新型8,10-去二氮雜-N⁵-酰基四氫葉酸類化合物作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及通式新型8，10?去二氮雜?N5??；臍淙~酸類化合物I在制備抗腫瘤藥物或藥物組合物中的用途，式中各個(gè)基團(tuán)的定義如權(quán)利要求書所述。本發(fā)明還涉及所述化合物的制備方法。
【專利說明】新型8,10-去二氮雜-N5-釀基四氫葉酸類化合物作為抗腫 瘤藥物的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請涉及8,10-去二氮雜-N5-?；〈臍淙~酸類衍生物、其光學(xué)純異構(gòu)體或 非對映異構(gòu)體混合物、其可藥用鹽、含有所述化合物的藥物組合物在制備具有葉酸代謝蛋 氨酸合成酶抑制作用的用途。本發(fā)明還涉及此類化合物在制備具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗 肺癌，胃癌，皮膚癌，肝癌，Η頸癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，鼻咽癌，食管癌，腦神經(jīng)膠質(zhì) 瘤，和胰腺癌藥物中的用途。 技術(shù)背景
[0002] 癌癥是危害人類生命和健康的重大疾病，全世界因癌癥死亡人數(shù)每年在700萬以 上，是僅次于心血管疾病的第二大殺手。由于目前尚無有效的預(yù)防、早期診斷和治療方法， 化療（化學(xué)療法）成為臨床三種主要治療方法中的一種?，F(xiàn)代的化療起始于20世紀(jì)40年 代，經(jīng)過60余年的發(fā)展，目前臨床上應(yīng)用的抗癌藥物已有相當(dāng)數(shù)量，然而特異性好、專屬性 強(qiáng)的抗腫瘤藥物不多，離不同癌癥特異性治療的目標(biāo)相去甚遠(yuǎn)。因此，特異性強(qiáng)、選擇性高 的抗腫瘤藥物成為藥物學(xué)家關(guān)注的重點(diǎn)。
[0003] 蛋氨酸合成酶（MS)作為葉酸代謝中的關(guān)鍵酶，催化如下的反應(yīng)：以甲基 四氫葉酸（CH3-THF)為底物，通過SN2反應(yīng)將甲基四氫葉酸分子中的甲基轉(zhuǎn)移到酶 分子中，然后再將甲基轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸（Hey)分子中，生成蛋氨酸（Met)，即（1) CH3-THF+MS - CH3-MS+THF (2) CH3-MS+Hcy - Met+MS。即通過兩次親核取代反應(yīng)，將甲基四 氫葉酸的甲基轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸中，生成蛋氨酸，同時(shí)恢復(fù)四氫葉酸的活性體形式，重新參 與葉酸循環(huán)。
[0004] 過去數(shù)年的研究證明：① MS是人類細(xì)胞中唯一以甲基四氫葉酸為底物的蛋白酶， 在催化形成蛋氨酸過程中，同時(shí)提供葉酸進(jìn)入細(xì)胞的代謝途徑，也為嘌呤及嘧啶的合成提 供單碳單位；②快速裂分的癌細(xì)胞所需的蛋氨酸是正常細(xì)胞所需要的5~6倍；③癌細(xì)胞 中蛋氨酸合成酶的活性要比正常細(xì)胞中該酶的活性高21倍左右；④抑制蛋氨酸合成酶可 能會(huì)使癌細(xì)胞的快速生長受到抑制，而對正常細(xì)胞無大的影響。從研究結(jié)果可以看出，蛋氨 酸合成酶是腫瘤細(xì)胞生長的重要催化啟動(dòng)因子，抑制其活性，可干擾癌細(xì)胞的生長、代謝和 增殖過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，達(dá)到治療目的。
[0005] 雖然腫瘤細(xì)胞中的蛋氨酸合成酶活性都有所提高，但是不同腫瘤細(xì)胞中蛋氨酸合 成酶活性也有很大差距，利用不同腫瘤細(xì)胞中蛋氨酸合成酶的活性不同，提高腫瘤抑制劑 的選擇性，降低毒副作用，對不同腫瘤特異性用藥具有重要意義。根據(jù)蛋氨酸合成酶的作用 機(jī)理，我們設(shè)計(jì)了 8位和10位去二氮雜的四氫葉酸類似物，以增加穩(wěn)定性，提高在體內(nèi)的溶 解度和轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的速度。在N5上連接有?；?，是為了能夠與蛋氨酸合成酶中強(qiáng)親核性 的鈷胺素反應(yīng)，生成穩(wěn)定的碳鈷鍵，從而使蛋氨酸合成酶失活，達(dá)到抑制細(xì)胞快速分化和腫 瘤生長的目的。對本實(shí)驗(yàn)室合成的8,10-去二氮雜-N5-?；〈乃臍淙~酸類似物進(jìn)行 蛋氨酸合成酶抑制活性測定，證明該類化合物對蛋氨酸合成酶的抑制活性很好，其IC50值 小于10 μ Μ.
