化。
[0018]圖3為摩爾比為1:50的生物素修飾肽段(模擬生物素化反應后體內(nèi)KmeO和Kmel肽段，40pM)和未生物素修飾肽段(模擬生物素化反應后體內(nèi)Kme2和Kme3肽段，2nM)混合物的MALD1-TOF-MS譜圖，MALD1-T0F_MS譜圖縱坐標為質(zhì)譜峰的相對強度(100% Intensity)，橫坐標為質(zhì)荷比(m/z); (A)是未富集的；(B)是經(jīng)1ul親和素瓊脂糖微球富集后得到的；(C)是經(jīng)15ul親和素瓊脂糖微球富集后得到的;*為未生物素修飾肽段，#為生物素修飾肽段;對比圖(A)、圖(B)和圖(C)可以看出，15ul親和素瓊脂糖微球能夠完全結(jié)合40pM的生物素分子，經(jīng)過富集后，生物素修飾肽段可以被選擇性除去，進而非生物素修飾肽段實現(xiàn)高靈敏質(zhì)譜鑒定。
[0019]圖4為500ugHela全蛋白中富集得到的二三甲基化修飾的肽段和蛋白數(shù)目，以及二三甲基化蛋白之間的交蓋圖。
【具體實施方式】
[0020]下面的實施例是對本發(fā)明提出的一種基于生物素修飾的甲基化肽段富集并質(zhì)譜分析方法的進一步說明。
[0021 ]實施例1，EZ_b1tin試劑對肽段N端和賴氨酸側(cè)鏈氨基的反應效率的實驗
將5mM的標準肽段(FQLTDIPAAPR，ALSNSTPQNSFSEK)母液用2%SDS，20mM HepesCPH7.4)，1mM NH4HCO3或者用PBS溶液按照 1:100稀釋成0.05禮；用2%505，201111 HepesCPH 7.4)與乙腈按照1:1的比例配制1mM EZ-b1tin，注意避光保存。取1ul 0.05mM肽段與等體積的1mM EZ-b1tin混合，37攝氏度孵育30min后立即取出置于冰上，取上清液0.8 yL點樣于MALDI靶板上，待干燥后再點樣等體積的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液，干燥結(jié)晶后進行MALD1-TOF-MS分析，結(jié)果如圖2所示。
[0022]實施例2，親和素瓊脂糖微球?qū)ι锼匦揎楇亩胃患芰Φ膶嶒?br> 用20mM NaH2PO4，0.15M NaCl (PH7.4)的緩沖液按照摩爾比為1:50配制合成的標準生物素修飾肽段(模擬生物素化反應后體內(nèi)KmeO和Kmel肽段，總量40pM)和未生物素修飾肽段混合物(模擬生物素化反應后體內(nèi)Kme2和Kme3肽段，總量2nM)，以下簡稱混合肽段;在200ul槍頭底部填上3M C18材料作為篩板，從槍頭頂部分別填入5ul，10ul以及15ul的親和素瓊脂糖微球，300g離心ImindPAlOOul 20mM NaH2PO4^0.15M NaCl(PH7.4)的緩沖液平衡，重復兩次，分別向含有填料的槍頭中加入混合肽段，300g離心lmin，取流出液反復結(jié)合三次，再加入10ul的20mM NaH2PO4,0.15M NaCl(PH7.4)的緩沖液洗滌一次，收集所有的流出液以及洗滌液，合并除鹽、凍干，取上清液0.8 yL點樣于MALDI靶板上，待干燥后再點樣等體積的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液，干燥結(jié)晶后進行MALD1-T0F-MS分析，結(jié)果如圖3所示。
[0023]實施例3，基于生物素修飾的二三甲基化肽段親和富集效果的實驗
取 500ug Hela 細胞全蛋白，加入 2%SDS，20mM HepesCPH 7.4) ,1mM NH4HCO3 配制 2ug/ul的蛋白溶液，加入等體積用2%SDS，20mM Hepes(PH 7.4)與乙腈按照1:1的比例配制1mMEZ-b1tin，注意避光保存。37攝氏度孵育30min后加入1ul IM DTT(二硫蘇糖醇，溶于25mMNH4HC03)，56°C條件下反應30 min;加入40ul的500mM IAA(碘乙酰胺，溶于25mM MMCO3JIl配現(xiàn)用)，室溫避光20分鐘，向上述反應后的蛋白溶液中加入5倍體積預冷的丙酮溶液，-20°C靜置過夜后14000rpm，4°C離心30分鐘，加入丙酮洗滌3次，以徹底去除未完全反應的EZ-b1tin試劑，最后一次吸除丙酮后，將EP管倒扣于通風櫥中，使丙酮揮發(fā)完全。向所得蛋白粉末中加入SM尿素，重懸沉淀，如有沉淀，可用槍頭輕輕吹打至完全溶解。向蛋白濃縮液中加入適量25mM NH4HCO3稀釋至尿素終濃度低于IM，按胰蛋白酶和蛋白的質(zhì)量比為1:50加入胰蛋白酶，同時加入10%ACN，37攝氏度酶解14h后補加適量胰蛋白酶，2h后加入TFA酸化終止反應，除鹽凍干后將生物素反應后的肽段重溶于10ul 20mM NaH2P04,0.15M NaCl(PH7.4)的緩沖液，向已經(jīng)平衡好的Streptavidin Beads 6FF層析柱(填料按2nmol of D-b1tin/15ul的載量填充)中緩慢加入肽段樣品，在重力作用下平衡，非生物素肽段緩慢流出，用ddH20洗滌一次，合并洗滌液和流出液，除鹽、凍干，然后進行LC-MS質(zhì)譜分析。
【主權(quán)項】
