變異豬流行性腹瀉病毒弱毒yn150株及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株YN150株及其應用。本發(fā)明弱毒株是由毒株YN144(微生物保藏號是：CCTCC V201547)在10μg/mL胰酶的條件下在Vero細胞上連續(xù)傳6代得到的。本發(fā)明PEDV弱毒株來源于變異豬流行性腹瀉病毒，其安全性好，對妊娠母豬、育肥豬和仔豬等各年齡豬均安全。本發(fā)明的疫苗可以刺激豬產生抵抗變異豬流行性腹瀉病毒的保護性免疫反應，有效防止變異豬流行性腹瀉病毒的感染。CCTCC NO：V20154720151110
【專利說明】
變異豬流行性腹瀉病毒弱毒YN150株及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及變異性豬流行腹瀉病毒弱毒株，具體地指一種變異豬流行性腹瀉病毒 弱毒YN150株及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸傳 播性疾病。豬在感染PEDV以后，常引起仔豬的急性腸炎及致命性水瀉直至脫水死亡，其臨床 特征主要表現(xiàn)在仔豬嘔吐、嚴重腹瀉和脫水;PH)V感染豬，剖檢病理變化主要表現(xiàn)為豬的空 腸和回腸部分的腸絨毛的萎縮和脫落(Pensaert MB et al.，2006)。各年齡階段的豬均易 感，但主要影響哺乳仔豬，發(fā)病率100%，死亡率80%~100%(Timoney JF et al.，1988)， 給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經濟損失(Song D et al.，2012)。豬流行性腹瀉的疫苗主要分為 基因工程疫苗，滅活疫苗和弱毒疫苗等。其中，弱毒疫苗因其可以口服進而誘發(fā)有效地黏膜 免疫應答，免疫效果良好，成本低廉而備受關注。
[0003] PEDV弱毒疫苗是通過將PEDV在Vero細胞上連續(xù)傳代得到的。1999年，韓國學者通 過將臨床分離的PEDV毒株KPEDV-9在Vero細胞上連續(xù)傳93代，得到該毒株的致弱毒株，通過 將此弱毒株口服接種母豬和小豬能夠大大提高母豬的抗體水平和仔豬的成活率，并且沒有 觀察到明顯的臨床癥狀，因此KPEDV-9弱毒株可以作為疫苗來預防PED(Kweon CH et al.， 1999)。2007年，韓國學者通過將臨床分離株DR13在Vero細胞上經過傳100代得到致弱的 DR13,試驗證明致弱的DR13對豬具有很高的保護率，并且在豬體內經過三代的傳代，毒力也 沒有增強。同時他們發(fā)現(xiàn)此致弱毒通過口服比肌注效果更好，因為口服疫苗后的仔豬的死 亡率相對于肌注的要低，并且抗體水平要高的多（Song DS et al.，2007)，該疫苗是韓國用 于預防PH)的口服疫苗。中國學者佟有恩等人通過將CV777毒株在Vero細胞上傳代125代后， 獲得了CV777弱毒株，臨床試驗表明，弱毒株的毒力顯著下降，接種仔豬后，仔豬能夠有效地 抵抗強毒感染，并且該弱毒株在豬體內傳了 6代，也沒有見到毒力的返強，區(qū)域性的臨床試 驗表明此毒株的免疫原性和安全性都很好(佟有恩等，1998)。1999年，佟有恩等在以前的 工作基礎上，又研發(fā)出了TGEV和PEDV的二聯(lián)弱毒苗，經過臨床試驗，二聯(lián)弱毒苗的主動免疫 和被動免疫的免疫保護率分別為97.7 %和98%，高于二聯(lián)滅活疫苗的免疫保護率，免疫劑 量也比滅活疫苗低，顯示了弱毒疫苗的優(yōu)勢(佟有恩等，1999)。
[0004] 近年來，弱毒疫苗成為了研究的熱點，其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：
[0005] ⑴抗原遞呈的有效性，尤其是口服或滴鼻免疫時，效果更佳；
[0006] ⑵可產生特異性細胞毒性T細胞殺傷反應(CTL效應）；
[0007] ⑶可以激發(fā)黏膜和系統(tǒng)免疫反應。以弱毒疫苗經口服或滴鼻的方式免疫后，可以 直接將外源抗原運載至機體的黏膜相關淋巴組織(MALT)，從而激發(fā)機體的黏膜和系統(tǒng)免疫 反應;存在于血清中PEDV IgG不能提供保護，注射免疫并不能產生母源抗體，只有腸道黏膜 免疫所產生的分泌型抗體(SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔豬通過初乳來獲得母源SIgA，從而 產生對流行性腹瀉的被動免疫保護，這種免疫效果確實、保護率也最高。
[0008] ⑷免疫具有持續(xù)性，減毒疫苗提供長期的免疫保護，從而不需反復多次地加強免 疫也可長期地激發(fā)機體的免疫應答反應；
[0009] (5)接種方式簡便，易于操作，適于群體免疫，且安全性好。