[0006] 本實(shí)驗(yàn)室對正常體細(xì)胞和20種不同種類腫瘤細(xì)胞中蛋氨酸合成酶的活性進(jìn)行測 定和篩選，最終確定八種蛋氨酸合成酶活性最高的腫瘤細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、宮頸 癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、和胰腺癌細(xì)胞。通式I化合物 Ν5?；〈臍淙~酸類似物對蛋氨酸合成酶活性最高的七種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抑制活性測定， 其中對皮膚癌細(xì)胞A431NS和胰腺癌細(xì)胞PANC-1的抑制活性最好，其IC50分別為3. 7nm和 5. 5nm，對肺癌細(xì)胞H460、宮頸癌細(xì)胞株Hela、結(jié)腸癌細(xì)胞C0L0205、前列腺癌細(xì)胞DU145和 食管癌細(xì)胞TE-1的IC50為10nm-90nm之間，因而可以確定N5酰基取代四氫葉酸類似物 為蛋氨酸合成酶的良好抑制劑，并且對于蛋氨酸合成酶活性高的腫瘤細(xì)胞具有顯著抑制作 用。尤其對胰腺癌細(xì)胞和皮膚癌細(xì)胞的高選擇性，為解決當(dāng)前胰腺癌臨床用藥種類少和降 低皮膚癌用藥副作用的難題具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種新型8,10-去二氮雜-N5取代四氫葉酸類化合物的抗腫 瘤藥物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通式I 8,10-去二氮雜-N5-?；〈臍淙~酸類衍生物可以抑 制葉酸代謝中的蛋氨酸合成酶，并且能夠選擇性抑制蛋氨酸合酶活性高的腫瘤細(xì)胞，因此 通式I可以用于治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物，包括胰腺癌和皮膚癌，以及肺癌、宮頸癌、肝 癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和人食管癌。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及通式I，即N5位具有酰基取代的新型四 氫葉酸衍生物、其光學(xué)純異構(gòu)體、其非對映體混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0010]
[0011] 其中：
[0012] R1 為 NH2 或 0H，
[0013] R2為選自H、、烷基、鏈烯基、炔基、?；?、-C(0)-烷基、-C(0)-鏈烯基或-C(0)_炔 基，
[0014] R3為選自H、烷基、鏈烯、炔烴、烷氧基、羥基或鹵素，
[0015] R4和R5分別獨(dú)立選自羥基、烷氧基、氨基、氨基酸或羧酸保護(hù)基。
[0016] 另一方面，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包括至少一種通式I類化合物或其光學(xué) 異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥用載體或賦形劑。
[0017] 本發(fā)明化合物的藥物組合物可采用下面的任意方式使用：口服、噴霧吸入、直腸用 藥、鼻腔用藥、頰部用藥、局部用藥、非腸道用藥，如皮下、靜脈、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心內(nèi)室、 胸骨內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)給藥也可與其它神經(jīng)保護(hù)藥物聯(lián)合 用藥。被治療動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、兩棲類、魚類、家禽類。主要范圍為 哺乳動(dòng)物特別是人。
[0018] 當(dāng)口服用藥時(shí)，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于 片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體可包括填充劑、潤滑劑、崩解劑、粘合 劑。填充劑可包括但不限于淀粉、預(yù)膠化淀粉、糊精、糖粉、乳糖、甘露醇、微晶纖維素。潤滑 劑包括但不限于硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、滑石粉、氧化植物油、聚乙二醇、十二烷基硫 酸鈉、微粉硅膠、滑石粉。崩解劑可包括但不限于交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、淀粉及 其衍生物、低取代羥丙基纖維素、泡騰崩解劑。粘合劑可包括但不限于羥丙基纖維素、聚維 酮、淀粉漿、糊精、糖粉、糖漿、膠漿、纖維素及其衍生物。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳 糖和干燥玉米淀粉。水懸乳液制劑則是將活性成分與適宜的懸浮劑混合使用，懸浮劑可包 括但不限于潤濕劑、絮凝劑、反絮凝劑。任選地，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、 芳香劑或著色劑。
