專利名稱：葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
葉酸是一種B族維生素，人體本身不能合成。從食物中攝取的葉酸只有在葉酸還原酶的作用下，還原為四氫葉酸，才能參與人體許多重要的生化代謝反應(yīng)，是機(jī)體細(xì)胞生長和分裂所必需的物質(zhì)，也是人體內(nèi)參與合成堿基的關(guān)鍵輔助因子。因此，缺乏葉酸，胎兒、嬰幼兒會出現(xiàn)發(fā)育缺陷和遲緩。在孕婦中大力推廣“葉酸強(qiáng)化”，從某種程度上減少了出生缺陷。孕婦一般采用每天服用一粒葉酸片(400微克)的形式補(bǔ)充葉酸，對于葉酸利用能力正常的孕婦這個用量是充足的，但對于葉酸利用能力不足的孕婦卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。此外，最近發(fā)現(xiàn)“葉酸強(qiáng)化”還存在一定負(fù)面效應(yīng)，大范圍人群大量補(bǔ)充葉酸，人為地造成未來的人口對于 大量維生素產(chǎn)生依賴性，由此，可能導(dǎo)致人口整體的基因組成發(fā)生變化，這種人群對于某些致命的疾病將變得十分脆弱。因此，鑒別出葉酸利用能力正常和葉酸利用能力不足的人群，個性化合理的補(bǔ)充葉酸具有重要的現(xiàn)實意義和長遠(yuǎn)意義。部分葉酸利用能力不足的孕婦，其葉酸代謝途徑相關(guān)酶基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致了酶分子一個氨基酸的替換，使酶活性大大下降而影響葉酸的利用能力。已經(jīng)報道葉酸代謝途徑中一些酶基因的多態(tài)性與神經(jīng)管畸形、心血管疾病、唐氏綜合征、流產(chǎn)、淋巴細(xì)胞性白血病、乳腺癌、胃癌、Andesophageal腫瘤、阿爾茨海默病等疾病相關(guān)聯(lián)。在葉酸利用能力相關(guān)的基因檢測技術(shù)臨床應(yīng)用之前，婦產(chǎn)科醫(yī)師通常只能建議所有孕婦按照標(biāo)準(zhǔn)量、標(biāo)準(zhǔn)時間來服用葉酸。我們提出個體化合理使用葉酸，為此研發(fā)了本試劑盒，通過本試劑盒檢測，可檢測出影響葉酸代謝和利用能力的一些已知的常見的突變，將亞健康人群分為疾病風(fēng)險高、中、低三個亞群，指導(dǎo)這些人群個性化使用葉酸，對高風(fēng)險人群進(jìn)行特異性個性化干預(yù)。有針對性的合理補(bǔ)充葉酸，可以消除過度“葉酸強(qiáng)化”帶來的負(fù)面影響。本試劑盒以我國常見的葉酸不足引發(fā)的疾病(神經(jīng)管畸形、心血管疾病、唐氏綜合征、流產(chǎn)、淋巴細(xì)胞性白血病、乳腺癌、胃癌、andesophageal腫瘤、阿爾茨海默病)為代表性目標(biāo)疾病，對于阻止亞健康向疾病轉(zhuǎn)變以及促進(jìn)健康恢復(fù)起到一定作用，為我國出生缺陷的降低將起到一定作用。此外，腫瘤生長過程中需要大量合成DNA，由于葉酸對DNA的加工很重要，因此葉酸代謝途徑也被作為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)。一個叫甲氨喋呤的化合物就是葉酸的類似物，它可抑制葉酸的代謝，目前仍是臨床上多種腫瘤的化療藥物，適用于急性白血病、乳腺癌、絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎、頭頸部腫瘤、骨腫瘤、白血病腦膜脊髓浸潤、肺癌、生殖系統(tǒng)腫瘤、肝癌、頑固性普通牛皮癬及自身免疫病等。這類化療藥物對葉酸代謝正常的患者療效較為明顯。因此在使用針對葉酸代謝的抗腫瘤藥物之前，也可通過本試劑盒檢測，篩選出存在葉酸利用能力低下風(fēng)險的個體，指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理選擇抗腫瘤藥物。
目前，傳統(tǒng)基因突變檢測方法包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single StrandConformation Polymorphism, SSCP)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(Restriction FragmentLength Polymorphism, RFLP)、變性高效液相色譜(Denaturing High Performance LiquidChromatography,DHPLC)、直接測序、基因芯片等。這些方法或者檢測能力有限、或者耗時費(fèi)力、所需設(shè)備和耗材昂貴，更重要的是，除基因芯片外，這些方法難以針對不同基因的多個突變位點(diǎn)同時進(jìn)行高通量檢測。而基因芯片技術(shù)平臺成本昂貴，對環(huán)境和人員素質(zhì)要求高，難以在我國廣大醫(yī)療機(jī)構(gòu)中普及，因此有必要建立一種高通量、高效能、低成本的葉酸代謝相關(guān)酶基因突變篩查方法，以實現(xiàn)臨床快速檢測和規(guī)模化篩查。我們研發(fā)的試劑盒在臨床應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)中每個位點(diǎn)都要單獨(dú)檢測，大大浪費(fèi)了檢測的時間、試劑、人力和物力，效率低。使用本試劑盒檢測，在一個反應(yīng)管中可以同時對16個位點(diǎn)進(jìn)行檢測，最終給出16個位點(diǎn)的基因分型結(jié)果。我們開發(fā)的利用SNaPshot技術(shù)檢測葉酸利用能力相關(guān)酶基因的技術(shù)平臺，其原理是多重PCR擴(kuò)增目的區(qū)域后，經(jīng)寡核苷酸引物延伸標(biāo)記擴(kuò)增，突變位點(diǎn)匹配上一個熒光 標(biāo)記的雙脫氧核苷酸后終止延伸。然后通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段分析，相當(dāng)于單個位點(diǎn)的微測序，可以檢測單核苷酸的突變。