)"弱化"描述了細(xì)菌中由合適的DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì)）的細(xì) 胞內(nèi)活性的降低或關(guān)閉，通過(guò)例如使用弱啟動(dòng)子或使用編碼具有低活性的合適的酶或失活 合適的基因或酶(蛋白質(zhì)）的基因或等位基因或者任選組合這些措施。各個(gè)靶基因的完全或 部分弱化可以例如通過(guò)基因的完全或部分缺失或者通過(guò)在結(jié)構(gòu)基因中或者在啟動(dòng)子區(qū)或 在核糖體結(jié)合位點(diǎn)中插入點(diǎn)突變而實(shí)現(xiàn)。特異性降低基因表達(dá)的另一方法是反義技術(shù)，其 中將合成較長(zhǎng)反義RNA的短寡脫氧核苷酸或載體帶入靶細(xì)胞中。反義RNA可以結(jié)合特異性 mRNA的互補(bǔ)區(qū)段并且降低其穩(wěn)定性或者阻斷可翻譯性。本領(lǐng)域技術(shù)人員在Srivastava et al · (Applied Environmental Microbiology 20000ct;66(10) :4366-4371)中發(fā)現(xiàn)這樣一 個(gè)實(shí)例。所述反義技術(shù)也可以通過(guò)使用本發(fā)明的操縱基因/啟動(dòng)子進(jìn)行，其中在靶基因之后 以"反義"方向克隆。在加入誘導(dǎo)物丙酸鹽之后，誘導(dǎo)被弱化的靶基因的互補(bǔ)鏈的mRNA形成。 通過(guò)將這種反義mRNA加入靶基因的mRNA，降低靶基因的表達(dá)?；?i 1 vBN的調(diào)節(jié)表達(dá)或過(guò)表 達(dá)或者L-氨基酸或α_酮酸的調(diào)節(jié)產(chǎn)生優(yōu)選在棒桿菌屬微生物中進(jìn)行。在棒桿菌屬內(nèi)，優(yōu)選 的菌株是基于如下菌種的那些:有效棒桿菌(Corynebacterium efficiens)，典型菌株保藏 為DSM44549，谷氨酸棒桿菌，典型菌株保藏為ATCC13032，及產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)，典型菌株保藏為ATCC6871。非常特別優(yōu)選谷氨酸棒桿菌。
[0103] 現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域也已知其它名稱的谷氨酸棒桿菌的一些代表性菌株。這些菌株包括 例如：菌株ATCC13870，其被命名為嗜乙酰乙酸棒桿菌（Corynebacterium acetoacidophilum)，菌株DSM20137,其被命名為百合棒狀桿菌（Corynebacterium lilium)，菌株ATCC17965，其被命名為棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)，菌 株ATCC14067,其被命名為黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，菌株ATCC13869,其被命 名為乳發(fā)酵短桿菌（1^'6￥；^&(^61'；[111111&(31:0€61'1116111：11111)，及菌株41'0(]14020，其被命名為雙 歧桿菌（Brevibacterium divaricatum) 〇
[0104] 針對(duì)谷氨酸棒桿菌的術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus)"同樣常 見(jiàn)。有效棒桿菌菌種的一些代表性菌株在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域也被命名為熱產(chǎn)氨棒桿菌 (Corynebacterium thermoaminogenes)，例如菌株FERM BP-1539。
[0105] 用于本發(fā)明措施中的微生物或菌株(起始菌株)優(yōu)選已經(jīng)具有將希望的L-氨基酸 或α-酮酸分泌進(jìn)其周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中并在此積聚的能力。在下文中，術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)生"也用于 此含義。特別地，本發(fā)明采用的菌株在誘導(dǎo)后優(yōu)選具有在細(xì)胞或在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中富集或積 聚2 (至少)〇.5g/l*h、優(yōu)選至少1.0或2.0g/l*h的希望的氨基酸的能力。起始菌株優(yōu)選是已 經(jīng)通過(guò)誘變和選擇、通過(guò)重組DNA技術(shù)或者通過(guò)組合這兩種方法產(chǎn)生的菌株。
[0106] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解也可以獲得適于本發(fā)明措施的微生物，首先在野生型菌株 如在谷氨酸棒桿菌典型菌株ATCC 13032或菌株ATCC 14067中采用根據(jù)本發(fā)明使用的操縱 基因以調(diào)節(jié)希望的基因的表達(dá)及隨后通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域描述的進(jìn)一步的遺傳學(xué)措施誘導(dǎo) 微生物產(chǎn)生氨基酸或酮酸。
[0107] 產(chǎn)生或分泌L-纈氨酸的棒狀細(xì)菌的已知代表性菌株是例如：乳發(fā)酵短桿菌FERM BP-1763(在US5，188,948中描述） ；乳發(fā)酵短桿菌FERMBP-3007(在US5,521，074中描述）； 谷氨酸棒桿菌FERMBP-3006(在US5,521，074中描述）；及谷氨酸棒桿菌FERMBP-1764(在 US 5,188,948中描述）。
[0108] 產(chǎn)生L-纈氨酸的微生物典型具有反饋抗性或脫敏的乙酰乳酸合酶（AHAS，EC 4.1.3.18)。其代表合成異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸的平行代謝途徑的第一種酶(Umbarger， H.E.1987,Biosynthesis of the branched-chain amino acids,pp.352-367,in F.C.Neidhardt,J.L. Ingraham,K.B. Low,B.Magasanik,M.Schaechter, and H.E.Umbarger (ed.),Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology,American Society for Microbiology,Washington,D.C·)。全酶總是由2個(gè)大亞 基和2個(gè)小亞基組成。大的AHAS亞基形成催化結(jié)構(gòu)域，由i lvB編碼;小亞基作為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域， 由ilvN編碼。應(yīng)理解反饋抗性乙酰乳