[0019] 當(dāng)局部用藥時(shí)，特別是治療局部外敷容易達(dá)到的患面或器官，如眼睛、皮膚或下腸 道神經(jīng)性疾病時(shí)，可根據(jù)不同的患面或器官將本發(fā)明的化合物制成不同的局部用藥制劑形 式，具體說明如下：
[0020] 當(dāng)皮膚局部使用時(shí)，本發(fā)明化合物可制成適當(dāng)?shù)剀浉?、洗劑或霜制劑形式，其中?活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于：礦物油、 液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蠟和水；洗劑或霜?jiǎng)┛墒褂?的載體包括但不限于：礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、十六烷酯蠟、十六碳烯 芳醇、2_辛基十二烷醇、芐醇和水。
[0021] 本發(fā)明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮或無菌注 射溶液。其中，可使用的載體或溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的 非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。
[0022] 另外需要指出，本發(fā)明化合物的使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者 的年齡、體重、性別、自然健康狀況、化合物的活性強(qiáng)度、服用時(shí)間、代謝速度、病癥的嚴(yán)重程 度，具體劑量和使用方法由主治醫(yī)師根據(jù)患者的具體病情判斷。
[0023] 制備方法通式
[0024] 本發(fā)明化合物可選擇多種反應(yīng)路線制備，通過下述實(shí)施例將將有助于理解本發(fā) 明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0025]
[0026] R1 為 NH2 或 0H，
[0027] R2為選自H、、烷基、鏈烯基、炔基、酰基、-C (0)-烷基、-C (0)-鏈烯基或-C (0)-炔 基，
[0028] R3為選自H、烷基、鏈稀、塊煙、烷氧基、羥基或鹵素，
[0029] R4和R5分別獨(dú)立選自羥基、烷氧基、氨基、氨基酸或羧酸保護(hù)基。
[0030] 本發(fā)明所述的工藝中，化合物1與芳香醛（酮）在取代的苯磺酰胺的催化作用下 高溫反應(yīng)直接制備化合物3,通過一步反應(yīng)快速構(gòu)建基本結(jié)構(gòu)骨架，從而避免了類似化合物 結(jié)構(gòu)骨架構(gòu)建方法中用Wittig反應(yīng)中的諸多不足?；衔?與谷氨酸酯在縮合劑的作用 下得到化合物4,在催化氫化條件下轉(zhuǎn)化為化合物5,隨后在N5位進(jìn)行不同的取代反應(yīng)獲得 目標(biāo)化合物I。本合成方法合成步驟少、簡便、試劑廉價(jià)易得、環(huán)境友好，利于方便快捷地獲 得該類目標(biāo)化合物。
[0031] 在不脫離此發(fā)明主要思想的情況下，一些具體操作步驟可做一些改變或修正。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0033] 實(shí)施例1 : (E)-4-[2-(2,4-二氨基吡啶并[3, 2-d]嘧啶-6-基）乙烯基]苯甲酸 的合成
