專利名稱：一種檢測(cè)三聚氰胺的方法及其專用試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)三聚氰胺的方法及其專用試紙。
背景技術(shù)：
三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物。其含氮量高達(dá)66%，白色單晶斜 晶體，無味。因其易于購(gòu)買和生產(chǎn)，成本低，固有不法廠商針對(duì)凱氏定氮法的不足， 將其添加于食品和飼料中以提高蛋白含量，獲取利益。雖然三聚氰胺屬于低毒性化 合物，但其在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)代謝為三聚氰酸，三聚氰胺與三聚氰酸發(fā)生反應(yīng)并累積， 可引起膀胱結(jié)石和泌尿道病變。膀胱結(jié)石長(zhǎng)期刺激，可出現(xiàn)膀胱腫瘤。因此，在實(shí) 踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡(jiǎn)單、成本低、適合大規(guī)模推廣的檢測(cè)方法
目前，三聚氰胺殘留量的常規(guī)檢測(cè)方法有兩種一種是色譜分析，如高效液相色 譜法(HPLC)、液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MSMS)， 由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩査。另一種為免 疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。它的缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用較高，不 利于在基層單位進(jìn)行推廣使用，并且都需要專業(yè)技術(shù)人員檢測(cè)。目前，三聚氰胺殘 留量的常規(guī)檢測(cè)方法主要有液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)、高效液相色譜(HPLC)、 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MSMS)等，但是這些方法存在著儀器設(shè)備復(fù)雜、檢測(cè)過 程繁瑣和對(duì)檢驗(yàn)人員的技能要求高的缺點(diǎn)，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣品的篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)三聚氰胺的試紙。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)三聚氰胺的試紙，包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng) 膜和吸水墊，其依次連接；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異 性抗體；三聚氰胺特異性抗體可為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；反 應(yīng)膜上包被有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；當(dāng)三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體時(shí)， 檢測(cè)區(qū)包被三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗兔抗抗體；當(dāng)三聚氰胺特 異性抗體為三聚氰胺單克隆抗體時(shí)，檢測(cè)區(qū)包被三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控 區(qū)包被羊抗鼠抗抗體；所述半抗原如下其中，所述結(jié)合物釋放墊中有1/3-1/2區(qū)域被所述樣品吸收墊覆蓋。 所述反應(yīng)膜包被有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，其中所述的檢測(cè)區(qū)位于近于所述結(jié)合物釋
放墊的末端的一側(cè)，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離所述結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；所述檢
測(cè)區(qū)距所述結(jié)合物釋放墊的末端5-8mm，優(yōu)選為6mm;所述質(zhì)控區(qū)距所述檢測(cè)區(qū)
4-7mm， 優(yōu)選為5mm。
所述檢測(cè)區(qū)和所述質(zhì)控區(qū)均為與所述試紙的長(zhǎng)相垂直的條帶狀。 所述結(jié)合物釋放墊包被膠體金標(biāo)記的三聚氰胺單克隆抗體，其包被密度為
0. l-O. 2ug/cm2，優(yōu)選0. lug/cm2。
所述三聚氰胺單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCC No. 2716的對(duì)三聚氰胺藥物單
克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-4分泌產(chǎn)生的抗體；所述抗抗體可為羊抗鼠IgG;所述載體
蛋白可為卵血清蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀腺蛋白等。 所述試紙中包括底板，所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊固定
在所述底板上。
所述試紙具體可為條狀；為了便于使用，所述條狀的試紙可以覆蓋有保護(hù)膜或 裝在盒內(nèi)。
所述保護(hù)膜可以覆蓋所述試紙的兩端(如覆蓋樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊和吸 水墊)
