本發(fā)明屬于材料領(lǐng)域，更具體地，涉及一種還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法及磁性免疫分析應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：超順磁性氧化鐵納米粒(spio)是粒徑在1～100nm之間的無(wú)機(jī)鐵磁物質(zhì)，因具有高的磁響應(yīng)性、超順磁性、較大的比表面積、易分離等獨(dú)特的特征，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如生物傳感器、細(xì)胞分選、組織工程、磁共振成像(mri)、光學(xué)多通道成像、靶向藥物運(yùn)輸、癌癥的高熱治療和免疫分析等。spio的合成方法主要有化學(xué)共沉淀法，熱分解法，乳液合成法，水熱合成法等，通過(guò)這些方式合成的裸的、未經(jīng)修飾的spio不能直接在磁性免疫分析中進(jìn)行應(yīng)用。spio應(yīng)用于磁性免疫分析的先決條件為長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性，即無(wú)團(tuán)聚或沉淀，未修飾的spio由于其巨大的表面能量和磁化強(qiáng)度使其變得非常容易聚集成團(tuán)簇，而失去其單分散性及獨(dú)有的性質(zhì)；熱分解法制備spio時(shí)，因反應(yīng)過(guò)程中需要使用帶有疏水長(zhǎng)烷基鏈的酸、醇和胺等表面配體，所得到的產(chǎn)物均表現(xiàn)出疏水性，且粒徑僅有10nm左右、磁分離困難，這些都限制了spio在磁性免疫分析中的應(yīng)用?？梢酝ㄟ^(guò)使用包被材料對(duì)spio進(jìn)行包裹制成磁性微球來(lái)解決這些問(wèn)題。核殼結(jié)構(gòu)的磁性微球可以對(duì)spio起保護(hù)作用，防止其被氧氣氧化、被酸堿腐蝕、團(tuán)聚；包被材料的包裹可實(shí)現(xiàn)油溶性spio的水溶性轉(zhuǎn)換；制成的磁性微球中因含有多個(gè)spio，具有較強(qiáng)的磁性，大大改善了spio磁分離的速度；此外，包被材料的包裹還使spio帶上一些活性功能基團(tuán)(如-nh2、-cooh)，便于偶聯(lián)抗體等生物活性物質(zhì)，可以更好地在磁性免疫分析中進(jìn)行應(yīng)用。生物大分子如蛋白質(zhì)(人血清白蛋白hsa、牛血清白蛋白bsa、抗體、酶等)，屬于天然高分子，具有很好的生物相容性，是很好的spio包裹材料。目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的制備蛋白質(zhì)包裹的spio方法有熱變性法，化學(xué)交聯(lián)法，超聲法和高壓均質(zhì)法。通過(guò)水浴、微波等熱變性的方式制備蛋白質(zhì)包裹磁性微球是通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)變性，暴露出疏水區(qū)域，以疏水相互作用、或者通過(guò)與蛋白質(zhì)分子中的巰基結(jié)合，在spio表面形成包裹層(foodhydrocolloids,2008,22:995-1005)。熱變性法是制備蛋白質(zhì)包裹磁性微球最簡(jiǎn)單的方法，但是該方法可控性差，在高溫條件下，蛋白質(zhì)聚集在spio的不同表面上，得到的產(chǎn)物粒徑不均勻，分散性差且易造成spio包裹不完全。此外，熱變性法會(huì)不可逆地改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其生物學(xué)特征的損失。化學(xué)交聯(lián)法是使用化學(xué)交聯(lián)劑，如戊二醛、甲醛等，使蛋白質(zhì)通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)在spio表面形成包裹層(colloidsandsurfacesa:physicochemicalandengineeringaspects,2013,436:1145-1151)。由于化學(xué)交聯(lián)是非特異性的，存在于蛋白質(zhì)質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的任何親核基團(tuán)(如胺和羥基)都有反應(yīng)活性，導(dǎo)致非特異性吸附偏高；所得蛋白質(zhì)包裹的磁性微粒的生物相容性差，殘留的交聯(lián)劑甲醛、戊二醛等醛類(lèi)物質(zhì)具有較大毒性。