[0010] 1971年在英國首次報道PED，其臨床癥狀類似豬傳染性胃腸炎(TGE)，被命名為病 毒性腹瀉(EVD); 1976年在歐洲其他國家報道該病流行。直到1977年在比利時第一次分離 至丨J，證實該病毒是冠狀病毒，命名為豬流行性腹瀉病毒(PEDV)(Pensaert MB et al.，1978; Wood EN，1977b)。在歐洲各國，PED較以前的流行程度已明顯降低，泰國于2007年出現(xiàn)大流 行，新生仔豬死亡率達100 %。在中國近幾年來，PH)在我國廣泛流行。2005年至2007年間，哈 爾濱獸醫(yī)研究所對國內部分省市豬場腹瀉病例做了一項調查，結果顯示:PED病例占46%， 是我國仔豬腹瀉的主要病因（甘振磊等，2010)。華中農業(yè)大學張坤、劉云波分別在2009年1 月~2010年2月和2011年4月~2012年4月對全國部分省市做了流行病學調查，發(fā)現(xiàn)PED仍在 仔豬腹瀉中占主導地位(張坤等，2010;劉云波等，2013)。從2010年冬季開始，我國南方省市 大部分豬場大規(guī)模爆發(fā)PED流行，且迅速蔓延至全國（Chen JF et al.，2012;Li ZL et al.，2012;Sun RQ et al 2012)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。在我國流行的PED的主要特 征哺乳仔豬的高死亡率，臨床癥狀主要是嚴重的腸炎、嘔吐、水樣腹瀉、脫水和體重減輕。 2011年我國生豬產業(yè)特別是華南地區(qū)損失了一百多萬頭仔豬，造成了巨大的損失(Sun RQ et al.，2011)。2011年末，本實驗首先報道了本次豬流行腹瀉病是由變異的豬流行性腹瀉 病毒引起的(Wen TL.，2011)，北美之前一直沒有豬流行性腹瀉病的報道，但是2013年5月之 后美國首次發(fā)現(xiàn)并報道了豬流行腹瀉病毒的感染，之后該疫情迅速蔓延到美國境內的33個 州，造成了巨大的經濟損失，通過對病原的測序和比對，發(fā)現(xiàn)病原和我國安徽毒株的核苷酸 同源性最高。其他的美洲國家，比如加拿大、墨西哥、古巴、哥倫比亞、阿根廷等先后報道了 豬流行腹瀉病疫情。韓國，菲律賓、泰國等東南亞國家也報道了豬流行性腹瀉病疫情，甚至 許多歐洲國家的生豬產業(yè)都受到豬流行性腹瀉病的巨大沖擊，比如德國、英國、法國、比利 時、荷蘭、瑞士等。之后楊漢春等報道了變異毒株在我國發(fā)病豬場中占主導地位，并且現(xiàn)有 的來源于CV777毒株的疫苗不能對變異PEDV毒株PED起到足夠的保護能力(Gao Y et al.， 2013)。2013年8月本實驗室分離到一株變異毒株YN1 (GenBank NO. : KT021227)，經過Vero細 胞上傳代，獲得了一種來源于變異毒株的弱毒毒株YN144(GenBank NO. :KT021232)(Chen FZ et al.，2015)，經實驗證明該毒株安全性和對變異毒株引起的TOD有很好的保護性 (WuMZet al.,2016)〇
[0011] PEDV粒子形態(tài)特征與冠狀病毒科其它成員的很相似(Chasey et al. ,1978)，纖突 糖蛋白（S蛋白）、膜糖蛋白(M蛋白）和包膜糖蛋白（E蛋白）分布于病毒粒子的表面;核衣殼蛋 白（N蛋白）位于病毒粒子內部，PEDV的核衣殼結構是由N蛋白與基因組RNA相互作用而形成 的，這使得PEDV與傳染性胃腸炎病毒在形態(tài)學上很難區(qū)別(Pensaert et al. ,1982)。目前 為止，研究發(fā)現(xiàn)PEDV只存在一個血清型(Witte et al. ,1981)。
[0012] S基因是PEDV的多功能的結構基因，負責結合病毒受體、誘導產生中和抗體以及宿 主細胞融合，S基因是PEDV毒株毒力和進化的特征性基因。已有報道通過S基因構建的進化 樹能將PEDV毒株分為兩個基因型，即G1和G2。其中G1是由變異毒株組成的，G2是有經典的 PEDV毒株，以及經典PEDV衍生的疫苗毒株組成的。S基因的長度約4.2kb，進行全長測序較為 困難，已有報道S基因的N端，即S1基因變異性最大，由S1基因構建的進化樹和S基因全長構 建的進化樹的一致，因此本實驗依據(jù)前期已經設計的兩對引物對S1基因進行測序，以期了 解病原的核酸變異特征。0RF3基因是PEDV的唯一的附屬基因，和離子通道密切相關，現(xiàn)在商 品化的來源于CV777毒株或DR13毒株的弱毒或滅活疫苗的0RF3都有49bp的核苷酸缺失，通 過對0RF3基因的測序能更好了解我們檢測到的毒株是臨床野毒株還是疫苗毒株。
[0013]國內外常用的預防PED發(fā)生的方法是免疫預防，主要是以疫苗免疫預防為主。目 前，PED商業(yè)化的疫苗主要是滅活苗和弱毒苗兩種，其中弱毒疫苗主要是來之經典毒株 CV777的致弱疫苗，這兩種疫苗各自有自己的優(yōu)點。返飼在一段時間很流行，主要的做法是 將PEDV感染豬的糞便或發(fā)病仔豬的腸內容物制成自家苗，人工感染妊娠母豬，刺激產生母 源抗體，仔豬吮乳后，獲得保護，降低死亡率和縮短PH)流行時間，但現(xiàn)已證實該方法的害處 大于益處，容易散毒，而且產品質量和批次間的差異無法很好的把控。滅活疫苗具有安全、 穩(wěn)定的優(yōu)點，但同時由于滅活疫苗具有需要大劑量接種或者應用濃縮抗原;免疫期短，常需 強化接種;不能引起局部免疫，以致細胞免疫的作用弱;產生完全免疫力需要2周;不利于緊 急預防接種與降低疫苗費用等缺點，促進了PED弱毒疫苗的研制。目前，PED的商品化弱毒疫 苗主要有我國的CV777株，日本的P-5V株和韓國的KPED-9株、DR13株。1993年佟有恩研究員 等將適應Vero細胞的CV777株從90代起進行克隆純化，目的是穩(wěn)定減弱的毒力并保持良好 的免疫原性。