延伸位點(diǎn)堿基的類型決定電泳峰的顏色，根據(jù)峰的顏色可以清楚方便的判斷為野生型(正常)還是突變型；延伸引物的片段長度決定峰的位置；延伸引物的濃度影響電泳檢測的峰高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，它能針對目前中國人群葉酸利用能力相關(guān)基因突變的特點(diǎn)，選擇覆蓋范圍廣泛的16個突變熱點(diǎn)作為篩查目標(biāo)，彌補(bǔ)目前現(xiàn)有突變篩查方法的不足，提供一種簡單、高通量、高效能、低成本的適合中國人群的葉酸利用能力基因突變篩查方法。為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含(1) 0 反應(yīng)試劑，包括(1見1\5\和10XPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix 混合液；(2)按一定比例混合的PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物；各引物的濃度見圖I ;(3)按一定比例混合的的延伸引物；各引物的終濃度參見圖I ;圖I為推薦的使用濃度配比，具體在使用時，如果某個電泳峰的峰高過低，可適當(dāng)增加引物加入量，如果峰過高，可以適當(dāng)減少引物用量，以達(dá)到最佳檢測效果。(4)純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；(5)單個位點(diǎn)純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA ；(6)使用說明書。它的檢測方法為通過多重PCR擴(kuò)增，使被檢測樣本的16個目的片段得到擴(kuò)增富集；然后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化，去除多余的引物及dNTP “雜質(zhì)”；再利用針對突變位點(diǎn)設(shè)計的16條延伸引物，對16個富集的片段進(jìn)行單堿基的延伸反應(yīng)，僅對突變位點(diǎn)的單個堿基進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，突變位點(diǎn)匹配上一個熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸后終止延伸；然后再進(jìn)行一次擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化；最后經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段分析，相當(dāng)于單個位點(diǎn)的微測序，這樣可以檢測單核苷酸的突變，延伸位點(diǎn)堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸弓I物的片段長度決定峰的位置，延伸弓I物的濃度影響電泳檢測的峰高。所述的試劑盒包含檢測CBS基因C699T、DHFR基因c594+59dell9、FOLHl基因T1561C,GSTOl 基因 C428T、MTHFD1 基因 G878A、MTHFD 基因 G1958A、MTHFR基因 A1298C、MTHFD基因 C677T、MTR基因 A2756G、MTRR基因 A66G、NAT1 基因 C1095A、NFE2L2基因 insl+C11108T、RFCl基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六個基因突變位點(diǎn)的引物第一組所述檢測CBS基因C699T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P1_FTTTCTATGCAGTACCGCAACG ；Pl-R AATCAAGATGGACAGAGGGAC ；

延伸引物El: (T) 22AGCAACCCCCTGGCTCACTA ；第二組所述檢測DHFR基因c594+59dell9位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P2-FACTGCATCGTCGCTGTGTC ；P2-R CGGGCAGAAATCAGCAAC ；延伸引物E2: (T) 34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT ；第三組所述檢測FOLHl基因T1561C位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P3-FTCCAACTTCAGAAACCTT ；P3-R TTAGTATACCGTGCTCTGC ；延伸引物E3 :⑴ 34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT ；第四組所述檢測GSTOl基因C428T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P4-FATTCTCTGTCTAGGTGCCATC ；P4-R CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC ；延伸引物E4:⑴ 29CCAAAATAAAGAAGACTATG ；第五組所述檢測MTHFDl基因G878A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P5-FGCTTGAAACTGAGGTGAG ；P5-R AGGTTGTTATACTGAATCATCC ；延伸引物E5: (T) 4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC ；第六組所述檢測MTHFD基因G1958A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增弓 I物P6-F GTTTGCCAACATCGCACATG ；P6-R CTAACCTACAAACCCTTCTGG ；延伸引物E6: (T) 12CCTCCATCATTGCAGACC ；第七組所述檢測MTHFR基因A1298C位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P7-F:CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC ；P7-R TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC ；延伸引物E7:⑴ 34GGAGGAGCTGACCAGTGAAG ；第八組所述檢測MTHFD基因C67H位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P8-FTGAAGCACTTGAAGGAGAAGG ；P8-R CCTTCACAAAGCGGAAGAATG ；延伸引物E8 :⑴ 12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG ；
