使用rib7啟動子下調(diào)基因表達(dá)的假囊酵母屬的遺傳修飾的制作方法
【專利說明】使用RIB7啟動子下調(diào)基因表達(dá)的假囊酵母屬的遺傳修飾 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及在被遺傳修飾的假囊酵母屬的生物體中生產(chǎn)核黃素的方法，所述遺傳 修飾是用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少一個基因的天然啟動 子，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述生物體和從培養(yǎng)基分離核黃素。本發(fā)明還涉 及屬于假囊酵母屬的遺傳修飾的生物體，以及這種遺傳修飾的生物體在提高核黃素的累積 中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 所有植物以及許多微生物都生產(chǎn)核黃素。核黃素是細(xì)胞代謝的重要組分，因?yàn)樗?充當(dāng)黃素輔酶黃素單核苷酸（FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)的前體，這兩者是氧化還 原反應(yīng)中的重要電子載體并參與感光，DNA保護(hù)等。包括人類在內(nèi)的高等真核生物不能合 成核黃素，故而核黃素是以維生素（維生素 B2)的狀態(tài)獲得的。人類的維生素 B2缺乏導(dǎo)致 口腔和咽部粘膜炎癥，瘙癢和皮膚褶皺的炎癥以及皮膚損傷，結(jié)膜炎，視力敏銳度減退和角 膜混濁。在嬰兒和兒童中，可能會出現(xiàn)生長抑制和體重減輕。因此，必須向人或動物膳食中 補(bǔ)充核黃素。因而核黃素被添加到飼料和食品中并且也可以用作食品色素，例如在蛋黃醬 或冰淇淋中。
[0003] 核黃素可通過化學(xué)或生物技術(shù)生產(chǎn)?；瘜W(xué)方法合成核黃素是基于使用例如D-核 糖作為起始原料的多步驟過程。生物技術(shù)方法生產(chǎn)核黃素是基于幾種微生物自然合成核黃 素（特別是在合適的原料如植物油的存在下）的潛能。被稱為核黃素生產(chǎn)者的微生物包括 無名假絲酵母（Candida famata)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)和假囊酵母屬物種 (Stahmann，2010，Industrial Applications，The Mycota X，第二版，Springer，Berlin， Heidelberg，第 235-247 頁）。
[0004] 特別地，假囊酵母屬（先前的棉阿舒囊霉屬（Ashbya);屬于酵母科 (Saccharomycetaceae)家族）的絲狀半子囊菌（hemiascomycete)真菌被鑒定為有效的核 黃素生產(chǎn)者。在過去幾年中，已對生產(chǎn)核黃素的物種棉假囊酵母（Eremothecium gossypii) 進(jìn)行了深入研究和分析，并且已對其基因組測序。
[0005] 在棉假囊酵母（E. gossypii)中，發(fā)現(xiàn)核黃素生產(chǎn)階段與幾個核黃素生物合成基 因（例如RIB基因 RIB 1、2、3、4、5和7)的轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)勁增加相關(guān)聯(lián)。因此，例如通過整合另外 的拷貝，已經(jīng)開發(fā)出過表達(dá)這些基因的核黃素生產(chǎn)菌株，如在W0 95/26406或W0 99/61623 中所概述的。
[0006] 此外，已經(jīng)闡明了假囊酵母屬的核黃素生物合成途徑（Fischer and Bacher (2005)Nat. Prod R印· 22 :324-350)。根據(jù)對生物合成途徑的更佳理解，可通過過 表達(dá)編碼蘇氨酸酸縮酶的 GLY1 (Monschau 等人（1998)Appl. Environ. Microbiol. 64(11): 4283-4290)以及破壞編碼胞質(zhì)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的基因 SHM(Schlilpen等人（2003) Biochem J. 369:263-273)來提高在假囊酵母屬中的核黃素生產(chǎn)，這兩者都干擾對生 產(chǎn)核黃素是至關(guān)重要的GTP代謝（也參見圖1和圖2) (Stahmann，2010, Industrial Applications，The Mycota X，第二版，Springer，Berlin，Heidelberg，235-247)。發(fā)現(xiàn)經(jīng)由 干擾磷酸核糖胺合成來影響核黃素生產(chǎn)的再一個重要的調(diào)芐基因是編碼磷酸核糖基焦磷 酸酰胺轉(zhuǎn)移酶的ADE4,其可以被提供為反饋抗性版本（Jimenez等人（2005) Appl. Environ. Microbiol. 71 :5743-5751)。