克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主動免疫與被動免疫的保護率分別達 到95.9%及96.2%。哈爾濱獸醫(yī)研究所基于CV777弱毒株已開發(fā)PED-TGE二聯(lián)弱毒苗；福建 省生物藥品廠同中國農業(yè)大學合作開發(fā)TGE-PED-RV三聯(lián)弱毒苗，認為這3種病毒組織嗜性 相同，所以研制多聯(lián)苗是可行的。然而2006年我國報道的PED疫苗免疫豬場不能提供完全的 保護(Chen JF et al.，2010)，以及近期的研究發(fā)現(xiàn)我國變異毒株占主導地位(Gao Y et al.，2013)，在中國，用來預防豬流行性腹瀉的活疫苗毒株主要是CV777疫苗毒株。2011年由 豬流行性腹瀉變異毒株引起的腹瀉在CV777弱毒活疫苗免疫豬場暴發(fā)，表明傳統(tǒng)CV777弱毒 疫苗免疫已經不能有效地預防變異毒株所造成的腹瀉，而當今變異毒株引起的PED在世界 范圍類肆掠，所以通過PEDV臨床分離到的變異毒株開發(fā)安全、高效、廉價的變異毒株來源的 PEDV弱毒疫苗是世界養(yǎng)豬業(yè)的迫切需要。

【發(fā)明內容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提供了一種變異豬流行性腹瀉病毒弱毒YN150株及其應用。
[0015] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種變異豬流行性腹瀉病毒弱毒YN150株，所述 YN150株是由毒株YN144在1 Oyg/mL胰酶的條件下在Vero細胞上連續(xù)傳6代得到的，其中，毒 株YN144的保藏號為:CCTCC V201547JN150株的全長序列如SEQ ID No.l所示。
[0016] 變異豬流行性腹瀉病毒弱毒YN150株的獲得說明：
[0017] 從云南省某豬場送檢的仔豬小腸病料中成功分離到一株豬流行性腹瀉病毒。將分 離毒株進行全基因組測序，鑒定分離的毒株為變異豬流行性腹瀉病毒。
[0018] 將分離到的變異豬流行性腹瀉病毒在Vero細胞上連續(xù)傳代120代，然后通過克隆 純化繼續(xù)在Vero細胞上傳代至144代，命名YN144，即豬流行性腹瀉病毒弱病毒PEDV-YN144， 將該毒株于2015年11月10日送交位于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中 心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC N0:V201547,然后在10yg/mL胰酶的條件下在Vero細 胞上連續(xù)傳6代得到的YN150。從30代開始在0RF3基因433bp處有1個堿基的缺失，造成了 0RF3蛋白的提前終止，S蛋白在144-145aa處有兩個氨基酸的缺失，這些特點在60代，90代， 120代，144代和150代毒株都穩(wěn)定存在。
[0019] 致弱實驗表明，從60代開始，變異PEDV對仔豬失去致病性;將PEDV YN150在豬體內 連傳5代，沒有任何毒力返強現(xiàn)象。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種利用YN150株制備變異豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗的方 法，包括以下步驟：
[0021] 1)培養(yǎng)病毒YN150株的毒價達到106'QTCID50)/mL，
[0022] 2)將變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株YN150與牛奶保護劑按照體積比：6~9:1混合 (優(yōu)選為7:1);于滅菌凍干瓶中按2. OmL/瓶分裝，置-50°C冷凍干燥機中凍干，凍干36-40h后 壓蓋，確保沒有雜菌污染，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0023]進一步地，所述活疫苗中，變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株YN150株的含量1 X 106~ 2X106TCID5〇/mL〇
[0024]本發(fā)明還提供了一種變異豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗在預防新型豬流行性腹 瀉中的應用。
[0025] 本發(fā)明原理
[0026] 本研究運用分離到的變異PEDV毒株運用Vero細胞傳代致弱PEDV的方法，獲得一種 變異PEDV弱毒YN150株，區(qū)域性的臨床試驗表明此毒株對變異毒株引起的PED的免疫原性和 安全性都很好，該毒株已經致弱，免疫豬后產生抗體，對豬安全無害，對人和植物無害，對 環(huán)境沒有污染。變異PEDV毒株引起的PED在世界范圍內肆掠，所以本疫苗有極為廣闊的應用 前景。我國豬病毒性腹瀉病很嚴重，且混合感染情況普遍，因此本疫苗還為豬腹瀉病的多聯(lián) 苗研制打下了很好的基礎。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于：
[0028] 1、本毒株來源于變異的PEDV。
[0029] 2、本毒株為弱毒活疫苗，能通過口服給藥，便于機體產生黏膜免疫。