[0034] 將lmmol 2,4-二氨基-6-甲基批陡并[3, 2_d]啼陡⑴、lmmol對甲?；郊?酸乙酯（2)以及l(fā)mmol對甲基苯磺酰胺溶于5mL N，N-二甲基乙酰胺中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱 回流12h，TLC監(jiān)測反應(yīng)原料消失，向反應(yīng)液中加入適量的IN NaOH至pH = 12,用二氯甲 烷萃洗溶液三次，收集水層，加入IN HC1調(diào)節(jié)至pH = 5,析出白色固體，抽濾后干燥得到 化合物 3,產(chǎn)率 90.5%。m.p. > 250°C;1H NMR(DMS0-d6,400MHz)S :6.37(s，2H，2-NH2)， 6. 45(d，J = 16. 0Hz，1H，CH = CHPh)，7· 57(d，J = 8. 4Hz，lH，CH-7，py)，7· 74 ~7. 78(m，2H， C6H4and lH，CH-8，Py)，7· 89(d，J = 16. 0Hz，1H，CH = CHPh)，7· 94(d，J = 8. 0Hz，2H，C6H4)， 11.0(d,J = 7. 3Hz,lH,C00H) ；13C NMR(DMS〇-d6,100MHz) δ ：127. 008 (2XPh), 127. 667 (Py, C-7) , 128. 290(Ph-CH = CH) , 128. 498 (2 X Ph) , 129. 798 (Py, C-8), 130. 952 (Ph-CH = CH)，133. 218 (py，C-6)，140. 317(Ph-CH = CH)，148. 192 (Py，C-8a)，160.943 (Py，C-2)， 162. 572(Py，C-4)，166. 715(COOH)。
[0035] 實(shí)施例2 :(E)-4-[2-(2,4-二氨基吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-基）乙烯基]苯甲 酰-L-谷氨酸二乙酯的合成
[0036] 將lmmol化合物（E)-4-[2-(2,4-二氨基吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-基）乙烯基] 苯甲酸、lmmol谷氨酸二乙酯及l(fā)mmol 1,3-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)溶于二氯甲燒中， 室溫下攪拌24h，TLC監(jiān)測反應(yīng)原料消失，母液用CH2C1 2和飽和食鹽水萃洗、有機(jī)層用無水 似2504干燥后減壓蒸餾至少量，柱層析分離，洗脫劑為CH 2C12 : CH30H=15 : 1，得到5g 化合物 1.9,黃綠色熒光固體，產(chǎn)率 31.5%，m.p.l33 ~134°C。蟲 NMR(400MHz，DMS0-d6) δ :1· 160 ~1. 204(m，J = 7. 2Hz，6H，2XCH3)，2· 019 ~2. 058(m，1H，〇^凡0120))，2· 111 ~ 2. 184(m，lH，CHJ4CH2C0)，2.448 ~2.485(t，2H，CH2C0)，4.036 ~4.089(q，J = 7·2Ηζ， 2H，-0CH2-)，4. 100 ~4. 151(q，J = 7·2Ηζ，2Η，-0CH2-)，4.439 ~4.469(m，lH，NCHC0)， 6. 373 (s，2H，2-NH2)，6. 427 ~6. 467 (d，J = 16. 0Hz，1H，-CH = CHph)，7. 559 ~7. 580 (d，1H， CH-7, py)，7. 743 ~7. 776 (m，J = 8. 0Hz，2H，C6H4and 1H，CH-8, py)，7. 871 ~7. 913 (d，J = 16. 0Hz，-CH = Cflph)，7. 926 ~7. 946 (d，J = 8. 0Hz，2H，C6H4)，8. 740 ~8. 758 (d，1H，C0NH); 13C 匪R(100MHz，DMS0-d6) δ :14.524(2XCH3)，29.459(￡H2CHf0)，30.663(CH2g^0)， 52. 505 (N￡m：0)，60. 379 (0CH2)，61. 021 (0CH2)，127. 008(2Xph)，127. 667 (py，C-7)， 128. 290 (ph-CH = CH) , 128. 498 (2 X ph) , 129. 798 (py, C-8) , 130. 952 (ph-CH = CH), 132.225 (nh-C0NH),133. 218(py, C-6),140. 317(^h-CH = CH),148. 192 (py, C-8a), 160. 943 (py, C-2), 162. 572 (py, C-4), 166. 715 (C0NH), 172. 213 (CHC00), 172. 649 (CH2C00)；
[0037] 實(shí)施例3 :4-[2-(2,4-二氨基-5,6, 7,8-四氫吡啶并[3, 2-d]嘧啶-6-基）乙基] 苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯的合成