所述盒由底座和蓋構(gòu)成，底坐和蓋通過卡齒和卡孔相連接；所述底座上有與所 述蓋連接的卡齒和與所述試紙相匹配的凹槽；所述蓋上有加樣孔、觀察窗和與底座 卡齒相配的卡孔，所述加樣孔的位置與所述樣品吸收墊的位置相對(duì)應(yīng)，所述觀察窗 與所述反應(yīng)膜上的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)相對(duì)應(yīng)；所述試紙位于所述凹槽內(nèi)；所述觀察窗上印有T和C， T表示檢測(cè)線，在靠近所述加樣孔側(cè)，C表示質(zhì)控線，在遠(yuǎn)離所述加 樣孔側(cè)。
底板可由不吸水的韌性材料制成，如硬質(zhì)塑料、不吸水硬紙，具體可為PVC板 材；樣品吸收墊可由玻璃纖維棉、聚酯材料(聚酯絲或聚酯棉)、尼龍膜、聚偏二 氟乙烯膜或聚酯膜制成；結(jié)合物釋放墊可由玻璃纖維制成；吸水墊可為吸濾紙或慮 油紙；反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或?yàn)榧兝w維素膜；所述保護(hù)膜可為PE材質(zhì)的保護(hù) 膜。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述試紙的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述試紙的方法，是將樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng) 膜和吸水墊依次連接；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗 體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；所述 反應(yīng)膜上包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)區(qū)包被有半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū) 包被有抗抗體；
所述樣品吸收墊在進(jìn)行所述連接前，先在如下溶液中浸泡l-3h，再進(jìn)行干燥 含0.3-0. 5% (體積百分含量)鼠血清蛋白、pH值為9. 6-10.0、 0. 1-0. 2mol/L的碳 酸鹽緩沖液；
所述包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體的結(jié)合物釋放墊是按照如下方 法制備的將包被前的結(jié)合物釋放墊先在如下溶液中浸泡20-40秒，干燥，再進(jìn)行 所述膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體包被含有0.8-1.2% (體積百分含量)牛血 清白蛋白、pH值為7.2-7.8 、 0. 1-0.2mol/L硼砂-硼酸緩沖液。
上述方法中，使所述結(jié)合物釋放墊中有1/3-1/2區(qū)域被所述樣品吸收墊覆蓋。
所述反應(yīng)膜包被有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，其中所述的檢測(cè)區(qū)位于近于所述結(jié)合物釋 放墊的末端的一側(cè)，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離所述結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；所述檢 測(cè)區(qū)距所述結(jié)合物釋放墊的末端5-8mm，優(yōu)選為6mm;所述質(zhì)控區(qū)距所述檢測(cè)區(qū) 4-7mm,優(yōu)選為5ram。
上述方法中所用的三聚氰胺單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCC No. 2716的對(duì)三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-4分泌產(chǎn)生的抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)三聚氰胺的方法。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)三聚氰胺的方法，是將待檢測(cè)樣品進(jìn)行前處理，然后用上 述任一所述試紙進(jìn)行檢測(cè)；所述前處理的方法如下當(dāng)所述樣品為牛奶時(shí)，樣品前處理的方法為將牛奶與0.05-0. 1M磷酸鹽緩沖 液以l: 15-25的體積比混勻，取樣用于檢測(cè)；
當(dāng)所述樣品為奶粉時(shí)，樣品前處理的方法為將每lg奶粉溶于18-25ml、 pH 為6.0-6. 8、 0.01-0.02M磷酸鹽緩沖液中，超聲10-20min，離心，取樣用于檢測(cè)；
當(dāng)所述樣品為飼料時(shí)，樣品前處理的方法為將每lg飼料與9-15ml乙腈與鹽 酸的混合溶液混勻，超聲提取10-15 min，取lml上清液，干燥，加入0. 5-1. 5ml 正己垸混勻，再加入1. 0-2. Oml 0.01-0.02M磷酸鹽緩沖液混勻，離心，取下層水 相用于檢測(cè)；所述乙腈與鹽酸的混合溶液中乙腈與0. 05-0. 1M鹽酸的體積比為4-6: 1。
本發(fā)明試紙的檢測(cè)原理當(dāng)在試紙的樣品吸收墊端滴加待測(cè)樣品溶液后，待檢 溶液通過結(jié)合物釋放墊中的金標(biāo)抗體一起向反應(yīng)膜擴(kuò)散，并最終滲入濾紙中；若待 檢測(cè)樣品溶液中三聚氰胺的含量高，則擴(kuò)散過程中待檢測(cè)樣品溶液中的三聚氰胺可 與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而完全封閉金抗體上三聚氰胺的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體 與反應(yīng)膜上偶聯(lián)三聚氰胺載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，不能顯示檢測(cè)印跡，檢測(cè)區(qū)不 顯色，而羊抗鼠IgG抗體則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色，形成一條紅色對(duì)照印 跡"I"，呈一條印跡為陽性；若待檢測(cè)樣品溶液中三聚氰胺的含量低或無，則金 標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)不能被封閉，進(jìn)而金標(biāo)抗體會(huì)與纖維素膜上偶聯(lián)三聚氰胺 的載體蛋白檢測(cè)印跡結(jié)合，檢測(cè)區(qū)顯示紅色印跡"I "，同樣羊抗鼠IgG抗體也與 金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)也顯示紅色對(duì)照印跡"I "，形成兩條紅線"II "陰性標(biāo)記； 如果纖維素膜上沒有紅色標(biāo)記顯示，則試紙無效。