[0007] 然而，盡管有這些發(fā)展，但合成效率和生產(chǎn)的核黃素的量（特別是在假囊酵母屬 真菌的遺傳背景下）仍非最佳，而對于食品級和飼料級核黃素的需求不斷提高。
[0008] 因此，需要允許在合適的生物體如假囊酵母屬的真菌中進(jìn)一步增加核黃素產(chǎn)量和 累積的手段和方法。
[0009] 發(fā)明目的和內(nèi)容
[0010] 本發(fā)明解決了這一需要并提供了在假囊酵母屬的遺傳修飾的生物體中生產(chǎn)核黃 素的方法，其中所述修飾是用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少 一個基因的天然啟動子，并使得相比于不具有遺傳修飾且與所述被遺傳修飾的生物體在相 同條件下培養(yǎng)的生物體的核黃素生產(chǎn)增加。
[0011] 因此，本發(fā)明在第一方面提供了在被遺傳修飾的假囊酵母屬的生物體中生產(chǎn)核黃 素的方法，所述遺傳修飾是用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少 一個基因的天然啟動子，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中生長所述被遺傳修飾的生物體和 從培養(yǎng)基分尚核黃素。
[0012] 本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過使用RIB7啟動子替代基因的天然啟動子來調(diào)控 它們的表達(dá)而下調(diào)所述基因的表達(dá)，核黃素的生產(chǎn)或累積的顯著增加成為可能。
[0013] 使用假囊酵母屬比使用其它微生物提供了若干優(yōu)點(diǎn)。已經(jīng)深入研究并分析了 代表性的物種棉假囊酵母，其基因組已被測序，并存在若干可用的允許其遺傳操作和工 程改造的分子工具。此外，可以證實(shí)假囊酵母屬能夠在不同的油源和含油廢物（Park等 人（2004) J. Amer. Oil Chem. Soc. 81 :57-62)，以及甘油（Ribeiro 等人（2012) J. Basic Microbiol. 52 :582-589)中生長，從而允許高效率使用這些廉價的能源作為生產(chǎn)核黃素的 原料。
[0014] 在又一個方面，本發(fā)明涉及一種假囊酵母屬的累積核黃素的生物體，其被遺傳修 飾為用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的基因的天然啟動子。
[0015] 在如上定義的方法或生物體的優(yōu)選實(shí)施方案中，被遺傳修飾的生物體相比于不具 有遺傳修飾且與所述被遺傳修飾的生物體在相同條件下培養(yǎng)的生物體能夠累積更多的核 黃素。
[0016] 在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的基因 選自adel2、shm2和basl組成的組。
[0017] 在本發(fā)明的再進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案，adel2基因的編碼序列選自下組：
[0018] (a)根據(jù)SEQ ID No. 10的核酸序列或其功能性部分；
[0019] (b)編碼根據(jù)SEQ ID No. 9的多肽的核酸序列或其功能性部分；和
[0020] (C)與根據(jù)SEQ ID No. 10的核酸序列具有至少70 %的序列同一性的核酸序列；和 /或
[0021] shm2基因的編碼序列選自下組：
[0022] (a)根據(jù)SEQ ID No. 12的核酸序列或其功能性部分；
[0023] (b)編碼根據(jù)SEQ ID No. 11的多肽的核酸序列或其功能性部分；和
[0024] (c)與根據(jù)SEQ ID No. 12的核酸序列具有至少70 %的序列同一性的核酸序列；和 /或
[0025] basl基因的編碼序列選自下組：
[0026] (a)根據(jù)SEQ ID No. 14的核酸序列或其功能性部分；
[0027] (b)編碼根據(jù)SEQ ID No. 13的多肽的核酸序列或其功能性部分；和
[0028] (c)與根據(jù)SEQ ID No. 14的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核酸序列。
