專利名稱：一種天然抗氧化多肽混合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種天然抗氧化多肽混合物及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體處于不良環(huán)境狀態(tài)下，以及隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的自由基將會(huì)產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢。自由基清除劑也稱為抗氧化劑，可清除體內(nèi)多余的自由基，減輕它們對(duì)機(jī)體的損傷。
目前，一直公認(rèn)的自然界生物體中存在著2套抗氧化系統(tǒng)，第一套是蛋白質(zhì)大分子，比如SOD ;第二套為有機(jī)小分子，比如Vc、BHT等?；瘜W(xué)合成的抗氧化劑如BHA、BHT等， 本身具有毒、副作用，各國(guó)政府紛紛對(duì)其強(qiáng)制規(guī)定了 ADI值，控制其過(guò)量添加。化妝品中常見(jiàn)的抗氧化劑，如維生素C、維生素E及SOD等，其氧化活性又有限。而天然蝦青素之類的天然抗氧化劑的添加產(chǎn)品，由于其賣點(diǎn)為“天然”，售價(jià)普遍過(guò)高，難以為大眾所接受。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種天然抗氧化多肽混合物及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用，用中國(guó)特有臭蛙的皮膚中存在的抗氧化多肽替代傳統(tǒng)的抗氧化劑，開(kāi)發(fā)新一代天然， 極低毒、高效的抗氧化類化妝品。
隨著多肽組學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，本發(fā)明在青蛙皮膚中發(fā)現(xiàn)了第三套抗氧化系統(tǒng)，其由基因編碼的多肽構(gòu)成，這種多肽多由10-20個(gè)氨基酸殘基組成。這種抗氧化多肽是高原地區(qū)兩棲動(dòng)物的皮膚對(duì)抗紫外損傷有效而強(qiáng)大的武器，對(duì)其生存是至關(guān)重要的，且其來(lái)源天然，低毒、高效的特性，更符合現(xiàn)代人對(duì)化妝品的要求。
本發(fā)明所獲得的抗氧化多肽來(lái)源于中國(guó)特有的臭娃(Odorrana andersonii)的皮膚分泌物。蛙類，是動(dòng)物從水生生活到陸生生活的重要過(guò)渡類型，其皮膚裸露，富含腺體，能分泌大量的活性物質(zhì)，包括抗菌肽、激肽、鎮(zhèn)痛肽等，其中還有大量未知功能的多肽。臭蛙是蛙類動(dòng)物的“祖先”，因其皮膚在受刺激時(shí)能分泌具有刺激性氣味的混合物而得名。根據(jù)以往工作的經(jīng)驗(yàn)顯示，選取祖先種提取到的有效成分，其活性較強(qiáng)，本發(fā)明選用了蛙類的祖先云南臭蛙，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期的推測(cè)。
本發(fā)明的抗氧化活性的多肽按以下方法制備
①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mM Tris-HCl緩沖液(pH = 7. 8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于 4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲(chǔ)存于-80°C備用；
②將凍干的上清液樣品重新溶解，上預(yù)先用25mM Tris-HCl緩沖液(pH = 7. 8， 含有0. IM NaCl)平衡好的Sephadex G-75IOmin收集一次。洗脫產(chǎn)物用280nm監(jiān)測(cè)，繪制分離純化圖譜，收集得到天然抗氧化多肽混合物，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥。
抗氧化活性評(píng)估樣品抗氧化活性的評(píng)估反映在其對(duì)自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲(chǔ)存液在水溶液溶解2. 8mM過(guò)硫酸鉀和7mM ABTS,避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415nm波長(zhǎng)下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算(Ablank-Asample) X 100/Ablank。
經(jīng)上述方法制備得到天然抗氧化多肽混合物，其為基因編碼產(chǎn)物，是天然抗氧化肽Tiannanin-Cl、天然抗氧化肽Macrotympanain-Al、天然抗氧化肽Tiannanin-Bl、天然抗氧化肽Rotodorin-Dl的任意混合物,天然抗氧化肽Tiannanin-Cl的N端到C端的序列 RLFKCYKPDS ;天然抗氧化肽Macrotympanain-Al的N端到C端的序列FLPGLECVW ;天然抗氧化肽Tiannanin-Bl的N端到C端的序列VVKFPYRCKAAF ;天然抗氧化肽Rotodorin-Dl的N 端到C端的序列KSSDVKYYLAKCTTDVQ。其活性為0. 02ug/ml的濃度下即可清除30%的自由基，具有殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織創(chuàng)傷修復(fù)等活性。
產(chǎn)品主要技術(shù)指標(biāo)抗氧化肽的活性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)是能發(fā)揮作用的最小濃度(ug/ml 或 umol/ml) o
本發(fā)明的天然抗氧化多肽混合物應(yīng)用于化妝品的制備，將抗氧化多肽混合物直接投入到化妝品的配方中去，具有純天然、高效的特點(diǎn)，并具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織創(chuàng)傷修復(fù)等活性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下優(yōu)點(diǎn)
①采自中國(guó)特有臭蛙的皮膚，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護(hù)裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害一回歸本源、純天然，符合現(xiàn)如今大眾的消費(fèi)要求。