本發(fā)明的膠體金試紙具有敏感度高、特異性高、精密度高、準(zhǔn)確度高、成本低、 操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。其中， 采用高特異性的三聚氰胺單克隆抗體，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性；將結(jié)合物釋放墊 部分區(qū)域用樣品吸收墊覆蓋，能夠延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果觀察時(shí)間，同時(shí)也使待檢測(cè)樣品溶 液被充分吸收進(jìn)而能與金標(biāo)抗體完全接觸、充分反應(yīng)，從而減少誤差；試紙上單克 隆抗體包被量的設(shè)計(jì)、檢測(cè)區(qū)與結(jié)合物釋放墊之間的距離及質(zhì)控區(qū)與檢測(cè)區(qū)的距離 的設(shè)計(jì)都進(jìn)一步提高了試紙檢測(cè)的精確度。用本發(fā)明試紙檢測(cè)三聚氰胺的方法，簡(jiǎn) 便、快速、直觀、準(zhǔn)確，適用范圍廣，成本低，易推廣應(yīng)用。


圖l為試紙剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為帶有保護(hù)膜的試紙的俯視圖。
圖3為帶有試紙盒的試紙的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4為帶有試紙盒的試紙的檢測(cè)結(jié)果的判斷。 圖5為三聚氰胺與溴乙酸叔丁酯反應(yīng)中產(chǎn)生的中間產(chǎn)品I 。 圖6為中間產(chǎn)品I通過水解反應(yīng)得半抗原。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、檢測(cè)三聚氰胺的試紙的構(gòu)成
一、不帶有保護(hù)膜或試紙盒的試紙(圖l):
所述試紙由樣品吸收墊1、結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3、吸水墊4和底板7組成； 所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次按順序黏貼在所述底板
上，結(jié)合物釋放墊從其始端起有l(wèi)/3區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末端
與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底
板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；
所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的由保藏號(hào)為CGMCC No. 2716的對(duì)三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-4分泌的抗體，包被量為0. lug/cm2。
所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均為與所述試紙的長(zhǎng)相 垂直的條帶狀；檢測(cè)區(qū)位于近于結(jié)合物釋放墊末端的一側(cè)，距結(jié)合物釋放墊末端 5mm;質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊末端的一側(cè)，距所述檢測(cè)區(qū)4mm;檢測(cè)區(qū)包被有 三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶聯(lián)物)，質(zhì)控區(qū) 包被有羊抗鼠IgG;所述半抗原如下底板由PVC板材制成；樣品吸收墊可由玻璃纖維棉制成；結(jié)合物釋放墊由玻璃 纖維制成；吸水墊為吸濾紙；反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜。
所述試紙為3-5mm寬的矩形條狀。
二、 帶有保護(hù)膜的試紙(稱作試紙條)(圖2):
所述試紙由樣品吸收墊1、結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3、吸水墊4和底板7組成；
所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次按順序黏貼在所述底板 上，結(jié)合物釋放墊從其始端起有1/2區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末端 與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底 板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；
所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的由保藏號(hào)為CGMCC No. 2716的對(duì)三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-4分泌的抗體，包被量為0. 2ug/cm2。
所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均為與所述試紙條的長(zhǎng) 相垂直的條帶狀；檢測(cè)區(qū)位于近于結(jié)合物釋放墊末端的一側(cè)，距結(jié)合物釋放墊末端 8rara;質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊末端的一側(cè)，距所述檢測(cè)區(qū)7mm;檢測(cè)區(qū)包被有 三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶聯(lián)物)，質(zhì)控區(qū) 包被有羊抗鼠IgG;所述半抗原同一中所述相同。