[0038] 100mg(0. 201mmol) (E)-4-[2-(2,4-二氨基吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-基）乙烯基] 苯甲酰谷氨酸二乙酯溶于10mL無水乙醇中，加入2mg PtO^PlmL H0Ac，0. 4MPa氫氣條 件下催化氫化，TLC監(jiān)測，約120h后停止反應(yīng)，濾除Pt02，用5 %的NaHC03水溶液中和，減壓 蒸饋除去乙醇，用CH2C12和飽和食鹽水萃洗,有機(jī)層用無水Na 2S04干燥后減壓蒸饋至少量， 柱層析分離，洗脫劑為V(CH2C12) : V(CH30H)=12 : 1，得到80mg化合物4-[2-(2,4_二氨 基-5,6, 7,8-四氫吡啶并[3, 2-d]嘧啶-6-基）乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯，淡黃色固 體，產(chǎn)率 79.0%. m.p. 90 ~911::? NMR(DMS0-d6,400MHz) δ :1.18 (t，J = 7.2Hz，6H，CH3)， 1. 51 ~1. 538 (m，1H，CHaHb-7)，1. 75 ~1. 84 (m，2H，CH2-9)，1. 90 ~1. 95 (m，1H，CHaHb-7)， 1. 99 ~2. 06 (m，1H，CHaHbCH2C0)，2. 09 ~2. 10 (m，1H，CHaHbCH2C0)，2. 45 (t，J = 7. 5Hz，2H， CH2C0)，2. 48 ~2. 60 (m，2H，CH2-10)，2. 78 ~2. 87 (m，2H，CH2-8)，3. 04 ~3. 06 (m，1H，NCH-6)， 4. 08(q，J = 7. 2Hz，4H，0CH2)，4. 41 ~4. 50(m，1H，NCHC0)，6. 59(s，2H，2-NH2)，7. 37(d，J =8. 0Hz，2H，C6H4)，7. 57(s，2H，4-NH2)，7. 83(d，J = 8. 0Hz，2H，C6H4)，8. 67(d，J = 7. 4Hz， 1H，C0NH) ;13C 匪R(DMS0-d6，100MHz) δ :14. 512(2 XCH3) ,24.360 (C-7) ,26.180 (C-8)， 26. 545 (CH2CH2C0)，30. 659 (CH2CHfO)，31. 527 (C-10)，36. 884 (C-9)，50. 907 (NCHC0)， 52. 432 (C-6)，60. 356 (0CH2)，60. 968 (0CH2)，116. 617(C-4a)，128. 022 (2 XPh)， 128. 656(2 XPh)，131. 723 (Ph-CONH)，146. 442 (Ph-CH2CH2)，152. 212 (C-4)，157. 705 (C-2)， 167.026 (C0NH),172. 238 (CHCOO),172. 649(CH2COO) ；HRMS calcd for C25H35N605 499. 26634, found 499.26503.
[0039] 實(shí)施例4:4-[2-(2,4-二氨基-5-甲?；?5,6,7,8-四氫吡啶并[3,2-(1]嘧 啶-6-基）乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯的合成
[0040] 243mg(0· 488mmol)化合物 4-[2-(2,4_ 二氨基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3， 2_d]嘧啶-6-基）乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯溶于5ml CH2C12，加入0· lml甲酸 (2. 67mmol)，室溫下攪拌lh，加入0. 2ml (2. lOmmol)乙酸酐，室溫下繼續(xù)攪拌0. 5h，停止 反應(yīng)，加入飽和NaHC03中和至pH = 7,用飽和食鹽水和CH2C12萃洗，有機(jī)層用無水Na2S04 干燥，過濾，減壓蒸餾除去CH2C12，得到的粗產(chǎn)物柱層析分離，洗脫劑為CH2C1 2 : CH30H = 15 : 1，得到250mg化合物4-[2-(2,4_二氨基-5-甲?；?5,6,7,8-四氫吡啶并[3， 2_d]嘧啶-6-基）乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯，產(chǎn)率97.3%，m.p.88~89°C。4 NMR(400MHz，CDC13) δ :1.206 ~1.242 (t，J = 7. 2Hz，3H，CH3)，1.284 ~1.320 (t，J = 7. 2Hz，3H，CH3)，1. 686 ~1. 752 (m，1H，CHaHb-7)，1. 791 ~1. 861 (m，1H，CHJIb-7)，1. 892 ~ 1. 