專利名稱：一種提高綠豆葉肉原生質(zhì)體分裂頻率以培養(yǎng)再生器官的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種培養(yǎng)綠豆原生質(zhì)體，提高該原生質(zhì)體分裂頻率，從而培養(yǎng)再生器官的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
豆科植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)是具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的豆科作物遺傳操作的重要手段。綠豆原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究已有報(bào)道〔1〕，〔2〕，但器官發(fā)生較難，分化成苗者更未見(jiàn)報(bào)道，影響綠豆葉肉原生質(zhì)體器官發(fā)生的原因是多方面的，植物激素是其中最重要因素之一。對(duì)于促進(jìn)綠豆葉肉原生素體分裂頻率的研究也未見(jiàn)于報(bào)道。
本發(fā)明認(rèn)為影響原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得成功的因素是多方面的，但植物的激素是豆科植物原生質(zhì)體培養(yǎng)中至關(guān)重要的因素之一，植物激素在誘導(dǎo)再生細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)培養(yǎng)物脫分化，形態(tài)發(fā)生和發(fā)育中起著相當(dāng)重要的作用。本發(fā)明的目的在于通過(guò)研究植物激素對(duì)綠豆原生質(zhì)體分裂的影響，提供出提高綠豆原生質(zhì)體分裂頻率的方法。
材料和方法一、試管苗的培育取綠豆種子為試材，先經(jīng)海鷗洗滌劑清洗3～5分鐘，于70%(V/V)酒精浸漬2～3分鐘，在0.1%升汞溶液中滅菌15分鐘，用無(wú)菌水洗滌3～5次后置于MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基約在1～1.1Kg/cm2壓力下滅菌20分鐘，接種于培養(yǎng)基上的種子，在26±1℃，1500-2000勒克斯培養(yǎng)條件下每天光照10小時(shí)，取培養(yǎng)9～21天試管苗真葉作游離葉肉原生質(zhì)體的材料。
二、葉肉原生質(zhì)體的游離和培養(yǎng)切取幼嫩真葉，剪成1～1.5mm薄片，置入混合酶液內(nèi)分離原生質(zhì)體，混合酶液是由0.7%(W/V)纖維素酶(“ONOZUKA”R-10 Yakult Pharmaceutical Industry Co.Ltd.Japan)，0.7%(W/V)半纖維素酶(No.H-2125，Sigma Chemical Company，U.S.A)和0.4%(W/V)果膠酶及CPW 13M甘露醇〔5〕組成。PH5.6。酶液經(jīng)微孔濾器(抽濾膜孔徑為0.45μ)滅菌，材料置于26±1℃恒溫?fù)u床(45-50轉(zhuǎn)/分)17小時(shí)，然后用400目鎳網(wǎng)過(guò)濾，去除細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)，用離心機(jī)(500轉(zhuǎn)/分)離心2分鐘收集原生質(zhì)體，再用CPW 13M溶液漂洗原生質(zhì)體三次，最后以所試原生質(zhì)體培養(yǎng)基制成懸浮液，原生質(zhì)體密度為105-106個(gè)/毫升。
將原生質(zhì)體懸浮液分裝到細(xì)胞培養(yǎng)瓶(60×30×20mm)，每瓶1至2毫升，在27±0.5℃人工氣象箱內(nèi)弱光(200-300勒克斯)下靜止培養(yǎng)。
選用D2A培養(yǎng)基〔3〕(鐵鹽和微量元素用量按MS培養(yǎng)基)為原生質(zhì)體培養(yǎng)基，各組成成份列為表Ⅰ，選用生長(zhǎng)素2，4-D，NAA，細(xì)胞分裂素ZEA，BAP及其它激素GA3五種植物激素進(jìn)行各種配比組成試驗(yàn)，每種激素濃度均為0.5毫克/升。在培養(yǎng)7天后，于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。原生質(zhì)體分裂的百分率為分裂的原生質(zhì)體數(shù)/成活原生質(zhì)體總數(shù)×100%，每次計(jì)數(shù)500個(gè)以上原生質(zhì)體，每種處理重復(fù)三次以上。