蛋白質(zhì)等是兩親性物質(zhì)，親水基團(tuán)暴露在分子表面，疏水基團(tuán)埋藏在分子內(nèi)部。超聲條件下，在油水混合體系中，會(huì)自發(fā)遷移到油水界面，自身的親疏水基會(huì)起到類(lèi)似表面活性劑的作用，降低兩相間的界面張力，從而起到穩(wěn)定乳化液的作用，能夠使熱分解油溶性spio在水溶液中分散開(kāi)來(lái)(acsapplmaterinterfaces,2012,4:6479-6486)。超聲法雖可實(shí)現(xiàn)對(duì)油溶性spio的蛋白質(zhì)包裹，但是其和蛋白質(zhì)的結(jié)合較弱，蛋白包裹層易在保存的過(guò)程中脫落、或者在鹽溶解中解離下來(lái)。高壓均質(zhì)法是使蛋白質(zhì)在高剪切力的作用下產(chǎn)生氣穴空化作用，從而引起了局部高熱，生成了超氧化物離子，超氧化物離子氧化蛋白質(zhì)自身帶有的巰基、斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，暴露出疏水區(qū)域后，從而通過(guò)疏水作用、或者通過(guò)和巰基配位，在spio周?chē)纬梢粋€(gè)殼體(201610416623.6)。此過(guò)程需將spio和蛋白質(zhì)一起泵入到高壓均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)，spio屬于鐵氧化物、剛性物質(zhì)，具有很強(qiáng)的硬度，用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)，對(duì)機(jī)器會(huì)有很?chē)?yán)重的磨損；且該方法需要使用高壓均質(zhì)機(jī)這種昂貴、復(fù)雜的儀器設(shè)備，不易操作。綜上，現(xiàn)有技術(shù)用熱變性法、化學(xué)交聯(lián)法、超聲法、高壓均質(zhì)法制備蛋白質(zhì)包裹磁性微球均有缺陷，需要探索新的制備方式來(lái)解決這些問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)制備蛋白質(zhì)包裹磁性微球所存在的產(chǎn)物粒徑不均勻、非特異吸附性高、穩(wěn)定性差、制備過(guò)程復(fù)雜等缺陷，提供一種具有制備工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、穩(wěn)定性好、生物相容性高、非特異吸附性低等優(yōu)點(diǎn)的水溶性磁性微球的制備方法及其用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，包括以下步驟：(1)將油溶性納米顆粒溶解于有機(jī)相中，再加入水相，預(yù)混，加入蛋白質(zhì)混合后得到粗乳液；(2)向步驟(1)中得到的粗乳液中加入巰基還原劑，通過(guò)還原反應(yīng)，打開(kāi)蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，使蛋白質(zhì)暴露出巰基和疏水區(qū)域，蛋白質(zhì)通過(guò)巰基配位和疏水作用與磁性納米顆粒自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)包裹磁性微球反應(yīng)液；(3)向步驟(2)中所得到的反應(yīng)液中加入0～4℃的緩沖液終止還原反應(yīng)，用磁鐵將蛋白質(zhì)包裹的磁性微球吸附在試管底部，倒去上清，加入緩沖液進(jìn)行渦旋清洗后，倒去上清，得到純化的蛋白質(zhì)包裹磁性微球。優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述粗乳液還經(jīng)過(guò)以下處理：先采用磁分離方法對(duì)所述粗乳液進(jìn)行處理，使得所述粗乳液分層，然后除去該粗乳液分層后得到的上清液，從而得到表面吸附有蛋白質(zhì)的磁性微球的下層，接著，向該下層中加入的水相和抗體，攪拌混勻即得到處理后的粗乳液。所述所加水相是trisbuffer溶液，且與步驟(1)中溶解油性納米顆粒的水相是等體積的；所述抗體是鼠igg或甲胎蛋白afp單克隆抗體。