將所述試紙兩端黏貼保護(hù)膜，再用機(jī)器切成3-5mm寬的小條，優(yōu)選3mm。
保護(hù)膜8-1覆蓋在吸水墊上手柄端，保護(hù)膜8-2覆蓋在樣品吸收墊和結(jié)合物釋 放墊上的檢測(cè)端，在樣品吸收墊和結(jié)合物釋放墊的交界處有隔離線并印有max字樣。
底板由PVC板材制成；樣品吸收墊由尼龍膜制成；結(jié)合物釋放墊由玻璃纖維制 成；吸水墊為慮油紙；反應(yīng)膜為純纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)的保護(hù)膜。
三、 帶有試紙盒的試紙(稱作試紙卡)(圖3)
所述試紙由樣品吸收墊1、結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3、吸水墊4和底板7組成；
所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次按順序黏貼在所述底板 上，結(jié)合物釋放墊從其始端起有1/3區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末端 與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底 板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；
所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的由保藏號(hào)為CGMCC No. 2716的對(duì)三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-4分泌的抗體，包被量為0. lug/cm2。
所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均為與所述試紙條的長(zhǎng)相垂直的條帶狀；檢測(cè)區(qū)位于近于結(jié)合物釋放墊末端的一側(cè)，距結(jié)合物釋放墊末端 6mm;質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊末端的一側(cè)，距所述檢測(cè)區(qū)5mm;檢測(cè)區(qū)包被有 三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶聯(lián)物)，質(zhì)控區(qū) 包被有羊抗鼠IgG;所述半抗原同一中所述相同。
所述試紙裝在試紙盒內(nèi)；所述試紙盒由底座9和蓋10構(gòu)成，底坐和蓋通過卡 齒12和卡孔13嵌合連接；
所述底座上有與所述蓋連接的卡齒12和與所述試紙相匹配的凹槽；
所述蓋上有加樣孔ll、觀察窗14和與底座相連的卡孔13 (與卡齒相配)；所 述加樣孔的位置與所述樣品吸收墊的位置相對(duì)應(yīng)，所述觀察窗與所述反應(yīng)膜上的檢 測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)相對(duì)應(yīng)。所述觀察窗上印有T和C， T表示檢測(cè)線，在靠近所述加樣 孔側(cè)，C表示質(zhì)控線，在遠(yuǎn)離所述加樣孔側(cè)。
切好后的試紙位于盒底座的凹槽內(nèi)，盒的蓋和底座通過卡齒和卡孔連接成封閉 系統(tǒng)。
底板由PVC板材制成；樣品吸收墊由尼龍膜制成；結(jié)合物釋放墊由玻璃纖維制 成；吸水墊為慮油紙；反應(yīng)膜為純纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)的保護(hù)膜。試
紙卡中的蓋由塑料制成，底座由塑料制成。
將上述試紙條或試紙卡均用鋁箔袋真空包裝，在18 25i:的環(huán)境中儲(chǔ)存，有效 期一年。
實(shí)施例2、實(shí)施例1中所述試紙的制備方法 一、試紙的制備
該試紙的制備方法主要包括如下步驟
1) 制備包被三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；
2) 制備含有包被三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)區(qū)和包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控 區(qū)的反應(yīng)膜；
3) 將樣品吸收墊、上述結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊和底板組裝成試紙。
4) 將組裝好的試紙兩端黏貼保護(hù)膜；用機(jī)器切成3mm寬的小條；或者將組裝 好的試紙用機(jī)器切成3rara寬的小條，裝在特制的塑料盒中。
下面分步詳細(xì)敘述 (一)各部件的制備
1、三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定三聚氰胺是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生 免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。
1) 半抗原的合成
a、 取0.5g (3.97咖o1)三聚氰胺于干燥的50ml圓底燒瓶中，加35ml DMF攪拌 溶解，取O. 44g(7. 93隱o1) K0H、 0. 12g無水Nal加至上述溶液中，滴加0.646ml溴乙 酸叔丁酯，充分混合后，加熱升溫65'C反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加水 稀釋，用乙酸乙酯萃取，干燥，旋蒸，得黃色油狀物，乙酸乙酯石油醚=2: l過 柱得產(chǎn)品I (如圖5所示)；
b、 取0. 32g中間產(chǎn)品I用5ml甲醇溶解，再加入5ml三氟乙酸，室溫?cái)嚢?0h。 反應(yīng)完成后旋蒸除去溶劑，得油狀物，用甲醇與乙酸乙酯l: l混合溶劑溶解，向 溶液中滴加石油醚，直至有白色渾濁出現(xiàn)，加熱使之變澄清，放置冷卻，析出白色 沉淀，真空抽濾，得半抗原產(chǎn)品(如圖6所示)。
2) 包被原的制備-三聚氰胺半抗原與人血清白蛋白偶聯(lián)物的合成