試驗(yàn)結(jié)果一、單一植物激素對(duì)綠豆葉肉原生質(zhì)體分裂的作用在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加2，4-D，6BA，ZEA，NAA，GA3任何一種激素時(shí)，原生質(zhì)體分裂頻率均較低(表二)，其中2，4-D，BAP，ZEA三組合頻率相仿，單一使用NAA與GA3時(shí)，對(duì)原生質(zhì)體生長(zhǎng)不利，GA3不利更加明顯。
二、激素組合和激素組的效應(yīng)在控制培養(yǎng)組織的分化試驗(yàn)中，激素的組合甚為重要。本發(fā)明采用生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素結(jié)合使用，或同時(shí)使用二種生長(zhǎng)素，或同時(shí)使用二種細(xì)胞分裂素(表三)，結(jié)果表明，不同激素組合的效應(yīng)有很大差異。按表三所獲結(jié)果可歸納出如下幾點(diǎn)1.在培養(yǎng)基中添加一種生長(zhǎng)素(為便于分析，把GA3歸為生長(zhǎng)素類)和一種細(xì)胞分裂素時(shí)，不同組合間激素效應(yīng)畋鷙苊饗?。生长?，4-D與細(xì)胞分裂素ZEA及BAP二類植物激素混合使用時(shí)，對(duì)原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂表現(xiàn)了良好的協(xié)同作用。
2.NAA無(wú)論與細(xì)胞分裂素BAP或ZEA相配比時(shí)，原生質(zhì)體分裂頻率下降明顯，表現(xiàn)了仰制效應(yīng)。赤霉素在與BAP，ZEA混合時(shí)亦相當(dāng)明顯地具有不利影響。
3.在綠豆葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)基中二種生長(zhǎng)素時(shí)2，4-D無(wú)論在與NAA或GA3配比混合，結(jié)果均表現(xiàn)了對(duì)原生質(zhì)體分裂的不利影響。而值得注意的是，在培養(yǎng)基中含有NAA與GA3混合激素成份時(shí)，原生質(zhì)體分裂頻率很低，強(qiáng)烈地抑制了原生質(zhì)體的生長(zhǎng)與分裂。
4.采用二種細(xì)胞分裂素BAP與ZEA組合，其分裂頻率雖較低，但比添加二種生長(zhǎng)素配比組合要高。
綜上所述并與表二結(jié)果相比可知，單獨(dú)使用一種植物激素時(shí)效果欠佳，即便采用二種同類植物激素(生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素)對(duì)綠豆葉肉原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂亦無(wú)良好的作用。
三、四種激素成份配比對(duì)原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂頻率的影響。
為了進(jìn)一步測(cè)試多種激素混合配比對(duì)綠豆葉肉原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了四種激素成份配比試驗(yàn)，并以添加五種激素成份組合及無(wú)激素組合加以比較。由

圖1可以看出，不同激素配比組合對(duì)綠豆葉肉原生質(zhì)體分裂頻率的提高確有異乎尋常的作用。附加2，4-D，NAA二種生長(zhǎng)素和BAP，ZEA二種細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基，促進(jìn)原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂效果特別顯著，分裂頻率可達(dá)7.86%，是本發(fā)明所有處理中分裂頻率最高的組合。若在上述激素組合中去掉2，4-D而添加GA3時(shí)，分裂頻率降至5.48%，但總的效應(yīng)表現(xiàn)較好。
若在分裂頻率最高的組合中添加GA3時(shí)，也即五種激素2，4-D，NAA，BAP，ZEA和GA3各以0.5毫克/升濃度同時(shí)存在時(shí)，原生質(zhì)體頻率明顯降止1.45%，再次表現(xiàn)了GA3在此組合形式中對(duì)綠豆葉肉原生質(zhì)體分裂的抑制作用。
此外，由附圖1中不難看出，在四種激素配比組合中有GA3，2，4-D同時(shí)存在時(shí)，不論再添加BAP和ZEA或NAA，BAP，或NAA，ZEA，其分裂頻率最高在2.65%，最低為1.91%。上述三種激素配比方式顯然遠(yuǎn)不如2，4-D，NAA，BAP，ZEA四種激素配比組合為好。