[0030] 3、本毒株變異特征明顯，能與其他毒株進行區(qū)分。
[0031] 4、本發(fā)明所研制的疫苗，與現(xiàn)有的滅活苗和弱毒苗相比，具有制備過程簡單、省 時，且易于儲存運輸?shù)奶攸c，顯著降低了疫苗的制作成本且免疫效果更為確切。
[0032] 5、本發(fā)明的弱毒株疫苗，在S基因和0RF3基因處都有缺失，臨床使用安全性很高， 符合疫苗生物安全性要求。
[0033] 6、本疫苗能很好的保護動物免受變異毒株的感染，我國豬病較為復雜，本發(fā)明毒 株還可應用于制備成單苗或聯(lián)苗等，為后續(xù)的三聯(lián)疫苗的研制打下了堅實的基礎。
[0034]本發(fā)明PEDV弱毒株來源于變異豬流行性腹瀉病毒，其安全性好，對妊娠母豬、育肥 豬和仔豬等各年齡豬均安全。本發(fā)明的疫苗可以刺激豬產生抵抗變異豬流行性腹瀉病毒的 保護性免疫反應，有效防止變異豬流行性腹瀉病毒的感染。
【附圖說明】
[0035] 圖1A:正常的Vero細胞對照。
[0036] 圖1B:病毒感染引起的CPE。
[0037]圖2A:未接毒PEDV的Vero細胞間接熒光免疫對照。
[0038]圖2B:感染PEDV的Vero細胞的間接熒光免疫陽性結果。
[0039]圖3:PEDV的透射電鏡照片。
[0040] 圖4:￥價、￥價5、￥呢0、￥價44和丫磯50的病毒滴度。
[0041 ]圖 5: YN1、YN15、YN60、YN144 和 YN150 的一步生長曲線。
[0042] 圖6:感染YN15、YN144和對照組的免疫組化打分結果。
[0043] 圖7:經典和變異弱毒株和相應的強毒野毒株相比各個蛋白變化的具體位置，其中 pair A為DR13疫苗毒株和DR13比較的結果，pair B為YN144和YN1比較的結果。
[0044] 圖8:不同免疫組IgA水平比較。
[0045] 圖9:不同免疫組IgG水平比較。
[0046] 圖10:不同免疫組中和抗體水平比較。
[0047]圖11:不同免疫組仔豬存活率比較。
[0048]圖12:不同免疫組仔豬情況比較。
【具體實施方式】
[0049] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的主要內容，但 本發(fā)明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0050] 實施例1病料的采集和處理
[0051] 病料采自云南省某免疫了豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉滅活苗但爆發(fā)PED豬場 死亡的3日齡仔豬的小腸，經RT-PCR檢測豬流行性腹瀉病毒。仔豬小腸按1:9(體積比）加入 生理鹽水，搗碎、反復凍融兩次，離心，2000r/min，4°C，15min，收集上清，并按每毫升加入 青、鏈霉素各1500單位，放4°C冰箱中過夜，然后再離心，10000r/min，4°C，15min，取上清，用 0 ? 22mi的濾器過濾，保存于-80 °C冰箱。
[0052]實施例2病毒的分離和鑒定
[0053]病毒分離從-80 °C冰箱中取出用做感染細胞的樣品，并在溶液中按50yg/mL加入胰 酶，放入37 °C培養(yǎng)箱中處理30min，最后按每管lmL分裝于不同的1.5mL滅菌的EP管中備用。 取生長狀況良好的Vero單層細胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS液清洗單層細胞2次。按照25cm 2培養(yǎng) 瓶中加入lmL處理好的用于感染的病料樣品，并按10yg/mL的終濃度加入胰酶，在37°CC02培 養(yǎng)箱內吸附lh，其間輕搖1次，同時設立正常細胞作為對照。棄去吸附液(第二代以后的吸附 液可以不棄去），并補充加入含1 〇yg/mL終濃度胰酶的DMEM維持液（不含血清）5mL，37 °C培 養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察接種病毒后24h和48h的Vero細胞的病變情況。連續(xù)傳六代后，病變 穩(wěn)定（圖1)。測定TCID 5Q，按照Reed-Muench法計算毒價。RT-PCR方法，擴增M基因、S基因和 0RF3基因，根據(jù)擴增產物大小和序列測定，其中擴增的M基因主要用于PEDV的鑒定，其S基因 與CV777(GenBank登錄號:KT323979)S基因相比，在S基因N端長9bp(包括15bp的插入和6bp 的缺失），判定該毒株為變異毒株，與CV777毒株(GenBank登錄號:AF353511)相比，PEDV毒株 在0RF3基因245-293bp處有49bp的缺失，判定該毒株為疫苗毒株，所使用的引物如下（表 1) 〇
[0054] 表1用來檢測PEDV以及對S和0RF3基因測序的引物
[0056]間接免疫熒光試驗方法，用適量的PEDV病毒接種于Vero細胞，培養(yǎng)12h后，以未接 種病毒的細胞為陰性對照，用本實驗制備的單抗作為一抗，用SouthernBiotech公司的FITC 標記的羊抗鼠抗體作為熒光二抗，進行間接免疫熒光試驗。成功鑒定PEDV(圖2)。
[0057] 投射電鏡觀察，細胞病變約70%后收細胞培養(yǎng)物，12000印111離心5111111去細胞碎片 后，取上清經27000rpm離心2h，使用透射電鏡觀察該病毒的形態(tài)大小，特別是特征性的放射 冠（圖3)。