將步驟(1)制備的半抗原IO mg、 40 mg碳化二亞胺(DEC)和15 mg N—羥基 琥珀酰亞胺(NHS)充分溶解于l mL DMF中，在加熱條件下攪拌24 h，得到反應(yīng)液I 液；稱取BSA 20 mg，使之充分溶解在3.0 mL PBS (pH 8.2)中，得到反應(yīng)液II液 (半抗原與牛血清白蛋白的摩爾配比為26: 1);將I液緩慢加入到II液中，并于室溫 下攪拌5h，用O. 01 mol/L PBS緩沖液透析3 d，每天換2次透析液，以除去未反應(yīng)的 小分子物質(zhì)，以12000 rpm的速度離心30 min，收集上清，得到半抗原與牛血清白蛋 白的偶聯(lián)物，分裝，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 3) 免疫原的制備-三聚氰胺半抗原與甲狀腺蛋白的合成
將步驟(1)制備的三聚氰胺半抗原10mg、 40mg碳化二亞胺(DEC)和15mg N— 羥基琥珀酰亞胺(NHS)充分溶解于lmL DMF中，在加熱條件下攪拌24 h，得到反應(yīng) 液I液；稱取甲狀腺蛋白25mg，使之充分溶解在3. OmL PBS (pH8.2)中，得到反應(yīng) 液II液(半抗原與甲狀腺蛋白的摩爾配比為18: 1);將I液緩慢加入到II液中，并于 室溫下攪拌5h，用O. 01mol/L PBS緩沖液透析3d，每天換2次透析液，以除去未反應(yīng) 的小分子物質(zhì)，以12000 rpm的速度離心30min，收集上清,得到三聚氰胺半抗原與 甲狀腺蛋白的偶聯(lián)物，分裝，于-20。C保存?zhèn)溆谩?br> 4) 三聚氰胺-載體偶聯(lián)物的鑒定
將載體蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200-800 nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺-載體蛋白偶聯(lián)物的吸 收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明三聚氰胺與載體蛋白偶聯(lián)成功。
2、 三聚氰胺單克隆抗體的制備 (1)制備單抗
a. 動(dòng)物免疫
將步驟(1)得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150Pg/只，使 其產(chǎn)生抗血清。
b. 細(xì)胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9: 1 (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融 合，篩選得到穩(wěn)定分泌三聚氰胺單克隆抗體的對(duì)三聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞 株，將此細(xì)胞株命名為C-3-4，該細(xì)胞株已于2008年10月20日保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路， 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No.2716。
c. 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
將雜交瘤細(xì)胞C-3-4用凍存液制成1 X 1()9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保 存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37X:水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng) 瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
d. 單克隆抗體的制備與純化
增量培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞CGMCCNo.2716置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37。C條件下 進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20°C 保存。
所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血 清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中 的終濃度為0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
3、 羊抗鼠抗抗體的制備羊抗鼠IgG購(gòu)自創(chuàng)生生物產(chǎn)地Genestsbio貨號(hào) 6102030。
4、 三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備 (1)膠體金的制備
用雙蒸去離子水將1%氯金酸(購(gòu)于sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)T09041)稀釋成0.01% (質(zhì)量百分含量)，置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每100ml 0. 01%氯金酸 加入2ml 1%檸檬酸三鈉(購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠，產(chǎn)品目錄號(hào)BG11-AR-01KG)，繼 續(xù)煮沸，至液體呈紅色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀 純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期為一個(gè)月。
(2)三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