四、細(xì)胞分裂及愈傷組織誘導(dǎo)與根的形成附圖2-a是綠豆葉肉原生質(zhì)體。原生質(zhì)體在適合的激素配比組合培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3天后，膨大拉長(zhǎng)變成橢圓形，培養(yǎng)4～7天后，見(jiàn)到再生細(xì)胞的第一次分裂(附圖2-b)，細(xì)胞分裂大致有均等分裂及不等分裂二種情況，7～12天可見(jiàn)到第二次分裂(附圖2-c)，15天左右可見(jiàn)到10～12個(gè)細(xì)胞的多細(xì)胞團(tuán)(附圖2-d)，20天左右原生質(zhì)體培養(yǎng)物均出現(xiàn)了直接為1～2毫米的肉眼可見(jiàn)的小愈傷組織(附圖2-e)。此時(shí)轉(zhuǎn)至愈傷組織擴(kuò)增培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基成份中去除甘露醇，葡萄糖用量增至5000毫克/升蔗糖濃度相同，瓊脂的最終濃度為0.6%，其它成份與表一相同。培養(yǎng)25天左右，愈傷組織生長(zhǎng)良好并呈現(xiàn)淡綠色。將此愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中激素成份為為BAP及ZEA，濃度各為0.1毫克/升)，20天后愈傷組織迅速擴(kuò)增，但未見(jiàn)器官分化，此時(shí)愈傷組織逐步變褐色，僅見(jiàn)邊緣部分有綠色。再次轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基擴(kuò)增愈傷組織，經(jīng)60多天三次轉(zhuǎn)接，愈傷組織生長(zhǎng)良好。再次轉(zhuǎn)至2，4-D濃度為3毫克/升及BAP濃度為0.2毫克/升培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，出現(xiàn)類似胚狀體的結(jié)構(gòu)，18天后即見(jiàn)根產(chǎn)生(附圖2-f)。隨著根的生長(zhǎng)，愈傷組織變褐，誘導(dǎo)芽的分化試驗(yàn)正在進(jìn)行。
在那些原生質(zhì)體分裂頻率低，不適宜原生質(zhì)體生長(zhǎng)的激素配比組合中，在培養(yǎng)2～3天后原生質(zhì)體大部分不膨大拉長(zhǎng)，有的即使膨大，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)含量少，空泡化細(xì)胞增多，有的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞壁皺縮，細(xì)胞質(zhì)收縮，邊緣粗糙成團(tuán)現(xiàn)象。此時(shí)即使出現(xiàn)少量一次分裂細(xì)胞，但不能持續(xù)分裂，最終導(dǎo)至解體死亡。
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞分裂及器官發(fā)生過(guò)程中外源激素之間的相互作用，提供了綠豆葉肉原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法，提高了原生質(zhì)體的分裂頻率，選擇了原生質(zhì)體誘導(dǎo)愈傷組織擴(kuò)增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中的激素成份，通過(guò)四個(gè)月的培養(yǎng)，由愈傷組織誘導(dǎo)出根的生長(zhǎng)。
眾所周知，豆科植物是重要的籽粒用糧食經(jīng)濟(jì)作錚侍迮嘌際醯牟歡賢黃樸臚晟疲雇庠茨康幕虻牡既氤晌贍?，栽湽科謪㈡k旨際跎轄儺碌耐揪丁
表一原生質(zhì)體培養(yǎng)基成份物鹽(毫克/升)CaCl2900 H3BO36.2KNO31484 MnSO4·4H2O 22.3NH4NO3270 ZnSO4·7H2O 8.6KH2PO480 KI 0.83MgSO4·7H2O 900 Na2MoO4·2H2O 0.375FeSO4·7H2O 27.8 CuSO4·5H2O 0.025Na2-EDTA 37.3 CoCl2·6H2O 0.025維生素(毫克/升)鹽酸硫胺素4生物素10.64鹽酸素0.7煙酸4.0氨基酸(毫克/升)葉酸0.4精氨酸10肌醇100谷氨酰胺293.2激素(毫克/升)Zea2，4-D0.5Zeatin0.5NAA 0.5 GA30.5BAP0.5葡萄糖30000甘露醇45000蔗糖30000水解乳蛋白LH500PH5.6
表二單一激素對(duì)葉肉原生質(zhì)體分裂的影響激素培養(yǎng)7天后的一次分裂百分比(%)2，4-D0.78BAP0.70Zeatin0.76NAA0.40GA30.19