945 (m，1H，ClHb-9) ,2.115 ~2.231 (m，2H，CHJb-9, CHaHbCH2C0) ,2.269 ~2.352 (m， 1H，CHJIbCH2C0) ,2.392 ~2.511 (m，2H，CH2C0) ,2.516 ~2.607 (m，2H，CH2-10) ,2.627 ~ 2. 747 (m，2H，CH2-8)，3. 910 ~3. 922 (m，1H，NCH-6)，4. 084 ~4. 143 (m，J = 7. 2Hz，2H，0CH2)， 4. 207 ~4. 263(m，J = 7. 2Hz，0CH2)，4. 763 ~4. 814(m，1H，NCHC0)，5. 083(s，2H，4-NH2)， 5. 332 (s，2H，2-NH2)，7. 125 ~7. 143 (d，1H，C0NH)，7. 176 (d，J = 7. 8Hz，2H，C6H4)，7. 736 ~ 7.756(d，J = 7·8Ηζ，2Η，C6H4)，8.039 ~8.051(d，lH，NCH0) ;13C NMR(100MHz，CDC13) δ : 14. 117 (CH3), 14. 137(CH3) ,26. 183 (C-7) ,27. 216(C-8) ,27. 985 (CH2CH2C0), 30. 526 (CH2CH 2 CO)，31. 945 (C-10)，32. 088 (C-9)，52. 363 (N￡HC0)，54. 134 (C-6)，60. 804 (0CH2)， 61. 712(0CH2)，107. 160(C-4a)，127. 522(2Xph)，128. 514(2Xph)，131. 884(￡irC0NH)， 144. 512 (￡ii-CH2CH2)，159. 032 (C-8a)，159. 366 (C-4)，160. 388 (C-2)，160. 713 (NCH0)， 166. 818 (C0NH) , 172. 050 (CHC00) , 173. 233 (CH2C00) ；HRMS calcd for C26H35N606 527. 26126, found 527.26206
[0041] 實(shí)施例5 :4-[2-(2,4-二氨基-5-甲?；?5,6,7,8-四氫吡啶并[3,2-d]嘧 啶-6-基）乙基]苯甲酰-L-谷氨酸的合成
[0042] 2011^(0.038臟〇1)4-[2-(2,4-二氨基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,2-(1]嘧啶-6-基） 乙基]苯甲酰-L-谷氨酸溶于3mL無水甲醇中，加入3mg(0. 118mmol)K0H，室溫下攪拌24h， 停止反應(yīng)，減壓蒸餾除去甲醇，加入lmL蒸餾水溶解殘余物，用lmol/L的HC1水溶液小心中 和到pH = 6左右，析出淡黃色沉淀，放入冰箱中靜置24h，抽濾并用蒸餾水和乙醚淋洗，真空 干燥后得到4-[2-(2,4-二氨基-5-甲?；?5,6, 7,8-四氫吡啶并[3, 2-d]嘧啶-6-基）乙 基]苯甲酰-L-谷氨酸12mg，淡黃色固體，產(chǎn)率67. 169~1701^? NMR(DMS0-d6， 400MHz) δ :1. 65 (brs，1H，CHaHb-7)，1. 77 (brs，1H，CHaHb-7)，1. 93 ~1. 97 (m，1H，CHaHb-9)， 2. 05 ~2. 07 (m，2H，CHaHb-9, CHaHbCH2C0)，2. 31 ~2. 39 (m，3H，CH2C0, CHaHbCH2C0)，2. 47 ~ 2. 67 (m，2H，CH2-10)，2. 77 ~2. 82 (m，2H，CH2-8)，3. 01 (brs，1H，NCH-6)，4. 34 ~4. 36 (m，1H， NCHC0)，6.01(sX2,2H，2-NH2)，7. 25 ~L 30 (m，1H，C0NH)，7. 33 ~L 40 (m，2H，C6H4)，7. 77 ~ 7.82(m，2H，C6H4)，8.38(sX2，lH，CH0) ;13C 匪R(DMS0-d6，100MHz) δ :26.566(C-7)， 27. 447 (C-8)，28. 279 (CH2CH2C0)，31. 108 (CH2CH2C0)，31. 621 (C-10)，36. 927 (C-9)， 50. 892 (NCHCO)，53. 314(C-6)，116. 140(C-4a)，127. 800 (2XPh)，128. 607 (2XPh)， 132. 378(Ph-CONH)，145. 389(Ph-CH2CH2)，158. 098(C-8a)，159. 123(C-4)，161. 696 (C-2)， 163. 124 (NCHO) ,166.329 (CONH) ,175.012 (CHCOO) ,175.133 (CH2⑶0) ;HRMS calcd for C22H27N606 471. 19866, found 471.19908.