在磁力攪拌下，用0. lM碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按50-100[ig抗體/ml 膠體金的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述三聚氰胺單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min， 加入10。/。BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置30min。 12000rpm、 4'C離心30min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始 膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，得到的三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標(biāo) 記物溶液的濃度為50ug單抗/ml溶液，置4。C備用，保存60天。
復(fù)溶緩沖液含牛血清白蛋白(BSA)、吐溫-80和PVP-300吡咯烷酮的0. 02M、 pH9. 0的硼酸溶液，其中牛血清白蛋白(BSA)在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0. 02-0. 1 % (體積百分含量)，吐溫-80在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0.05-0.2% (質(zhì)量百分 含量)，PVP-300吡咯烷酮在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0.3X (質(zhì)量百分含量)。
5、 將三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被到結(jié)合物釋放墊 將結(jié)合物釋放墊浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度
為有1.0% (體積百分含量))和pH值為7.6 、 0.2mol/L硼砂-硼酸緩沖液中浸濕 30秒，37。C烘2h備用；用Biodot點(diǎn)膜儀將制備好的三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標(biāo) 記物均勻包被在結(jié)合物釋放墊上，每5cm2結(jié)合物釋放墊包被10pL三聚氰胺單克隆 抗體-膠體金標(biāo)記物(即每平方厘米結(jié)合物釋放墊包被0.1ug抗體)，真空干燥，真 空封裝，置4"C備用。
還可以每5cm2結(jié)合物釋放墊包被20)iL三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物， 即得到每平方厘米包被0.2ug抗體的結(jié)合物釋放墊。
6、 樣品吸收墊的準(zhǔn)備將樣品吸收墊置于含鼠血清蛋白(鼠血清蛋白在緩沖 液中的終濃度為0.4% (體積百分含量))、pH為9.9、 0. lmol/L碳酸鹽緩沖液浸泡2h， 37r烘2h備用；
7、 反應(yīng)膜的制備
包被過程用磷酸緩沖液將三聚氰胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL，用 Biodot點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)，包被量為0. 7嗎/cm2;用0. OIM、
13pH 7. 4 PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200pg/ml，用Biodot點(diǎn)膜儀將其包被 于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)，包被量為0. 7pg/cm2。
封閉將包被好的反應(yīng)膜至于37t:， 2小時(shí)后密封保存。
封閉液含人血清白蛋白(人血清白蛋白在封閉液中的終濃度為0.5% (質(zhì)量百 分含量))、蔗糖(蔗糖在封閉液中的終濃度為0.5% (質(zhì)量百分含量))、pH值 為7. 0、 0. 05mol/L Tris-緩沖液。 (二)各部件的組裝
1、 含有保護(hù)膜的試紙的組裝
將所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次按順序黏貼在所述底
板上；結(jié)合物釋放墊從其始端起有l(wèi)/2區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末
端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與
底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；在組裝好試紙兩端黏貼保護(hù)膜， 再用機(jī)器切成3mm寬的小條。
將試紙用鋁箔袋真空包裝，在18 25'C的環(huán)境中儲(chǔ)存，有效期一年。
2、 含有試紙盒的試紙的組裝
將所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次按順序黏貼在所述底 板上；結(jié)合物釋放墊從其始端起有1/3區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末 端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與 底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；將試紙用機(jī)器切成3mm寬的小 條，裝在試紙盒里。將試紙用鋁箔袋真空包裝，在18 25'C的環(huán)境中儲(chǔ)存，有效期 一年。
二、試劑盒的敏感性和特異性檢驗(yàn) (一)敏感性試驗(yàn)
將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(北京艾杰爾科技有限公司，CAS: 108-78-1)稀釋成如下 不同濃度0、 0.05、 0.1、 0.15、 0.3mg/L;所用的稀釋液的組成為含有在稀釋 液中的終濃度為8% (質(zhì)量百分含量)的DMS0、 pH為6.6、 0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖 液。
分別用試紙條和試紙卡進(jìn)行檢測(cè)。每次向樣品吸收墊滴加lml樣品，結(jié)果為 滴試0、 0.05mg/L濃度時(shí)，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性；當(dāng) 滴試O. lmg/L濃度時(shí)，試紙卡也出現(xiàn)肉眼可見的兩條紅色條線，但檢測(cè)區(qū)顏色很淡很模糊，呈陽性；當(dāng)?shù)卧嘜. 15、 0.3mg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)試紙卡檢測(cè)區(qū)不顯色，呈 陽性。表明，本試紙卡檢測(cè)三聚氰胺的靈敏度為0. lmg/L。 (二)特異性試驗(yàn)