第九組所述檢測MTR基因A2756G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P9_FCATTGACCATTACTACACCAG ；P9-R TCTGTTTCTACCACTTACCTTG ；延伸引物E9ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG ；第十組所述檢測MTRR基因A66G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P10-FTATATGCTACACAGCAGGGAC ；PlO-R GGCTCTAACCTTATCGGATTC ；延伸引物ElO:⑴ 2(iAAGGCCATCGCAGAAGAAAT ； 第^^一組所述檢測NATl基因C1095A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物Pll-FCTAGACATCAAATCATTTCACC ；Pll-R CTTTCTAGCATAAATCACCAAT ；延伸引物E11TAACCACAGGCCATCTTTAAAA ；第十二組所述檢測NFE2L2基因insl+C11108T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P12-FAACTGACTGAGCAACTATTACG ；P12-R ATTGCTCCTCTGTGTCTCC ；延伸引物E12: (T) 14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG ；第十三組所述檢測RFCl基因G80A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P13-F:CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG ；P13-R AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA ；延伸引物E13 (T) 25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC ；第十四組所述檢測SHMTl基因C1420T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P14-FGTTCAAGGAGAGACTGGC ；P14-R GCTCATCCATCTCTCAGG ；延伸引物E14⑴ 7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT ；第十五組所述檢測TCN2基因C776G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P15-FTCCTCACTCTATCACCAGTTC ；P15-R TCATGAGAGCATTCTGGAAGG ；延伸引物E15 (T) 38CCTCATGACTTCCCCCATGC ；第十六組所述檢測TYMS基因1494del6位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P16-FAGGAACTGAGCAGATAAGTGG ；P16-R CGATCATGATGTAGAGTGTGG ；延伸引物E16 (T)4qGAGTGTGGTTATGAACTTTA。所述的PCR擴(kuò)增引物及延伸引物用于針對人類基因組中目的區(qū)域DNA的擴(kuò)增以及目的位點(diǎn)的微測序，進(jìn)而達(dá)到基因分型的目的，以實現(xiàn)特定核苷酸變異的檢測(其序列參見圖I)。所述的PCR擴(kuò)增引物和延伸引物濃度的優(yōu)化配置，使其能夠在延伸反應(yīng)時兼顧各個位點(diǎn)的產(chǎn)量，利于后續(xù)檢測中各個位點(diǎn)突變情況的判斷識別。本發(fā)明中的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計時選擇目的區(qū)域上下游70_150bp的距離作為引物設(shè)計的起始部位，引物與之序列匹配的特異性要好，引物間的退火溫度要盡量一致(55°C左右)。使在一個多重PCR反應(yīng)中的各個擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率相當(dāng)。本發(fā)明中16個突變位點(diǎn)的延伸引物在設(shè)計時的指導(dǎo)思想是根據(jù)不同序列情況，在突變點(diǎn)的上游或下游選取正向或反向與突變位點(diǎn)5’端或3 ‘端序列互補(bǔ)結(jié)合的17-25bp的序列；避免序列中有難以解鏈的二級結(jié)構(gòu)；確保延伸的單個堿基不在序列上，并保證缺失型突變下一個堿基與缺失的堿基為不同堿基；各個延伸引物片段全長應(yīng)該有一定的差異，通過在片段的5 ‘端加上若干個T，使得延伸引物長度均勻分布在18-70bp之間(參見圖I)，以便于通過毛細(xì)管電泳分離檢測(其序列參見圖I)。16個位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物長度見圖I。這樣經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，帶有不同熒光的不同長度的片段經(jīng)毛細(xì)管電泳后就能夠分析出相應(yīng)片段所攜帶的堿基類型，進(jìn)而可以判斷是否存在該堿基的突變，并區(qū)分屬于野生型、純合突變還是雜合突變，使上述16個位點(diǎn)一次性得到精確的基因分型。本發(fā)明中設(shè)計的PCR擴(kuò)增引物和延伸引物序列，通過核酸合成儀人工合成，并與PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括dNTP、5X和10XPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液、純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；16個位點(diǎn)雜合突變型 的混合DNA陽性標(biāo)本，以及說明書組合起來，提供用于體外檢測葉酸利用能力基因突變篩查的試劑盒，其主要功能在于，將所需的試劑集成在一個小盒內(nèi)，使得核酸片段擴(kuò)增、純化可以在試劑盒提供試劑的基礎(chǔ)上順序完成。本發(fā)明能針對目前中國人群葉酸利用能力相關(guān)基因突變的特點(diǎn)，選擇覆蓋范圍廣泛的16個突變熱點(diǎn)作為篩查目標(biāo)，彌補(bǔ)目前現(xiàn)有突變篩查方法的不足，提供一種簡單、高通量、高效能、低成本的適合中國人群的葉酸利用能力基因突變篩查方法。