優(yōu)選地，所述步驟(1)中的油溶性納米顆粒是油溶性的超順磁性納米顆粒；優(yōu)選地為四氧化三鐵納米顆粒、三氧化二鐵納米顆?；蚴嵌叩幕旌霞{米顆粒。優(yōu)選地，所述步驟(1)中蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血紅蛋白、酪蛋白、膠原蛋白、腹水或乳汁；所述步驟(1)中有機(jī)相是乙醇與正己烷、氯仿和環(huán)己烷中三種有機(jī)物中至少一種的混合物；加入的水相是trisbuffer溶液；所述步驟(2)中的還原劑是巰基乙醇、二硫蘇糖醇或3-巰基-1,2-丙二醇。優(yōu)選地，所述步驟(1)中的預(yù)混方式包括超聲、高剪切或機(jī)械攪拌中的一種或多種的混合方式。優(yōu)選地，步驟(1)中所述油溶性納米顆粒和蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:2～10，所述油溶性納米顆粒和抗體的質(zhì)量比為1:0.01～0.07。優(yōu)選地，所述步驟(2)還原反應(yīng)的溫度為4～45℃，反應(yīng)時(shí)間為5～50min，還原劑濃度為0.4～1.838mol/l。按照本發(fā)明了另一個(gè)方面，提供了一種還原自組裝蛋白質(zhì)包裹的磁性微球，按照以上所述的制備方法制得。優(yōu)選地，所述步驟(3)中加入的終止還原反應(yīng)緩沖液是trisbuffer溶液，且與蛋白質(zhì)包裹的磁性微球反應(yīng)液是等體積的；加入的用于渦旋清洗的緩沖液是trisbuffer溶液。按照本發(fā)明了另一個(gè)方面，提供了蛋白質(zhì)包裹磁性微球的應(yīng)用，應(yīng)用于磁性免疫層析檢測(cè)?？傮w而言，通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的有益效果：(1)本發(fā)明還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，采用還原劑打開(kāi)蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，使蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域和巰基暴露出來(lái)，spio通過(guò)配位鍵以及疏水作用與蛋白質(zhì)緊密的結(jié)合在一起，形成包裹緊密、不易脫落、解離的蛋白質(zhì)外殼，因而磁性微球具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)還原反應(yīng)的時(shí)間、還原劑加入量以及溫度等的有效控制，可得到不同粒徑大小的磁性微球，因而該方法制備磁性微球粒徑易調(diào)控。(2)還原自組裝制備的蛋白質(zhì)包裹磁性微球，所得的磁性微球水溶性好、不易聚集，非特異吸附低且具有優(yōu)異的生物相容性，帶有多種功能性基團(tuán)，為其偶聯(lián)標(biāo)記抗體等生物活性分子提供位點(diǎn)，便于其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。(3)本發(fā)明還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，避免了高壓均質(zhì)法制備需使用昂貴、復(fù)雜儀器的不足；避免了化學(xué)交聯(lián)法制備時(shí)交聯(lián)劑造成的醛類(lèi)物質(zhì)殘留、毒性大等問(wèn)題。(4)本發(fā)明還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，條件溫和，可在制備過(guò)程中直接固定特異性抗體，一步即可得到免疫磁性微球，磁性免疫層析實(shí)驗(yàn)證明該磁性微球具有活性，可用于磁性免疫層析、有望在環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全檢驗(yàn)、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。(5)本發(fā)明還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)特殊設(shè)備、耗時(shí)短、易操作、生產(chǎn)成本低廉。