特異性常用交叉反應(yīng)率表示，是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能 力。本試紙條對(duì)三聚氰胺檢測(cè)靈敏度為O. lmg/L，將三聚氰胺類似物(三聚氰酸、 三嗪、三嗪二胺)按O, 0.05， 0.1, 0.6， 2， 5， 10 mg/L進(jìn)行稀釋，用實(shí)施例l中 所述的兩種試紙分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表l所示，三聚氰酸、三嗪、三嗪二胺藥物 在5mg/L濃度時(shí)試紙卡檢測(cè)線均顯色，可以得出三聚氰胺對(duì)以上藥物的交叉反應(yīng)率 均小于1%。
表l、特異性試驗(yàn)結(jié)果
藥物 交叉反應(yīng)率(％)
三聚氰胺100
三聚氰酸小于l
三嗪小于l
三嗪二胺小于l
實(shí)施例3、試紙的應(yīng)用
一、用實(shí)施例1中所述試紙檢測(cè)三聚氰胺
本發(fā)明的試紙可以檢測(cè)牛奶樣品、奶粉樣品和飼料樣品。 一般的檢測(cè)方法如下
1、 樣品的處理
牛奶樣品取lml牛奶樣本用19ml的0.05M磷酸鹽緩沖液稀釋并混勻，取樣 進(jìn)行檢測(cè)；
奶粉樣品取lg奶粉溶于20ml的0. lM磷酸鹽緩沖液(pHi. 7)中，超聲10min， 離心，取樣進(jìn)行檢測(cè)；
飼料取3g勻質(zhì)后的飼料與30ml乙腈-0. 1M鹽酸(V:V=84: 16)混勻，超聲 提取1.5 min，取lml上清液，50。C水浴吹干，加入2ml正己烷混勻，再加入4ml 0. 02M 磷酸鹽緩沖液混勻，離心，取樣用于檢測(cè)。
2、 檢測(cè)方法及判斷向本試紙中的樣品吸收墊中滴加需檢測(cè)的樣品溶液后，在io分鐘內(nèi)觀看檢測(cè)結(jié)果。
三聚氰胺藥物在樣品中濃度高于試紙的樣本最低檢測(cè)限時(shí)，膠體金抗體與三聚 氰胺結(jié)合，從而在檢測(cè)區(qū)內(nèi)因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)反應(yīng)不會(huì)與三聚氰胺偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色 條帶，呈陽性。陰性樣品在檢測(cè)過程中由于缺少抗體抗原競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，將會(huì)在檢測(cè)區(qū) 與質(zhì)控區(qū)內(nèi)出現(xiàn)紅色條帶。如圖4所示。
陽性當(dāng)質(zhì)控區(qū)顯示出紅色條帶，而檢測(cè)區(qū)不顯色時(shí)，判為陽性。(圖4A) 陰性當(dāng)質(zhì)控區(qū)顯示出紅色條帶，檢測(cè)區(qū)同時(shí)也顯示出紅色條帶，判為陽性。 (圖4 B)
無效當(dāng)質(zhì)控區(qū)不顯示出紅色條帶，則無論測(cè)試區(qū)顯示出紅色條帶與否，該試
紙卡判為無效。(圖4 C) 下面具體舉例
取已知含有三聚氰胺濃度大于2mg/kg (mg/L)的牛奶、奶粉樣本和三聚氰胺濃 度大于4mg/kg的飼料陽性樣品各20份和三聚氰胺濃度小于2mg/kg(mg/L)的牛奶、 奶粉樣本和濃度小于4rag/kg的飼料陰性樣品20份，用3個(gè)批次生產(chǎn)的試紙分別進(jìn) 行檢測(cè)，(每批試紙條和試紙卡各10個(gè))計(jì)算其陰陽性率。結(jié)果如表2和表3所 示。
表2、檢測(cè)陽性樣本結(jié)果
陽性牛奶樣品陽性奶粉樣品陽性飼料樣品
(20份)(20份)(20份)
120份陽性20份陽性20份陽性
220份陽性20份陽性20份陽性
320份陽性20份陽性20份陽性
表3、檢測(cè)陰性樣本結(jié)果
陰性牛奶樣品陰性奶粉樣品陰性飼料樣品
批l- (20份)(20份)(20份)
119份陰性19份陰性20份陰性
220份陰性19份陰性18份陰性
319份陰性19份陰性19份陰性
結(jié)果表明用3個(gè)批次生產(chǎn)的試紙條和試紙卡檢測(cè)陽性牛奶、奶粉、伺料樣本
時(shí)，陽性符合率都為100%;檢測(cè)20份陰性牛奶樣本時(shí)結(jié)果出現(xiàn)了2份陽性，檢測(cè) 20份陰性奶粉樣本時(shí)結(jié)果出現(xiàn)了 3份陽性，檢測(cè)20份陰性飼料樣本時(shí)結(jié)果出現(xiàn)了3份陽性，其牛奶陰性符合率均為98%以上；奶粉、飼料陰性符合率均為96%以上。 說明本發(fā)明的檢測(cè)三聚氰胺試紙可以對(duì)三聚氰胺進(jìn)行快速檢測(cè)。
權(quán)利要求
1、一種檢測(cè)三聚氰胺的試紙，包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊，其依次連接；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；所述反應(yīng)膜上包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)區(qū)包被有半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體；所述半抗原如下