[0029] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，RIB7啟動子包括選自下組的核酸序列：
[0030] (a)包括根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和
[0031] (b)與根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列具有至少70 %的序列同一性的核酸序列或其 功能性部分。
[0032] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，如上文所定義的所述遺傳修飾的生物體包括至 少一種另外的遺傳修飾。
[0033] 在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述另外的遺傳修飾導(dǎo)致選自下組的至少一種活 性的改變：
[0034] (i)GLYl ；
[0035] (ii)SHM2 ；
[0036] (iii)ADE4 ；
[0037] (iv)PRS 2,4 ；
[0038] (v) PRS 3 ；
[0039] (vi)MLSl ；
[0040] (vii)BASl
[0041] (viii) RIB 1 ；
[0042] (ix)RIB 2 ；
[0043] (x) RIB 3 ;
[0044] (xi)RIB 4 ；
[0045] (xii)RIB 5 ；
[0046] (xiii)RIB 7 ；
[0047] (xiv)FATl ；
[0048] (xv)POXl ；
[0049] (xvi)F0X2 ；
[0050] (xvii)P0Tl/F0X3 ；
[0051] (xviii)GUAl ；
[0052] (xix)ADE12 ;和
[0053] (χχΠΜΡ?Η。
[0054] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述另外的遺傳修飾導(dǎo)致至少一種下述改變：
[0055] ⑴GLY1活性增加；和/或
[0056] (ii) SHM2活性降低或消除；和/或
[0057] (iii)ADE4活性增加和/或提供作為反饋抑制抗性的版本；和/或
[0058] (iv)PRS 2,4活性增加；和/或
[0059] (v) PRS 3活性增加；和/或
[0060] (vi)MLSl活性增加；和/或
[0061] (vii)BASl活性降低或消除；和/或
[0062] (viii)RIB 1活性增加；和/或
[0063] (ix) RIB 2活性增加；和/或
[0064] (X) RIB 3活性增加；和/或
[0065] (xi) RIB 4活性增加；和/或
[0066] (xii) RIB 5活性增加；和/或
[0067] (xiii)RIB 7活性增加；和/或
[0068] (xiv)FATl活性增加；和/或；
[0069] (xv)POXl活性增加；和/或；
[0070] (xvi) F0X2活性增加；和/或；
[0071] (xvii)P0Tl/F0X3 活性增加；和 / 或；
[0072] (xviii)GUAl 活性增加；和 / 或；
[0073] (xix)ADE12活性降低或消除；和/或
[0074] (xx)mPDH 活性增加。
[0075] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及RIB7啟動子在降低假囊酵母屬的生物體中的至少 一種基因的表達(dá)中的用途。
[0076] 在所述用途的優(yōu)選實(shí)施方案中，RIB7啟動子包括選自以下組的核酸序列：
[0077] (a)包括根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和
[0078] (b)與根據(jù)SEQ ID No. 1的核酸序列具有至少70 %的序列同一性的核酸序列或其 功能性部分。
[0079] 在所述用途的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)被降低的基因選自adel2、shm2和 basl組成的組。
[0080] 在另一個方面，本發(fā)明涉及使用如上文所定義的生物體生產(chǎn)核黃素。
[0081] 在如上文所定義的方法、用途或生物體的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，所述屬于假囊酵 母屬的生物體是物種阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyi)，榛針孢酵母（Eremothecium coryli)，Eremothecium cymbalariae，棉假囊酉孝母，Eremothecium sinecaudum 或假囊酉孝母 屬物種CID1339。