表三不同激素組合對(duì)原生質(zhì)體分裂的效應(yīng)激素(0.5毫克/升)培養(yǎng)7天后分裂總頻率一次分裂(%)二次分裂(%)一種生長(zhǎng)激素與細(xì)胞分裂素混合2，4-DBAP4.320.034.352，4-DZeatin3.851.235.08NAABAP0.5900.59NAAZeatin0.3400.34GA3BAP 0.56 0 0.56GA3Zeatin 0.27 0 0.27二種生長(zhǎng)素混合2，4-DNAA0.360.030.392，4-D GA30.28 0.03 0.31NAA GA30.05 0 0.05二種細(xì)胞分裂素混合BAPZeatin0.9600.96培養(yǎng)基的其它成份見(jiàn)表一。
參考文獻(xiàn)1.黃美娟、李向輝等1982“中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所研究工作年報(bào)P34。
2.Xu.Z.H，et.al.，1981ZPhanrenphysiol.，104289-2983.Li.X.H.，1981Theor.Appl.Genet.，60345-34權(quán)利要求
1.一種從綠豆葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生器官的方法，本發(fā)明的特征由下列各項(xiàng)構(gòu)成a.采用HgCl2的消毒得到無(wú)菌的綠豆種子；b.使消毒的無(wú)菌綠豆種子在25-26℃光照條件下，在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)9-21天；c.切取幼嫩葉子；d.切割小塊的綠豆幼嫩葉片浸入含有混合酶液的CPW13M溶液中，其中酶液成份為0.1%(w/v)纖維素酶，0.4%(w/v)果膠酶；e.按d所制備的混合物試驗(yàn)材料，置于25-27℃搖床上處理17小時(shí)；f.經(jīng)酶介17小時(shí)后用濾網(wǎng)過(guò)濾以便去除細(xì)胞及碎片，然后離心沉淀原生質(zhì)體；g.用CPW13M溶液漂洗收集原生質(zhì)體；h.在含有糖及植物激素2.4-D，NAA，BAP，Zeatip的原生質(zhì)體培養(yǎng)基上進(jìn)行原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)；i.對(duì)綠豆原生質(zhì)體在27℃及光照條件下進(jìn)行淺層液體懸浮培養(yǎng)，約25天左右形成1～2毫米大小的愈傷組織；j.直徑在1～2毫米的愈傷組織轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增。k.愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基，經(jīng)多次繼代，至出現(xiàn)類似胚狀體結(jié)構(gòu)；l.在含有植物激素的分化培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，一部分處理分化產(chǎn)生不定根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)再生器官的方法，其特征在于所采用的原生質(zhì)體培養(yǎng)基含有生長(zhǎng)素2，4-D，NAA和細(xì)胞分裂素BAP，ZEA，其濃度用量分別在0.3～0.7毫克/升范圍內(nèi)，在此原生質(zhì)體培養(yǎng)基上原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂頻率達(dá)7.86%左右。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)再生器官的方法，其特征在于所采用的原生質(zhì)體誘導(dǎo)愈傷組織擴(kuò)增培養(yǎng)基中BAP及ZEA濃度分別在0.3～0.7毫克/升范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)再生器官的方法，其特征在于所采用的分化培養(yǎng)基中2，4-D濃度為1～2毫克/升，BAP濃度為0.1～0.4毫克/升。
全文摘要
在對(duì)綠豆葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)中，用附加濃度分別為0.5毫克/升的生長(zhǎng)素NAA，2，4-D與細(xì)胞分裂素BAP，ZTA的D
文檔編號(hào)C25C7/00GK1038315SQ8810353
公開(kāi)日1989年12月27日 申請(qǐng)日期1988年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月8日
發(fā)明者王韞珠, 葛扣林 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)