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙，其特征在于所述樣品吸收墊與所述結(jié)合物 釋放墊的連接方式為所述結(jié)合物釋放墊中有1/3-1/2區(qū)域被所述樣品吸收墊覆蓋。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙，其特征在于所述檢測(cè)區(qū)位于近于所述 結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離所述結(jié)合物釋放墊的末端的一 側(cè)；所述檢測(cè)區(qū)距所述結(jié)合物釋放墊的末端5-8mm，優(yōu)選為6ram;所述質(zhì)控區(qū)距所 述檢測(cè)區(qū)4-7mm，優(yōu)選為5mm。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l 、 2或3所述的試紙，其特征在于所述結(jié)合物釋放墊上 包被的三聚氰胺特異性抗體的包被密度為0. 1-0. 2ug/cm2，優(yōu)選為0. lug/cm2。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試紙，其特征在于所述三聚氰胺單克隆 抗體為由保藏號(hào)為CGMCC No. 2716的對(duì)三聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-4 分泌產(chǎn)生的抗體；所述抗抗體為羊抗鼠IgG。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試紙，其特征在于所述試紙中包括底板， 所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊固定在所述底板上。
7、 一種制備權(quán)利要求1-6中任一所述試紙的方法，是將樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次連接；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的三聚 氰胺特異性抗體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克 隆抗體；所述反應(yīng)膜上包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)區(qū)包被有權(quán)利要求1中所述半抗 原和載體蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體；所述樣品吸收墊在進(jìn)行所述連接前，先在如下溶液中浸泡卜3h，再進(jìn)行干燥含0.3-0.5% (體積百分含量)鼠血清蛋白、pH值為9. 6-10.0、 0. 1-0. 2mol/L的碳 酸鹽緩沖液；所述包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體的結(jié)合物釋放墊是按照如下方 法制備的將包被前的結(jié)合物釋放墊先在如下溶液中浸泡20-40秒，干燥，再進(jìn)行 所述膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體包被含有0.8-1.2% (體積百分含量)牛血 清白蛋白、pH值為7.2-7.8 、 0. l-0.2mol/L硼砂-硼酸緩沖液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述樣品吸收墊與所述結(jié)合物 釋放墊的連接方式為所述結(jié)合物釋放墊中有1/3-1/2區(qū)域被所述樣品吸收墊覆蓋；所述檢測(cè)區(qū)位于近于所述結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離所 述結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；所述檢測(cè)區(qū)距所述結(jié)合物釋放墊的末端5-8mm，優(yōu) 選為6mm;所述質(zhì)控區(qū)距所述檢測(cè)區(qū)4-7mra，優(yōu)選為5mm。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述三聚氰胺單克隆抗體 為由保藏號(hào)為CGMCC No. 2716的對(duì)三聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-4分泌 產(chǎn)生的抗體。
10、 一種檢測(cè)三聚氰胺的方法，是將待檢測(cè)樣品進(jìn)行前處理，然后用權(quán)利要求 l-6中任一所述試紙進(jìn)行檢測(cè)；所述前處理的方法如下當(dāng)所述樣品為牛奶時(shí)，樣品前處理的方法為將牛奶與0.05-0. 1M磷酸鹽緩沖 液以l: 15-25的體積比混勻，取樣用于檢測(cè);當(dāng)所述樣品為奶粉時(shí)，樣品前處理的方法為將每lg奶粉溶于18-25ml、 pH 為6. 0-6. 8、 O.O卜0.02M磷酸鹽緩沖液中，超聲10-20min，離心，取樣用于檢測(cè)；當(dāng)所述樣品為飼料時(shí)，樣品前處理的方法為將每lg飼料與9-15ml乙腈與鹽 酸的混合溶液混勻，超聲提取10-15 min，取lml上清液，干燥，加入0. 5-1. 5ml 正己垸混勻，再加入1.0-2.0ml 0.01-0.02M磷酸鹽緩沖液混勻，離心，取下層水 相用于檢測(cè)；所述乙腈與鹽酸的混合溶液中乙腈與0. 05-0. 1M鹽酸的體積比為4-6: 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)三聚氰胺的方法及其專用試紙。該試紙包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊，其依次連接；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的三聚氰胺特異性抗體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；所述反應(yīng)膜上包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)區(qū)包被有半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體。用本發(fā)明試紙檢測(cè)三聚氰胺的方法，簡(jiǎn)便、快速、直觀、準(zhǔn)確，適用范圍廣，成本低，易推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101477124SQ20081024031
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者萬宇平, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 汪善良, 趙正苗 申請(qǐng)人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司