[0082] 附圖的簡要說明
[0083] 圖1繪示了靶向核黃素（維生素 B2)的代謝通量。核黃素是從脂肪酸通過乙醛酸 循環(huán)，糖異生，戊糖磷酸途徑以及嘌呤和核黃素合成途徑來生產(chǎn)（根據(jù)Kato和Park(2012) Biotechnol. Letters 34 :611-618 進(jìn)行修改）。
[0084] 圖2示出了測定在棉假囊酵母菌株ATCC10895中六個RIB基因和GPD1基因的mRNA 水平的定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)分析。測量在指數(shù)生長期（24h)和靜止期（120h)期間的 RIB基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。使用棉假囊酵母ACT1基因作為基準(zhǔn)來歸一化轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果是 一式兩份進(jìn)行的三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，并表示為靶基因的cDNA豐度相對于ACTlmRNA水 平的比率。
[0085] 圖3示出了為整合到棉假囊酵母基因組而產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體
[0086] a)為整合到棉假囊酵母基因組而產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，以便特異性地降低腺苷酸琥 珀酸合成酶的活性。
[0087] 簡稱：KanMX4,遺傳霉素抗性標(biāo)記；homA/homB，基因組整合位點(diǎn)；ΙοχΡΙ和1οχΡ2， Cre重組酶的重組位點(diǎn)；RIB7p，棉假囊酵母RIB7基因的啟動子；ADE12,編碼腺苷酸琥珀酸 合成酶的基因的5'-部分
[0088] b)為整合到棉假囊酵母基因組而產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，以便特異性地降低酶活性。
[0089] 簡稱：KanMX4,遺傳霉素抗性標(biāo)記；homA/homB，基因組整合位點(diǎn)；ΙοχΡΙ和1οχΡ2， Cre重組酶的重組位點(diǎn)；RIB7p，棉假囊酵母RIB7基因的啟動子；RIB1，編碼RIB1的基因的 5'-部分
[0090] 圖4示出了在RIB7啟動子（pRIB7)控制下，RIB1和ADE12基因在棉假囊酵母中 表達(dá)的定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)分析。為了比較，測定在指數(shù)生長期（24h)和靜止期（120h) 期間，兩種基因在它們的天然啟動子（RIB1，ADE12)控制下的表達(dá)。使用棉假囊酵母ACT1 基因作為基準(zhǔn)來歸一化轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果是一式兩份進(jìn)行的三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，并表示 為靶基因的cDNA豐度相對于ACTlmRNA水平的比率。
[0091] 圖5示出了在RIB7啟動子的控制下，在表達(dá)ADE12或RIB1的棉假囊酵母中的生物 量（空心符號）和核黃素生產(chǎn)（實(shí)心符號）的分析。作為參照，使用野生型菌株（wt)ATCC 10895。數(shù)據(jù)是一式兩份進(jìn)行的三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
[0092] 發(fā)明詳述
[0093] 本發(fā)明涉及允許通過使用屬于假囊酵母屬（先前的棉阿舒囊霉屬（Ashbya))的被 遺傳修飾的生物體來生產(chǎn)核黃素的改進(jìn)的方法和手段，所述遺傳修飾是用RIB7啟動子替 代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的至少一個基因的天然啟動子。
[0094] 雖然將針對特定實(shí)施方案來描述本發(fā)明，這種描述不應(yīng)在局限的意義上進(jìn)行解 釋。