綜上所述，本發(fā)明所提供的還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，制備的磁性微球穩(wěn)定性、均一性較好，生物相容性高，非特異吸附性低，帶有多種功能性基團(tuán)；制備的偶聯(lián)抗體的蛋白質(zhì)包裹磁性微球活性高，可廣泛用于生物分析、環(huán)境分析、食品安全檢測(cè)、樣品分離純化、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與成像以及生物醫(yī)藥研究等領(lǐng)域。附圖說(shuō)明圖1是蛋白質(zhì)包裹磁性微球的透射電鏡(tem)圖片；圖2是超順磁性氧化鐵、牛血清白蛋白和牛血清白蛋白包裹磁性微球的熱重曲線(xiàn)；圖3是制備的偶聯(lián)igg的蛋白質(zhì)包裹磁性微球磁性免疫層析試驗(yàn)結(jié)果；圖4是雙抗夾心磁性免疫層析檢測(cè)afp抗原磁性免疫層析試驗(yàn)結(jié)果；圖5是雙抗夾心磁性免疫層析檢測(cè)afp抗原四參數(shù)擬合曲線(xiàn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，該方法按如下步驟進(jìn)行：(1)物理混合：將油溶性納米顆粒溶解于有機(jī)相中，再加入水相，通過(guò)物理混勻手段進(jìn)行預(yù)混，加入蛋白質(zhì)混合后得到粗乳液；采用磁分離方法除去粗乳液中的上清液后得到表面吸附有蛋白質(zhì)的磁性微球，再次加入水相，并加入抗體，機(jī)械攪拌混勻后得到粗乳液。其中，油溶性納米顆粒包括油溶性的超順磁性納米顆粒，優(yōu)選為四氧化三鐵納米顆粒、三氧化二鐵納米顆?；蚴嵌叩幕旌霞{米顆粒；有機(jī)相是正己烷、氯仿、環(huán)己烷中的一種或是它們?nèi)我獾幕旌弦号c乙醇的混合液；預(yù)混方式包括超聲、高剪切或機(jī)械攪拌中的一種或多種的混合方式；蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血紅蛋白、酪蛋白、膠原蛋白、腹水或乳汁；抗體是鼠igg或甲胎蛋白afp單克隆抗體；油溶性納米顆粒和蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1：2～10；油溶性納米顆粒和抗體的質(zhì)量比為1:0.01～0.07。(2)還原自組裝包裹：在步驟(1)所獲得的粗乳液中加入巰基還原劑，通過(guò)還原反應(yīng)，打開(kāi)蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，使蛋白質(zhì)暴露出巰基和疏水區(qū)域，蛋白質(zhì)通過(guò)巰基配位和疏水作用與磁性納米顆粒自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)包裹磁性微球反應(yīng)液。其中，還原劑可以是巰基乙醇、二硫蘇糖醇、3-巰基-1,2-丙二醇。還原反應(yīng)的溫度為4～45℃，反應(yīng)時(shí)間為5～50min，還原劑濃度為0.4～1.838mol/l。(3)分離純化：向步驟(2)中所得到的反應(yīng)液中加入trisbuffer溶液終止還原反應(yīng)，用磁鐵將蛋白質(zhì)包裹的磁性微球吸在ep管底部，倒去上清，加入trisbuffer渦旋、這樣清洗兩次，得到純化的蛋白質(zhì)包裹磁性微球。其中，加入的的trisbuffer與蛋白質(zhì)包裹的磁性微球反應(yīng)液是等體積的，trisbuffer的溫度為0～4℃。為了更好的理解本發(fā)明，下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1一種還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，包括以下步驟：(1)物理混合：取一定體積的超順磁性氧化鐵納米粒(spio)，確保spio的質(zhì)量為5mg。加入3ml乙醇后渦旋30s，磁鐵收集spio，去上清，加入100μl正己烷重新將spio溶解，再加入100μl乙醇，1mlph7.27trisbuffer。于超聲清洗器中超聲3min將spio轉(zhuǎn)至25ml玻璃瓶中繼續(xù)超聲1min，然后邊超聲邊加入4mlph7.27trisbuffer，再超聲2min，將50mg的牛血清白蛋白(bsa)加入spio中，血漿混勻器上混勻12h得到粗乳液。