1.一種二 /三甲基化肽段富集和質(zhì)譜分析的方法，其特征在于，利用生物素化試劑(EZ-NHS-b1tin)基團能夠與未修飾(KmeO)或者單甲基化(Kmel)(記為KmeO/1)修飾的賴氨酸發(fā)生特異性反應而不會與二、三甲基化(Kme2/3)修飾的賴氨酸反應的特點，通過親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球去除KmeO/1修飾的賴氨酸肽段，對Kme 2/3修飾的賴氨酸肽段進行富集;具體步驟為: (1)蛋白生物素化修飾:基于N-羥基琥珀酰亞胺與賴氨酸側(cè)鏈氨基的高效反應，采用生物素化試劑(EZ-NHS-b1tin)，通過化學反應將生物素基團引入賴氨酸KmeO/Ι上，實現(xiàn)蛋白樣品中賴氨酸KmeO/1的高效生物素化修飾； (2)蛋白沉淀:向經(jīng)步驟(I)生物素化修飾的蛋白樣品加入丙酮，過夜，沉淀蛋白，同時去除過量的生物素化試劑； (3)蛋白酶解:向經(jīng)步驟(2)處理的蛋白中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白的質(zhì)量比1:40-60，充分混合，35-39攝氏度酶切14-16小時，使蛋白完全酶解成氨基酸長度在10-20之間的的肽段； (4)親和素去除生物素修飾肽段:用緩沖液稀釋肽段至1-1.5ml，用親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球為吸附劑，利用親和素和生物素之間的高親和能力，將生物素化的KmeO/Ι吸附到親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球上，親和吸附過程在2-6攝氏度條件下進行，時間2-4小時，充分去除發(fā)生生物素修飾的KmeO/Ι修飾肽段； (5)質(zhì)譜分析:600-1200g離心后取上清，通過除鹽柱富集上清中的肽段，凍干，然后進行質(zhì)譜檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述蛋白樣品用緩沖液提取細胞全蛋白得到，蛋白樣品濃度為lug/yL~ 5ug/yL;所述采用生物素化試劑(EZ-NHS-b1tin) ， 通過化學反應將生物素基團 引入賴氨酸KmeO/Ι上，是在蛋白樣品中，加入5-30mM的碳酸氫氨，同時加入等體積5-30mM的EZ-NHS-b1tin，在35-39攝氏度下避光混合，使樣品中的KmeO/1修飾的賴氨酸被充分被生物素化。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中蛋白沉淀的操作過程為:在向所述蛋白樣品中加入5-10倍體積的預冷丙酮，-10-30攝氏度過夜；11000-15000g離心20-40分鐘后得到蛋白沉淀，用預冷丙酮洗2-4次，完全去除生物素化試劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，先用6-10M尿素重溶步驟(2)中得到的蛋白沉淀用緩沖液稀釋至0.5-2M尿素;然后加入胰蛋白酶，進行酶解。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，瓊脂糖微球材料與所富集肽段的體積質(zhì)量比為50-200ul/lmg。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，先對親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球用緩沖液進行清洗，重復2-3次。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)的操作過程為:合并步驟(4)中所得到的上清和清洗液;然后除鹽、凍干;再重溶于0.05-0.2%FA中；最后進行LC-MS/MS分析。
【專利摘要】本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析技術(shù)領域，具體為一種二/三甲基化（Kme2/3）修飾肽段富集和質(zhì)譜分析的方法。本發(fā)明方法包括：對蛋白上未修飾（Kme0）或者單甲基化（Kme1）修飾的賴氨酸進行衍生化使其帶上生物素標記，再將蛋白酶解成肽段后，再加入親和素偶聯(lián)的瓊脂糖微球，通過生物素和親和素之間的高特異和高親和作用，除去Kme0/1肽段，在上清中保留Kme2/3修飾肽段，最后利用除鹽柱捕獲上清中的肽段，送入質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析Kme2/3修飾肽段。本發(fā)明方法首次實現(xiàn)對Kme2/3修飾肽段的化學富集，能顯著地提高Kme2/3修飾肽段的分析質(zhì)譜選擇性，并且具有特異性強、重現(xiàn)性好、步驟簡單、操作方便等特點。
【IPC分類】G01N27/62, C07K1/22
【公開號】CN105693816
【申請?zhí)枴緾N201610151772
【發(fā)明人】陳佳佳, 胡亞君, 徐瑩, 金紅, 楊芃原
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年3月17日