圖I為本發(fā)明的PCR擴(kuò)增引物、延伸引物及結(jié)果判讀的表格圖；圖2為本發(fā)明的SNaPshot實驗流程示意圖；圖3為本發(fā)明的毛細(xì)管電泳結(jié)果圖。電泳順序由左向右依次為NATl C1095A、MTHFDl G878A、SHMTl C1420T、MTHFD G1958A、MTHFRC677T、MTR A2756G、NFE2L2insl+C11108T、MTRR A66G、CBS C699T、RFCl G80A、GSTOl C428T、MTHFR A1298C、DHFRc594+59dell9、F0LHlT1561C、TCN2 C776G、TYMS 1494del6。理論上的片段長度分別為 22bp、24bp,27bp,30bp,32,33bp,37bp,40bp,42bp,45bp,49bp,51bp,54bp,56bp,57bp,61bp 和60bp。實際電泳過程可能會存在飄移現(xiàn)象，即與分子量標(biāo)記所測片段大小有一定差距，如60bp片段會飄移到61bp片段后面，但不會影響整體結(jié)果判讀。
具體實施例方式參照圖1-3本具體實施方式
采用以下技術(shù)方案葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含(1) 0 反應(yīng)試劑，包括(1見1\5\和IOXPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix 混合液；(2)按一定比例混合的PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物；各引物的濃度見圖I ;(3)按一定比例混合的延伸引物；各引物的終濃度參見圖I ;圖I為推薦的使用濃度配比，具體在使用時，如果某個電泳峰的峰高過低，可適當(dāng)增加引物加入量，如果峰過高，可以適當(dāng)減少引物用量，以達(dá)到最佳檢測效果。(4)純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；(5)單個位點(diǎn)純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA ；(6)使用說明書。它的檢測方法為通過多重PCR擴(kuò)增，使被檢測樣本的16個目的片段得到擴(kuò)增富集；然后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化，去除多余的引物及dNTP “雜質(zhì)”；再利用針對突變位點(diǎn)設(shè)計的16條延伸引物，對16個富集的片段進(jìn)行單堿基的延伸反應(yīng)，僅對突變位點(diǎn)的單個堿基進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，突變位點(diǎn)匹配上一個熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸后終止延伸；然后再進(jìn)行一次擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化；最后經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段分析，相當(dāng)于單個位點(diǎn)的微測序，這樣可以檢測單核苷酸的突變，延伸位點(diǎn)堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸弓I物的片段長度決定峰的位置，延伸引物的濃度影響電泳檢測的峰高。 所述的試劑盒包含檢測CBS基因C699T、DHFR基因c594+59dell9、FOLHl基因T1561C,GSTOl 基因 C428T、MTHFD1 基因 G878A、MTHFD 基因 G1958A、MTHFR基因 A1298C、MTHFD基因 C677T、MTR基因 A2756G、MTRR基因 A66G、NAT1 基因 C1095A、NFE2L2 基因 insl+C11108T、RFCl基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六個基因突變位點(diǎn)的引物第一組所述檢測C699T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P1_FTTTCTATGCAGTACCGCAACG ；Pl-R AATCAAGATGGACAGAGGGAC ；延伸引物El:⑴ 22AGCAACCCCCTGGCTCACTA ；第二組所述檢測DHFR基因c594+59dell9位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P2-FACTGCATCGTCGCTGTGTC ；P2-R CGGGCAGAAATCAGCAAC ；延伸引物E2: (T) 34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT ；第三組所述檢測FOLHl基因T1561C位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增弓丨物P3-FTCCAACTTCAGAAACCTT ；P3-R TTAGTATACCGTGCTCTGC ；延伸引物E3:⑴ 34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT ；第四組所述檢測GSTOl基因C428T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P4-FATTCTCTGTCTAGGTGCCATC ；P4-R CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC ；延伸引物E4:⑴ 29CCAAAATAAAGAAGACTATG ；第五組所述檢測MTHFDl基因G878A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增弓丨物P5-FGCTTGAAACTGAGGTGAG ；P5-R AGGTTGTTATACTGAATCATCC ；延伸引物E5: (T) 4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC ；第六組所述檢測MTHFD基因G1958A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增弓I物P6-F GTTTGCCAACATCGCACATG ；P6-R CTAACCTACAAACCCTTCTGG ；
延伸引物E6: (T) 12CCTCCATCATTGCAGACC ；第七組所述檢測MTHFR基因A1298C位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P7-F:CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC ；P7-R TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC ；延伸引物E7:⑴ 34GGAGGAGCTGACCAGTGAAG ；第八組所述檢測MTHFD基因C677T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P8-FTGAAGCACTTGAAGGAGAAGG ；P8-R CCTTCACAAAGCGGAAGAATG ； 延伸引物E8:⑴ 12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG ；第九組所述檢測MTR基因A2756G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增弓丨物P9-FCATTGACCATTACTACACCAG ；P9-R TCTGTTTCTACCACTTACCTTG ；延伸引物E9ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG ；第十組所述檢測MTRR基因A66G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P10-FTATATGCTACACAGCAGGGAC ；PlO-R GGCTCTAACCTTATCGGATTC ；延伸引物ElO:⑴ 2(iAAGGCCATCGCAGAAGAAAT ；第^^一組所述檢測NATl基因C1095A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物Pll-FCTAGACATCAAATCATTTCACC ；Pll-RCTTTCTAGCATAAATCACCAAT ；延伸引物ElITAACCACAGGCCATCTTTAAAA ；第十二組所述檢測NFE2L2基因insl+C11108T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P12-FAACTGACTGAGCAACTATTACG ；P12-R ATTGCTCCTCTGTGTCTCC ；延伸引物E12⑴ 14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG ；第十三組所述檢測RFCl基因G80A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P13-F:CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG ；P13-R AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA ；延伸引物E13 (T) 25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC ；第十四組所述檢測SHMTl基因C1420T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P14-FGTTCAAGGAGAGACTGGC ；P14-R GCTCATCCATCTCTCAGG ；延伸引物E14⑴ 7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT ；第十五組所述檢測TCN2基因C776G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P15-FTCCTCACTCTATCACCAGTTC ；P15-R TCATGAGAGCATTCTGGAAGG 延伸引物E15 (T) 38CCTCATGACTTCCCCCATGC ；第十六組所述檢測TYMS基因1494del6位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P16-FAGGAACTGAGCAGATAAGTGG ；
P16-R CGATCATGATGTAGAGTGTGG ；延伸引物E16 (T)4qGAGTGTGGTTATGAACTTTA。所述的PCR擴(kuò)增引物及延伸引物用于針對人類基因組中目的區(qū)域DNA的擴(kuò)增以及目的位點(diǎn)的微測序，進(jìn)而達(dá)到基因分型的目的，以實現(xiàn)特定核苷酸變異的檢測(其序列參見圖I)。所述的PCR擴(kuò)增引物和延伸引物濃度的優(yōu)化配置，使其能夠在延伸反應(yīng)時兼顧各個位點(diǎn)的產(chǎn)量，利于后續(xù)檢測中各個位點(diǎn)突變情況的判斷識別。本具體實施方式