[0058]實施例3病毒的傳代致弱
[0059]用無血清的DMEM洗培養(yǎng)了24小時的大概長成80%融合的Vero細胞2次，按上面分 毒的方法接種〇. 1M0I的YN1，維持液為含胰酶濃度為8yg/mL的DMEM。當約36h時，細胞病變達 到85%的時候收毒，將病毒儲存于-80°C的冰箱中。將該收集的病毒反復凍融三次后進行連 續(xù)傳代。
[0060]實施例4病毒的生物學特征
[0061 ] ￥附、￥附5、￥冊0、￥附44和￥附50的生長特性，將￥附，￥附5，￥冊0，￥附44和￥附50的毒 種10倍稀釋，接種96孔板，按照Reed Muench方法測定這些毒株的毒價，以（PFU)/mL為單位 進行表達。然后將0.1M0I的￥附、￥附5、￥冊0、￥附44和￥價50接種12孔板，每隔6小時收集一個 孔的樣品于_80°C冰箱，直到接毒后36h，通過測定TCID 5Q的方法來制作這些毒株的一步法生 長曲線。￥附、￥附5、￥冊0、￥附44和￥價50的病毒滴度分別是4.21(^10、6.81(^10、7.21(^10、 7 ? 61oglOPFU/mL和7 ? 51oglOPFU/mL(圖4)。
[0062] 一步生長曲線結果顯示YN1和YN15在接毒12、18、24、30和3611的病毒滴度分別為 2.21ogl0、3.41ogl0、3.81ogl0、4.21ogl0、3.91ogl0PFU/mL和4.51ogl0、5.81ogl0、 6.51ogl0、6.81ogl0、61ogl0PFU/mL，YN60、YN144 和 YN150 在接毒 12、18、24、30 和 36h 的病毒 滴度分別為5.01ogl0、6.61ogl0、7.21ogl0、6.41ogl0、5.51ogl0PFU/mL;6.01ogl0， 7.61ogl0、6.91ogl0、5.51ogl0、4.01ogl0PFU/mI^P5.91ogl0、7.51ogl0、6.71ogl0、 5.31(^10、4.01(^10??1]/111匕￥附，￥價5，￥冊0，￥價44和￥附50最高的病毒滴度分別是在接毒 后 30h4 ? 21oglOPFU/mL，在接毒后 30h6 ? 81oglOPFU/mL，在接毒后 24h7 ? 21oglOPFU/mL，在接 毒后 18h7 ? 61oglOPFU/mL，和在接毒后 18h7 ? 51oglOPFU/mL(圖5)。
[0063] 實驗結果顯示同原始毒株YN1相比YN15、YN60、YN144和YN150毒株的毒價越來越 高，而且達到最高毒株的時間越來越短。這些結果顯示，與原始毒株YN1相比，YN15、YN60、 YN144和YN150毒株核苷酸和氨基酸的改變使這些毒株更加適應細胞培養(yǎng)了。
[0064] 實施例5YN15和YN150的毒力實驗
[0065] 12頭PEDV、TGEV和RV陰性的10天大的仔豬用來評估YN15和YN150的毒力。這12頭仔 豬被隨機分為三組，每組4頭仔豬，這3組的仔豬分別口服2mL的10 5TCID5Q)/0.1mL的YN15毒 株，YN150毒株和DMEM。病毒感染后的第一天和第五天收集每只仔豬的糞拭子，用本實驗室 的多重RT-PCR方法檢測PEDV，每天觀察這些豬只的臨床癥狀。接毒5天后對這些仔豬進行剖 殺，取腸道樣品，運用免疫組化方法觀察病毒的定植情況。免疫組化方法如下所示：
[0066] 組織切片的制作：
[0067]將多聚甲醛固定好的組織進行處理，然后經過系列濃度的酒精脫水，再用二甲苯 透明，石蠟包埋。具體如下：
[0068] (1)75%的酒精，脫水過夜；
[0069] (2)85% 的酒精，脫水 lh;
[0070] (3)90% 的酒精，脫水 lh;
[0071] (4)%% 的酒精 I，脫水 lh;
[0072] (5)95%的酒精II，脫水lh;
[0073] (6)100% 的酒精 I，脫水 lh;
[0074] (7)100%的酒精n，脫水lh;
[0075] (8)100% 的酒精 m，脫水 lh;
[0076] (9)100% 的酒精 IV，脫水 lh;
[0077] (10)水楊酸甲酯透明，過夜；
[0078] (11)石蠟1浸蠟0.511;
[0079] (12)石蠟11浸蠟0.511;
[0080] (13)石蠟111浸蠟0.511;
[0081] (14)包埋，修理臘塊
[0082]對處理好的臘塊進行切片，厚度4wii或5wii，于溫水中漂浮展平，載玻片撈起后烘 干，保存使用。
[0083] 免疫組化：
[0084] (1)對石錯切片進行二甲苯脫錯I脫錯lOmin，二甲苯n脫錯lOmin;
[0085] (2)梯度酒精水化（100 %的酒精13min; 100 %的酒精II 3min; 90 %的酒精3min; 80%的酒精3min; 70%的酒精3min);
[0086] (3)將切片置于PBS緩沖液中漂洗3次，每次5min;
[0087] (4)然后再使用10%的H2〇2-甲醇溶液于室溫中避光孵育30min，用于消除組織中的 內源性過氧化物酶的影響，置于PBS緩沖液漂洗3次，每次5min;
[0088] (5)進行抗原修復:切片置于枸櫞酸鈉緩沖液中（濃度為O.Olmol/L)，微波爐煮沸 20min，自然冷卻至室溫；
[0089] (6) PBS緩沖液中漂洗3次，每次5min;