[0095] 在詳細(xì)描述本發(fā)明示例性的實(shí)施方案之前，給出對于理解本發(fā)明重要的定義。如 在本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式"一"和"一個"也包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)形式， 除非上下文另有明確說明。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"大約"和"近似"表示本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠理解的仍確保所討論特征的技術(shù)效果的精確度的區(qū)間。該術(shù)語通常表示從所指示的 數(shù)值偏差±20%，優(yōu)選±15%，更優(yōu)選±10%，甚至更優(yōu)選±5%。但應(yīng)該理解的是，術(shù)語 "包括"不是限制性的。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"由...組成"被認(rèn)為是術(shù)語"包括"的優(yōu)選 實(shí)施方案。如果在下文中將一個組定義為包括至少某個數(shù)量的實(shí)施方案，這意味著還包括 優(yōu)選僅由這些實(shí)施方案組成的組。此外，在說明書和在權(quán)利要求中的術(shù)語"第一"，"第二"， "第三"或"（a) "，" (b) "，"（c) "，"（d) "等之類的被用來區(qū)分相似的要素并且不一定描述次 序或時序。應(yīng)當(dāng)理解的是，如此使用的術(shù)語在適當(dāng)?shù)那闆r下是可互換的并且在此描述的本 發(fā)明的實(shí)施方案能夠以除了本文描述或說明以外的其他次序來操作。如果術(shù)語"第一"，"第 二"，"第三"或"（a) "，"（b) "，"（c) "，"⑷"，" i "，" ii "等涉及方法或用途或測定法的步驟， 那么在步驟之間沒有時間或時間間隔連貫性，即步驟可以同時進(jìn)行或者這些步驟之間有可 以存在幾秒鐘，幾分鐘，幾小時，幾天，幾周，幾個月甚至幾年的時間間隔，除非在本申請中 另有說明，如在上下文中提出。但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于在此描述的具體方法，方案， 反應(yīng)試劑等，因?yàn)檫@些都可以變化。也可以理解的是，本文所使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí) 施方案的目的，并且不意圖限制本發(fā)明，其僅由所附的權(quán)利要求限定。除非另有定義，本文 使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常的理解相同的含義。
[0096] 正如上文提到的，本發(fā)明在一個方面涉及在假囊酵母屬的被遺傳修飾的生物體中 生產(chǎn)核黃素的方法，其中所述遺傳修飾是用RIB7啟動子替代編碼負(fù)面影響核黃素生產(chǎn)的 蛋白質(zhì)的至少一個基因的天然啟動子，所述方法包括：
[0097] ⑴在合適的培養(yǎng)基中生長所述生物體；和
[0098] (ii)從培養(yǎng)基分咼核黃素。
[0099] 如本文所用的術(shù)語"核黃素"指的是化合物7,8_二甲基-10-Φ-1'-核糖醇基 (ribityl)-)異咯嗪及其衍生物。術(shù)語"衍生物"指的是7,8_二甲基-10-Φ-1'-核糖醇 基_)異咯嗪的任何化學(xué)修飾形式。這樣的衍生物可以是，例如酯、醚、酸、脂質(zhì)、糖基化形式 或鹽形式。這些衍生物可以由假囊酵母屬生物體本身提供，例如在另外的生化反應(yīng)中，或可 以形成在培養(yǎng)基中，例如由存在于所述培養(yǎng)基中的反應(yīng)物提供。在具體的實(shí)施方案中，核黃 素可以以結(jié)晶形式提供。這種核黃素晶體可以典型地在細(xì)胞中累積。
[0100] 如本文所用的術(shù)語"生產(chǎn)核黃素"意指假囊酵母屬生物體能夠合成并累積核黃素。 術(shù)語"累積核黃素"意指合成的核黃素被存儲在細(xì)胞內(nèi)和/或排出到周圍介質(zhì)中，在這兩種 情況下導(dǎo)致在細(xì)胞培養(yǎng)物中的核黃素濃度的整體增加。在具體的實(shí)施方案中，累積可在合 適的分離工藝之后變得可辨別，在所述工藝中獲得由細(xì)胞產(chǎn)生的所有核黃素，即包括儲存 在細(xì)胞內(nèi)的核黃素和排出的核黃素。這樣的工藝已經(jīng)如上文所述。
[0101] 在本發(fā)明的上下文中，核黃素生產(chǎn)指的是相比假囊酵母屬的野生型菌株是核黃素 高產(chǎn)。假囊酵母屬的野生型菌株通常每升細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生約50至100mg核黃素，特別是在 如本文中定義或在實(shí)施例中的細(xì)胞培養(yǎng)條件下。如本文所用的術(shù)語"高產(chǎn)"指的是每升細(xì)胞 培養(yǎng)物的核黃素生產(chǎn)超過約50至