中(I)Touchdown多重PCR:反應(yīng)體系總體積IOii L，10XPCR緩沖液 I. Ou L, MgCl2 (25mM) I. Ou L, dNTP (2mM) I. 5u L, Primer Mix 4. 0 u L, FastTaqE (5U/U L)、模板DNA 2. 35 u L ;反應(yīng)程序，95°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，66°C退火50s，每循 環(huán)降0. 5°C，72°C延伸50s, 11個循環(huán)；94°C變性30s，61。。退火50s，72。。延伸50s, 24個循環(huán)；72°C充分延伸10min，4°C保存，PCR反應(yīng)在9700熱循環(huán)儀(ABI公司)中進(jìn)行。(2) PCR 產(chǎn)物純化反應(yīng)體系總體積 6 ii L，ddH20 2. 6 u L, SAP 酶(I. OU/ u L)2u L,Exon I 酶(5. OU/ii L)0. L、上述 PCR 產(chǎn)物 l.OuL ;反應(yīng)程序，37°C 反應(yīng) 80min，80°C 終止反應(yīng)15min,4°C保存。(3)標(biāo)記延伸反應(yīng)體系總體積 6. Ou L, ddH20 I. 8 U L, 5 X SeqBuffer I. L，混合延伸引物(E-Primer) I. 0 y L、SNaPshot Mix I. 0 y L，上述純化產(chǎn)物I u L ;PCR反應(yīng)程序96°C預(yù)變性Imin ;96°C變性10s，52°C退火5s，60°C延伸30s，28個循環(huán)，4°C保存，PCR反應(yīng)可選擇在9700熱循環(huán)儀(ABI公司)中進(jìn)行。(4) 二次純化反應(yīng)總體積7 iiL，反應(yīng)結(jié)束后每反應(yīng)產(chǎn)物中加入SAP酶(I. OU/U UliiL ;反應(yīng)程序37°C反應(yīng)60min，75°C滅活反應(yīng)15min，4°C保存，反應(yīng)可選擇在9700熱循環(huán)儀(ABI公司)中進(jìn)行。(5)毛細(xì)管電泳反應(yīng)體系總體積10. L，Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9ii L，內(nèi)標(biāo)LIZ-120(ABI公司)0. 2iiL，第二次純化產(chǎn)物IiiL;反應(yīng)程序95°C變性5min，立即置冰上5min。在ABI公司遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳,應(yīng)用GeneMapper系列軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析。(6)結(jié)果分析根據(jù)峰顏色來區(qū)分野生型、雜合突變和純合突變，得出其多態(tài)圖譜(圖3)，分析其基因型。本具體實施方式
中的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計時選擇目的區(qū)域上下游70_150bp的距離作為引物設(shè)計的起始部位，引物與之序列匹配的特異性要好，引物間的退火溫度要盡量一致(55°C左右)。使在一個多重PCR反應(yīng)中的各個擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率相當(dāng)。本具體實施方式
具有高通量、高效能、低成本、簡單適用，適合中國人群的葉酸利用能力基因檢測。采用多重PCR加上引物延伸微測序技術(shù)，在一個反應(yīng)管中同時完成14個基因16個位點(diǎn)的基因分型的優(yōu)點(diǎn)I、相對于傳統(tǒng)Sanger直接測序法，本檢測方法可同時檢測不同基因的16個多態(tài)位點(diǎn)，技術(shù)穩(wěn)定，結(jié)果容易判讀，成本低廉。2、相對于SSCP和RFLP兩種方法，本方法不受是否存在限制性酶切位點(diǎn)的限制，且可同時檢測多個位點(diǎn)。3、相對于DHPLC檢測方法，本檢測方法不但可以同時檢測多個位點(diǎn)，而且突變具體類型判斷更加準(zhǔn)確。4、相對于基因芯片技術(shù)，本檢測方法成本低廉，操作簡單，凡是具有分子生物學(xué)實驗相關(guān)經(jīng)驗的人員均可完成。實施例一先天性心臟病患者葉酸利用能力基因檢測I、檢測樣本樣本來源于蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心非綜合征型患者DNA文庫，均是蘇州大市為主的蘇南地區(qū)患者，其中男71例，女54例，庫中所有患者樣本收集前均簽署了知情同 意書。2、檢測方案見具體實施方式
的檢測方法。3、檢測結(jié)果根據(jù)野生型和突變型峰的顏色不同進(jìn)行判斷，88例先心病樣本中，發(fā)現(xiàn)DHFR、MTR、SHMT, TCN2、TYMS基因突變分布頻率與正常對照組有顯著差異，參見附件4。
基因多態(tài)位點(diǎn)CHD患者例數(shù)(所占百分?jǐn)?shù))正常人群例數(shù)(所占百分?jǐn)?shù))
__野生型純合突變雜合突變—寄生型純合突變雜合突萎一
CBS__C699T 80(90.91%) 0(0.00%) 8(9.09%) 83(94.32%) 0 (0.00%) 5(5.68%)
DHFR A594dell9G 16(18.18%)* 35(39.77%) 37(42.05%) 7(7.95%) 42(47.73%) 39(44.32%)
FOLHl 一 T1561C 40(45.45%) 10(11.36%) 38 (43. 18%) 38(43. 18%) 9(10.23%) 41 (46.59%)
GSTOl 一 C428A 80 (90.90%) 0(0.00%) 8(9. 10%) 82(93.18%) 0(0.00%) 6(6.82%)
G878A 86(97.73%) 0(0.00%) 2(2.27%) 88(100%) Q (0.00%) 0(0.00%)
G1958A 46 (52. 27%) 2(2.27%) 40(45.45%) 41 (46. 59%) 6 (6. 82%) 41 (46. 59%)
C677T 34 (38.64%) 15(17.05%) i9(44.32%) 26(29.55%) 22(25.00%) 40(45.45%)
MTHFR _____________________--.
A1298C 61(69.32%) 2(2.27%) 25(28.41%) 56(63.64%) 3(3.41%) 29(32.95%)