[0090] (7)切片上滴加5%BSA于37°C封閉30min;
[0091] (8)傾去血清(盡量除盡），滴加已優(yōu)化好條件的一抗（1:100稀釋），設立陰性對照 (PBS代替一抗），置于濕盒，于4°C過夜；
[0092] (9)次日取出，于37°C，45min，置于PBS緩沖液漂洗3次，每次5min;
[0093] (10)于切片上滴加羊抗鼠IgG二抗(使用HRP標記），置于37°C，20min;
[0094] (11)置于PBS緩沖液漂洗3次，每次5min，風干后滴加SABC，置于37°C，30min;
[0095] (12)置于1 %-2 %的吐溫PBS緩沖液漂洗3次，每次5min，然后純PBS緩沖液漂洗3 次，每次5min;
[0096] (13)使用DAB顯色，于顯微鏡下控制顯色時間；
[0097] (14)顯色好的切片用清水沖洗，用蘇木素復染，控制復染時間，一般10-30S;
[0098] (15)清水沖洗切片，經梯度酒精脫水(75%的酒精3min;80%的酒精3min;95%的 酒精3min; 100% 的酒精I3min; 100% 的酒精 II 3min; 100% 的酒精m3min);
[0099] (16)二甲苯I透明lOmin，二甲苯II透明lOmin，使用中性樹膠封片；
[0100] (17)顯微鏡下觀察判定結果，陰性時細胞不著色，陽性細胞呈現(xiàn)棕黃色。
[0101]實驗結果顯示，YN15感染組的仔豬臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，感染后1天和5天時糞拭 子能檢到PEDV，剖檢可見小腸有典型的粘液性和黃色水樣堵塞物。IHC結果顯示病毒定植情 況嚴重。YN150和對照組的豬只情況類似，臨床都沒有腹瀉癥狀，感染后1天和5天時糞拭子 不能檢到PEDV，剖檢可見小腸情況較為正常。IHC結果顯示YN150有病毒的定植，但是定植情 況并不嚴重。YN15、YN150和對照組的IHC得分如下圖所示（圖6)。
[0102]實施例6不同代次毒株的基因組測定和基因組序列特點分析：
[0103] 基因組RNA的提?。?br>[0104] 取200yL ￥價、￥附5、￥吧0、￥冊0、￥船0、￥附44和￥價50的病毒培養(yǎng)液于1.511^無1?祖 酶的EP管中，加入lmL的TRIzol，劇烈振蕩，室溫于超凈工作臺中靜置5min;再加入200yL氯 仿，劇烈振蕩混勻，使白色沉淀溶解，于冰上靜置5min; 12000rpm4°C離心10min;小心吸取上 清液轉移至另一新的1.5mL的EP管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻，冰上靜置 lOmin; 12000rpm 4°C離心10min;小心棄去上清，緩緩的沿管壁加入75%的乙醇11111^，輕輕上 下顛倒洗滌管壁，12000rpm 4°C離心5min，棄去乙醇；室溫干燥2-5min，加入適量的RNase-free H20溶解沉淀，即為病毒總RNA，立即進行反轉錄或-80°C保存?zhèn)溆?。病毒的全基因組測 序，參照文獻報道的方法(Pan YF.，2012)，采用覆蓋全長的12對引物擴增，結合末端測序 方法，擴增的12條片段連接pMD-18T后，挑選陽性克隆送南京金斯瑞公司進行測定，所得序 列通過MEGA5.05進行拼接，獲得全序列，￥~1、￥~15、￥似0、￥_0、￥_0和￥~144已上傳 GenBank，GenBank的登錄號分別為KT021227到KT021233，YN150的全基因組序列如序列附 件。
[0105]結果顯示和原始毒株YN1相比，后面的毒株有很多同意突變意義突變以及核苷酸 的缺失。YN15和YN1相比基因的變異性最大，很可能是該階段是病毒從體內增殖到體外傳代 的跨越式的進程的結果。與YN1相比￥附5，￥似0、￥冊0、￥冊0、￥附44和￥附50氨基酸的改變個 數(shù)分別為15、20、22、25、33和36<^附50與￥價相比有36 &&的改變，這其中在非結構開放閱讀 框0RF1 a/b有8個氨基酸的改變，占總改變數(shù)目的22.2 %，8/36，而該區(qū)域占整個基因組的 7 2.6 %。2 8 a a在結構蛋白改變，占總改變數(shù)的7 7.8 %，而該區(qū)域只占基因組的2 7.4 %。在結 構蛋白，S蛋白的突變數(shù)占總突變數(shù)的36.1 % (13/36)。特別從YN30之后所有的毒株在S蛋白 的144aa，145aa，和1197都有3個氨基酸的缺失。并且YN15以及之后的毒株都在0RF3基因有 一個核苷酸的缺失，導致了該蛋白的在145aa的提前終止。0RF3蛋白在終止之前在138aa到 145aa有8個aa的改變。各個基因的突變比率如表3所示。分析具體的氨基酸突變位點如圖7 所示。
[0106]表2不同代次變異毒株和原始毒株YN1在氨基酸水平上的差異
[0109]表3不同代次病毒和原始毒株YN1相比基因氨基酸的變化數(shù)目以及比率
[0111] *括號外面為氨基酸改變的數(shù)目，括號里面為氨基酸改變比率，其單位為％。
[0112] 表4經典的和變異的臨床野毒株以及相應的弱毒株的基因組變化特點對比
[0114] 實施例7病毒弱毒苗的制備