[0043] 實(shí)施例6 :對11種腫瘤細(xì)胞株的抑制實(shí)驗(yàn)
[0044] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0045] 體外培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株H460,人胃癌細(xì)胞株BGC823,人皮膚癌細(xì)胞株A431NS，人 宮頸癌細(xì)胞株Hela，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，人結(jié)腸癌細(xì)胞株C0L0205,人前列腺癌細(xì) 胞株DU145,人鼻咽癌細(xì)胞株KB，人食管癌細(xì)胞株TE-1，人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG，人胰 腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，收集細(xì)胞，lOOOrpm離心5分鐘，棄上清，適量 培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至3. 5 X 104/ml~8 X 104/ml。將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板中，每孔1〇〇μ 1，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，5% C02)中培養(yǎng)24h后，加入待測藥物，陰性 對照組加入終濃度為〇. 5% DMS0,各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/ ml 的 ΜΤΤ 20μ 1，37°C放置 4h。每孔加入 150μ 1 DMS0,37°C搖床振蕩 5min，492nm/620nm 測吸光度（0D)。運(yùn)用Prism Graphpad統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算EC50值。
[0046] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表1)
[0047] 表1.化合物對11株腫瘤細(xì)胞增殖的影響
[0048]
[0049] 以上對本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本 發(fā)明做出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 通式I化合物及其藥物鹽，其中： R1 為 NH2 或 OH ; R2為任選取代酰基； R3獨(dú)立為H，任選取代烴基； R4和R5獨(dú)立為H或任選取代的烷基。2. 權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物為藥學(xué)上可接受的鹽形式。3. 權(quán)利要求2的化合物，其中所述化合物為堿金屬鹽形式。4. 權(quán)利要求3的化合物，其中所述化合物為二鈉鹽形式。5. 權(quán)利要求2的化合物，其中R4和R5的一個(gè)或多個(gè)被成鹽陽離子取代。6. 權(quán)利要求5的化合物，其中所述的成鹽陽離子包括堿金屬陽離子。7. 權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的酯、酰胺、鹽、溶劑合物、對映體或前體藥 物。8. 藥物組合物，包含權(quán)利要求1-7中任意項(xiàng)的化合物、其旋光異構(gòu)體或其可藥用鹽以 及至少一種藥物上可接受的載體。9. 權(quán)利要求1-8中任意項(xiàng)所述的化合物在制備抗肺癌，胃癌，肝癌，皮膚癌，宮頸癌，乳 腺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，鼻咽癌，食管癌，腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，胰腺癌藥物中的用途。10. 權(quán)利要求9的用途，其中所述的抗腫瘤藥物為抑制葉酸代謝中的蛋氨酸合成酶的 藥物。11. 一種合成式（I)所示四氫葉酸類似物的方法，其中Rl，R2, R3, R4, R5如上定義。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的合成方法，在合成化合物3時(shí)，優(yōu)選以下反應(yīng)條件：在通過 化合物1與化合物2以及對甲基苯甲酰胺一起溶解在高沸點(diǎn)溶劑中，該高沸點(diǎn)溶劑優(yōu)選N， N-二甲基甲酰胺，加熱反應(yīng)，反應(yīng)溫度優(yōu)選150-180°C之間的溫度。反應(yīng)結(jié)束后調(diào)節(jié)反應(yīng)液 至堿性，PH值優(yōu)選10-12之間，經(jīng)有機(jī)溶劑萃洗后，水層調(diào)節(jié)至酸性，pH值優(yōu)選2-4之間。 水層析出白色固體即為化合物3,抽濾得到產(chǎn)物。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的合成方法，化合物3與谷氨酸二乙酯在1，3-二環(huán)己基碳二 亞胺（DCC)作用下得到化合物4,優(yōu)選的反應(yīng)原料的物質(zhì)的量比例為化合物3 :谷氨酸二乙 酯：DCC=I : 1 : 1。優(yōu)選的反應(yīng)溶劑是二氯甲烷。
【文檔編號】A61K31/519GK105884764SQ201410557599
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月21日
【發(fā)明人】劉俊義, 田超, 張志麗, 王孝偉, 王錳
【申請人】北京大學(xué)