MTRA2756G76(86.36%)1(1. 14%)11(12.50%)65(73.86%)*9(10.23%)14(15.91%)
MTRRA66G54(61.36%)3(3.41%)31(35.23%)50 (56.82%)5(5.61%)33(37.50%)
NATl__C1095A28(31.82%)29(32.95%)31(35.23%)27(30.68%)19(21.59%)42 (47.73%)
NFE2L2 ins+C11108T78(88.64%)0 (0.00%)10(11.36%)0(90. 1%)80 (90.9%)8 (9. 10%)附件4 :先天性心臟病和對照樣本(各88例)突變分布頻率
權(quán)利要求
1.葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含 (1)PCR反應(yīng)試劑，包括dNTP、5X和IOXPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix 混合液； (2)按一定比例混合的16對PCR引物混合物； (3)按一定比例混合的16條延伸引物混合物； (4)純化用SAP酶、ExonI酶及其配套的緩沖液； (5)單個位點(diǎn)純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA； (6)使用說明書。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于它的檢測方法為使用Primer 5> Gene runner和MassARRAY Assay Design引物設(shè)計軟件協(xié)助設(shè)計引物，通過多重PCR擴(kuò)增，使被檢測樣本的16個目的片段得到擴(kuò)增富集；然后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化，去除多余的引物及dNTP“雜質(zhì)”;再利用針對突變位點(diǎn)設(shè)計的16條延伸引物，對16個富集的片段進(jìn)行單堿基的延伸反應(yīng)，僅對突變位點(diǎn)的單個堿基進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，突變位點(diǎn)匹配上一個熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸后終止延伸；然后再進(jìn)行一次擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化；最后經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段分析，相當(dāng)于單個位點(diǎn)的微測序，這樣可以檢測單核苷酸的突變，延伸位點(diǎn)堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸引物的片段長度決定峰的位置，延伸引物的濃度影響電泳檢測的峰高。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于所述的試劑盒包含檢測CBS基因C699T、DHFR基因c594+59del 19、FOLHl基因T1561C、GSTOl基因 C428T、MTHFDl 基因 G878A、MTHFD 基因 G1958A、MTHFR 基因 A1298C、MTHFD 基因 C677T、MTR 基因 A2756G、MTRR 基因 A66G、NAT1 基因 C1095A、NFE2L2 基因 insl+C11108T、RFCl 基因G80A、SHMTl基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六個基因突變位點(diǎn)的引物 第一組所述檢測CBS基因C699T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P1_F TTTCTATGCAGTACCGCAACG ；Pl-R AATCAAGATGGACAGAGGGAC ；延伸引物E1 (T) 22AGCAACCCCCTGGCTCACTA ； 第二組所述檢測DHFR基因c594+59dell9位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P2_F ACTGCATCGTCGCTGTGTC ；P2-R CGGGCAGAAATCAGCAAC ；延伸引物E2 (T) 34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT ； 第三組所述檢測FOLHl基因T1561C位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P3_F TCCAACTTCAGAAACCTT ；P3-R TTAGTATACCGTGCTCTGC ；延伸引物E3 (T) 34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT ； 第四組所述檢測GSTOl基因C428T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P4-F ATTCTCTGTCTAGGTGCCATC ；P4-R CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC ；延伸引物E4 (T) 29CCAAAATAAAGAAGACTATG ； 第五組所述檢測MTHFDl基因G878A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P5_F GCTTGAAACTGAGGTGAG ；P5-R AGGTTGTTATACTGAATCATCC ；延伸引物E5 (T) 4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC ； 第六組所述檢測MTHFD基因G1958A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P6_F GTTTGCCAACATCGCACATG ；P6-R CTAACCTACAAACCCTTCTGG ；延伸引物E6 (T) 12CCTCCATCATTGCAGACC ； 