[0115] -種變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株YN150的弱毒疫苗，其特征包括，該疫苗含有權 利要求1所述的變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株YN150,使病毒的毒價達到lOWTCID^/mL，按 照體積比，變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株YN150與牛奶保護劑(牛奶保護劑配制方法：）比例 為7:1。于滅菌凍干瓶中按2. OmL/瓶分裝，置-50°C冷凍干燥機中凍干，凍干36-40h后壓蓋， 確保沒有雜菌污染，置于_20°C保存?zhèn)溆茫鳛檠兄浦亟M疫苗的疫苗菌株。
[0116] 實施例8病毒抗體檢測技術IgG和IgA ELISA方法的應用
[0117] 待檢材料的預處理，采集新鮮母豬乳汁，于4°C，10000rpm/min離心5min，棄去上層 乳脂層，用滅菌槍頭小心吸取中間層的乳清，注意不要將底部的乳汁沉淀部分吸出。乳清部 分可以直接稀釋用于抗體檢測。待檢樣品長期放置需-80°C分裝保存。
[0118] 免疫熒光試驗檢測乳汁中的IgA抗體，將Vero細胞在75m2細胞瓶中培養(yǎng)，待長滿單 層后，使用15mLDMEM生長液(含10 %的四季青新生牛血清）輕輕吹打，將吹散的細胞懸液加 入DMEM生長液80mL，200yL/孔，加入96孔細胞板中，在37 °C，5 % C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長 成單層后，每孔接入200TCID5QPEDV病毒液，lOOyL/孔，再加入MEM細胞維持液lOOyL/孔，同時 設兩列不接毒的空白對照組。每隔6h觀察細胞病變情況。待細胞剛出現(xiàn)病變時，棄去96孔細 胞培養(yǎng)板中的DMEM維持液。用PBS液洗滌，200yL/孔，搖床搖動5min，甩干，重復3次。加入-20 °C取出的冷乙醇，100此/孔，然后放入-20 °C冰箱，固定30min。洗滌同上，將96孔板自然晾 干。分別將免疫母豬乳清及未免疫母豬乳清做1:10倍稀釋，l〇〇yL/孔，加入96孔板，各做2孔 重復;在37 °C恒溫箱孵育30min。用roS溶液洗滌，200yL/孔，搖床搖動5min，甩干，重復3次。 加入1:60倍稀釋的FITC兔抗豬IgA熒光二抗，在37°C溫箱孵育30min。洗滌同上；焚光顯微鏡 下觀察記錄結果。
[0119] 待檢材料的預處理，采集新鮮母豬乳汁，于4°C，10000rpm/min離心5min，棄去上層 乳脂層，用滅菌槍頭小心吸取中間層的乳清，注意不要將底部的乳汁沉淀部分吸出。乳清部 分可以直接稀釋用于抗體檢測。待檢樣品長期放置需_80°C分裝保存。用于免疫熒光試驗的 96孔病毒細胞板制備過程同上面的檢測IgA的實驗。分別將免疫母豬血清和未免疫母豬血 清做1:40倍稀釋，100yL/孔加入96孔板，各做2孔重復;在37 °C恒溫箱孵育30min。用PBS溶液 洗滌，200yL/孔，搖床放置5min，甩干，重復3次。加入1:60倍稀釋的FITC兔抗豬IgG熒光二 抗，在37°C溫箱培養(yǎng)30min。洗滌同上;熒光顯微鏡下觀察記錄結果。
[0120] 實施例9該制弱毒株初步臨床保護效果觀察
[0121] (1)疫苗安全性：
[0122] 免疫10頭后備母豬，劑量為2頭份/頭，觀察免疫后是否發(fā)生腹瀉。免疫10頭育肥前 期(80-90日齡），劑量為1頭份/頭，觀察免疫后是否發(fā)生腹瀉。免疫10頭產房仔豬(7日齡以 內），劑量為1頭份/頭，觀察免疫后是否發(fā)生腹瀉。產前3周免疫10頭母豬，看是否有腹瀉癥 狀，以及窩產仔數(shù)和未免母豬的差別。發(fā)現(xiàn)所有豬只均未有腹瀉癥狀，免疫母豬的窩產仔數(shù) 和未免母豬一致。由此說明本發(fā)明制備的變異PEDV弱毒活疫苗是安全的。
[0123] (2)免疫保護試驗：
[0124] 本試驗共分成6個組，分別為[，112，10^1^2和31，其中[組為分娩前35(1和15(1肌 注接種豬傳染性胃腸炎豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活苗（以下簡稱商品化滅活苗），M2組為分娩前 35d肌注接種商品化滅活苗，分娩前10d再口服接種實驗室弱毒苗，M3組為分娩前25d和10d 口服接種實驗室弱毒苗，F(xiàn)1組免疫方式同M2組，F(xiàn)2位分娩前35d和10d分別肌注接種商品化 滅活苗與實驗室弱毒苗(F1、F2組僅統(tǒng)計仔豬斷奶存活率），S1組為分娩前35d肌注接種商品 化滅活苗，分娩前5d再口服接種實驗室弱毒苗。疫苗臨床使用效果主要從該疫苗的安全性、 有效性和使用該疫苗豬只的生產成績3方面進行評估。
[0125] 1) IgA檢測結果
[0126] 采集Ml、M2、S1、M3懷孕母豬分娩后初乳樣品實驗室豬流行性腹瀉IgA抗體間接 ELISA檢測。以檢測到的S/P值作為衡量IgA水平的標準，設陰陽性對照且結果正常，所測樣 品S/P值20.148為陽性，抗體合格;S/P值<0.148為陰性。經檢測，所有樣品均為陽性，對陽 性樣品取平均S/P值并誤差分析（圖7)后得出，M3組初乳樣品中平均S/P值最高，為0.774， Ml、M2相近，分別為0 ? 623與0 ? 626，但M2組誤差（0 ? 367)比Ml組(0 ? 468)小，S1組IgA平均S/P 值最低，僅0.371 (圖8)。
[0127] 2)IgG檢測結果