②活性比傳統(tǒng)的抗氧化劑BHT強(qiáng)1000倍。
③除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抑制黑色素形成活性。
本發(fā)明的應(yīng)用是化妝品行業(yè)的一次創(chuàng)舉，將成為化妝品行業(yè)的新一枝標(biāo)桿。
具體實(shí)施方式
①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mM Tris-HCl緩沖液(pH = 7. 8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于 4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲(chǔ)存于-80°C備用；
②將凍干的上清液樣品重新溶解，上預(yù)先用25mM Tris-HCl緩沖液(pH = 7. 8， 含有0. IM NaCl)平衡好的Sephadex G-75凝膠過(guò)濾柱，以0. 3ml/min的流速進(jìn)行洗脫,每 IOmin收集一次洗脫液；洗脫液用280nm監(jiān)測(cè)，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分， 并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥，最終獲取天然抗氧化多肽混合物。
天然抗氧化多肽混合物為基因編碼產(chǎn)物，活性0. 02ug/ml的濃度下即可清除 30%的自由基，具有殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織創(chuàng)傷修復(fù)等活性。
抗氧化活性評(píng)估樣品抗氧化活性的評(píng)估反映在其對(duì)自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲(chǔ)存液在水溶液溶解2. 8mM過(guò)硫酸鉀和7mM ABTS,避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415nm波長(zhǎng)下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算(Ablank-Asample) X 100/Ablank。
本發(fā)明的天然抗氧化肽混合物應(yīng)用于化妝品的制備，將抗氧化多肽直接投入到化妝品的配方中去，純天然、高效、具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織創(chuàng)傷修復(fù)等活性。
權(quán)利要求
1.一種天然抗氧化多肽混合物的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mMTris-HCl 緩沖液pH = 7. 8清洗臭娃的身體,收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于4000rpm離心 15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲(chǔ)存于-80°C備用；②將凍干的上清液樣品重新溶解，上預(yù)先用25mMTris-HCl緩沖液pH = 7.8，含有0. IM NaCl平衡好的Sephadex G-75凝膠過(guò)濾柱，以0. 3ml/min的流速進(jìn)行洗脫,每IOmin收集一次洗脫液；洗脫液用280nm監(jiān)測(cè)，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥后，最終獲取抗氧化多肽混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天然抗氧化多肽混合物的制備方法，其特征在于抗氧化活性評(píng)估具體如下首先配置ABTS儲(chǔ)存液在水溶液溶解2. 8mM過(guò)硫酸鉀和7mMABTS，避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415nm波長(zhǎng)下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算(Ablank-Asample) X 100/Ablank。
3.一種按權(quán)利要求I所述的天然抗氧化多肽混合物的制備方法得到的天然抗氧化多肽混合物，其特征在于天然抗氧化多肽混合物為基因編碼產(chǎn)物，是天然抗氧化肽 Tiannanin-Cl、天然抗氧化肽Macrotympanain-Al、天然抗氧化肽Tiannanin-Bl、天然抗氧化肽Rotodorin-Dl的任意混合物,天然抗氧化肽Tiannanin-Cl的N端到C端的序列 RLFKCYKPDS ;天然抗氧化肽Macrotympanain-Al的N端到C端的序列FLPGLECVW ;天然抗氧化肽Tiannanin-Bl的N端到C端的序列VVKFPYRCKAAF ;天然抗氧化肽Rotodorin-Dl的 N 端到 C 端的序列KSSDVKYYLAKCTTDVQ。
4.權(quán)利要求3所述的天然抗氧化多肽混合物的應(yīng)用，其特征在于將抗氧化活性的多肽混合物應(yīng)用于化妝品的制備中，將抗氧化多肽混合物直接投入到化妝品的配方中。
全文摘要
本發(fā)明是一種天然抗氧化多肽混合物及其制備方法和應(yīng)用。該天然抗氧化肽混合物，其采自中國(guó)特有臭蛙的皮膚制備而成，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護(hù)裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害，將抗氧化活性的多肽混合物用于化妝品的制備中?；貧w本源、純天然，符合現(xiàn)如今大眾的消費(fèi)要求。活性比傳統(tǒng)的抗氧化劑BHT強(qiáng)1000倍。除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抑制黑色素形成活性。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102525835SQ20121001520
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者梁醒財(cái) 申請(qǐng)人:梁醒財(cái)