第七組所述檢測MTHFR基因A1298C位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P7_F CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC ；P7-R TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC ；延伸引物E7 (T) 31GGAGGAGCTGACCAGTGAAG ； 第八組所述檢測MTHFD基因C67H位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P8_F TGAAGCACTTGAAGGAGAAGG ；P8-R CCTTCACAAAGCGGAAGAATG ；延伸引物E8 (T) 12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG ； 第九組所述檢測MTR基因A2756G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P9_F CATTGACCATTACTACACCAG ；P9-R TCTGTTTCTACCACTTACCTTG ； 延伸引物E9 ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG ； 第十組所述檢測MTRR基因A66G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P10-F TATATGCTACACAGCAGGGAC ；PlO-R GGCTCTAACCTTATCGGATTC ；延伸引物E10 (T) 20AAGGCCATCGCAGAAGAAAT ； 第i^一組所述檢測NATl基因C1095A位點(diǎn)突變的引物的堿基序 列為擴(kuò)增引物P11-F CTAGACATCAAATCATTTCACC ；Pll-R CTTTCTAGCATAAATCACCAAT ； 延伸引物E11 TAACCACAGGCCATCTTTAAAA ； 第十二組所述檢測NFE2L2基因insl+C11108T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P12-F AACTGACTGAGCAACTATTACG ；P12-R ATTGCTCCTCTGTGTCTCC ；延伸引物E12 (T) 14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG ； 第十三組所述檢測RFCl基因G80A位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P13-F CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG ；P13-R AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA ；延伸引物E13 : (T) 25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC ； 第十四組所述檢測SHMTl基因C1420T位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為擴(kuò)增引物P14-F GTTCAAGGAGAGACTGGC ；P14-R GCTCATCCATCTCTCAGG ；延伸引物E14 (T) 7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT ； 第十五組所述檢測TCN2基因C776G位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P15-F TCCTCACTCTATCACCAGTTC ；P15-R TCATGAGAGCATTCTGGAAGG ；延伸引物E15 (T)38CCTCATGACTTCCCCCATGC ； 第十六組所述檢測TYMS基因1494del6位點(diǎn)突變的引物的堿基序列為 擴(kuò)增引物P16-F AGGAACTGAGCAGATAAGTGG ；P16-R CGATCATGATGTAGAGTGTGG ；延伸引物E16 : (T)4qGAGTGTGGTTATGAACTTTA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于所述的PCR引物及延伸引物，用于針對人類基因組中目的DNA區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增以及目的位點(diǎn)進(jìn)行微測序，進(jìn)而達(dá)到基因分型的目的，以實現(xiàn)特定核苷酸變異的檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增引物和延伸弓I物濃度的優(yōu)化配置，使其能夠在延伸反應(yīng)時兼顧各個位點(diǎn)的產(chǎn)量，利于后續(xù)檢測中各個位點(diǎn)突變情況的判斷識別。
全文摘要
葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，它涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含(1)PCR反應(yīng)試劑，包括dNTP、5×和10×PCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；(2)按一定比例混合的16對PCR引物混合物；(3)按一定比例混合的16條延伸引物混合物；(4)純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；(5)單個位點(diǎn)純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA；(6)使用說明書。它能提供一種簡單、高通量、高效能、低成本的適合中國人群的葉酸利用能力基因突變篩查方法。
文檔編號C12Q1/68GK102676645SQ20111034884
公開日2012年9月19日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者李紅, 毛君, 王本敬, 陳瑛 申請人:蘇州市立醫(yī)院