[0128] 采集Ml、M2、S1、M3組懷孕母豬分娩后初乳樣品實驗室豬流行性腹瀉IgA抗體間接 ELISA檢測。以檢測到的0D值作為衡量IgG水平的標準，設陰陽性對照且結果正常，所測樣品 0D值2 0.433為陽性，抗體合格;0D值<0.433為陰性。
[0129] 經檢測，所有樣品均為陽性，對陽性樣品去平均0D值并誤差分析（圖9)后得出，Ml 組初乳樣品平均0D值最高，為2.099，但誤差波動最大，為0.746 J3組平均0D值為2.002，比 Ml組稍低，但誤差值為0.399，說明M3組所測各樣品0D較Ml更為平均，抗體水平更穩(wěn)定;S1組 平均0D值為1.915，誤差值為0.249 ;M2組平均0D值為1.840，誤差值為0.541。
[0130] 3)中和實驗檢測結果
[0131] Ml、M2組乳汁檢測中和抗體平均效價對比（圖10)顯示，Ml組中和效價平均水平為 1:4.082，M2組中和抗體平均效價為1:187.821，較Ml組顯著增高。
[0132] 4)生產成績
[0133] F1、F2及Ml組統(tǒng)計的仔豬斷奶存活率如圖11所示：
[0134] F1組仔豬斷奶存活率最高，為92.4%，平均窩仔數(shù)為9.59頭/窩；其次是F2組仔豬 斷奶存活率為88.8%，平均窩仔數(shù)為9.00頭/窩；最低為Ml組，仔豬斷奶存活率為0.795，平 均窩仔數(shù)為9.72頭/窩。
[0135] 本試驗從窩仔數(shù)、存活率及腹瀉情況3方面指標評價組1213、51組生產成績，其 中Ml為統(tǒng)計分娩當天的生產成績，M2、M3、S1均統(tǒng)計為分娩后5d的生產成績。
[0136] 統(tǒng)計分析各指標平均水平（圖12)結果表明，綜合窩仔數(shù)與存活率以平均每窩存活 數(shù)指標可以看出最高為Ml組，平均每窩存活數(shù)為10.698頭(平均產仔數(shù)10.778頭/窩X平均 存活率99.3 % );其次為M2組，平均每窩存活數(shù)為9.402頭(平均產仔數(shù)9.474頭/窩X平均存 活率99.2 % );第三為M3組，平均每窩存活數(shù)為9.343頭(平均產仔數(shù)11.000頭/窩X平均存 活率84.9 % );最低為S1組，平均每窩存活數(shù)為1.816頭(平均產仔數(shù)8.667頭/窩X平均存活 率21.0% )。根據(jù)臨床統(tǒng)計，腹瀉情況最嚴重為S1組，腹瀉率為100 % ;其次為Ml組，腹瀉率為 55.56% ;第三是M3組，腹瀉率為35.71 %，腹瀉情況最輕的是M2組，腹瀉率為0%。
[0137] 由以上臨床試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，制備的變異PEDV毒株YN150弱毒凍干活疫苗不僅 安全性較好，且具有較好的預防效果。單獨使用和配合現(xiàn)有的經典毒株來源的活疫苗都能 起到很好的預防效果。
[0138] 其它未詳細說明的部分均為現(xiàn)有技術。盡管上述實施例對本發(fā)明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據(jù)本實施例在不經 創(chuàng)造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發(fā)明保護范圍。
【主權項】
1. 一種變異豬流行性腹瀉病毒弱毒YN150株，其特征在于:所述YN150株是由毒株YN144 在10yg/mL胰酶的條件下在Vero細胞上連續(xù)傳6代得到的，其中，毒株YN144的保藏號為： CCTCC V201547，YN150株的全長序列如SEQ ID No.l所示。2. 利用YN150株制備變異豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗的方法，其特征在于:包括以下 步驟： 1) 培養(yǎng)病毒YN150株的毒價達到106Λ(：Ι050)/ιΛ， 2) 將變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株ΥΝ150與牛奶保護劑按照體積比：6~9:1混合;于滅 菌凍干瓶中按2. OmL/瓶分裝，置-50 °C冷凍干燥機中凍干，凍干36-40h后壓蓋，確保沒有雜 菌污染，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權利要求2所述利用YN150株制備變異豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗的方法，其 特征在于，所述活疫苗中，變異豬流行性腹瀉病毒弱毒株YN150株的含量小于10 6^TCID50/ mL〇4. 變異豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗在預防新型豬流行性腹瀉中的應用。
【文檔編號】C12R1/93GK105821006SQ201610146215
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月15日
【發(fā)明人】何啟蓋, 吳美洲, 陳芳洲, 李中華, 朱銀杏, 劉洋, 徐鳳琴, 庫旭鋼, 葉十, 葉十一, 郭效珍
【申請人】華中農業(yè)大學