(2)還原自組裝包裹：將粗乳液轉(zhuǎn)至25ml圓底燒瓶中，37℃水浴、300rpm機(jī)械攪拌下加入1.38mol/l3-巰基-1，2-丙二醇，反應(yīng)5min。(3)分離純化：以反應(yīng)液和4℃trisbuffer1:1的比例終止反應(yīng)。用磁鐵將蛋白質(zhì)包裹的磁性微球吸在ep管底部，倒去上清，加入trisbuffer渦旋、這樣清洗兩次，最后用2.5mltrisbuffer保存bsa包裹的磁性微球，其最終濃度為2mg/ml。按照上述制備方法制備得到的bsa包裹的磁性微球，取25μl，用1ml超純水稀釋?zhuān)瑴u旋混勻后用激光粒度電位分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司，zetasizernano-zs90)測(cè)得其水合粒徑為222.6nm，單分散指數(shù)(pdi，pdi越小說(shuō)明溶液的均一性越好)為0.108。將磁性微球稀釋至0.5mg/ml，取15μl滴在封口膜上，將銅網(wǎng)正面蓋在水滴上，等待10min，將銅網(wǎng)轉(zhuǎn)至濾紙上，以吸去銅網(wǎng)上的水，室溫自然晾干，tem觀(guān)察磁性微球的圖像，如圖1所示呈球形。將磁性微球收集在1.5ml的ep管中，放進(jìn)-20℃冰箱中冷凍24h，取出ep管放進(jìn)冷凍干燥器中冷凍干燥24h，得到冷凍粉末，用熱重分析儀分析粉末質(zhì)量隨溫度的變化情況，得到tg曲線(xiàn)，如圖2所示，磁含量約為61.53％。將磁性微球在ph8.0的trisbuffer、磁球清洗液(mbw)、0.1％bsa的溶液4℃保存8天，其粒徑保持穩(wěn)定，如表1所示，說(shuō)明蛋白質(zhì)和spio結(jié)合緊密，磁性微球比較穩(wěn)定。表1實(shí)驗(yàn)條件mbwph8.0trisbuffer0.1％bsacontrol221.1nm229.4nm225.7nm4℃放置2天221.3nm220.7nm221.2nm4℃放置8天229.2nm228.7nm227.1nm通過(guò)調(diào)整還原劑3-巰基-1，2-丙二醇的加入量、超順磁性氧化鐵納米粒(spio)與bsa的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行bsa包裹spio的制備，可以得到不同水合粒徑和pdi值的產(chǎn)物。如表2所示，在相同還原劑3-巰基-1，2-丙二醇用量條件下，隨著還原反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可以收集到粒徑逐漸增大的磁性微球；磁性微球的粒徑和還原劑用量、溫度成呈正相關(guān)。表2實(shí)施例2一種還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，包括以下步驟：(1)物理混合：取一定體積的超順磁性氧化鐵納米粒(spio)，確保spio的質(zhì)量為5mg。加入3ml乙醇后渦旋30s，磁鐵收集spio，去上清，加入100μl氯仿重新將spio溶解，再加入100μl乙醇，1mlph7.27trisbuffer。于超聲清洗器中超聲3min將spio轉(zhuǎn)至25ml玻璃瓶中繼續(xù)超聲1min，然后邊超聲邊加入4mlph7.27trisbuffer，再超聲2min，將50mg的bsa加入spio中，血漿混勻器上混勻12h得到粗乳液。(2)還原自組裝包裹：將粗乳液轉(zhuǎn)至25ml圓底燒瓶中，37℃水浴、300rpm機(jī)械攪拌下加入1.838mol/l巰基乙醇，反應(yīng)6min。(3)分離純化：以反應(yīng)液和0℃trisbuffer1:1的比例終止反應(yīng)。用磁鐵將蛋白質(zhì)包裹的磁性微球吸在ep管底部，倒去上清，加入trisbuffer渦旋、這樣清洗兩次，最后用2.5mltrisbuffer保存bsa包裹的磁性微球，其最終濃度為2mg/ml。如表3所示，收集到的bsa包裹磁性微球的水合粒徑為229.5nm，pdi為0.123，在反應(yīng)12min收集磁性微球水合粒徑為260.1nm。將水浴溫度降為4℃進(jìn)行制備，還原反應(yīng)速度減慢，在6min和12min收集的磁性微球水合粒徑均比在37℃制備時(shí)收集的小。將還原劑更換為二硫蘇糖醇(dtt)，其加入濃度為0.4mol/l時(shí)，在反應(yīng)10min、20min可以收集到水合粒徑為209nm、220.4nm比較均一的磁性微球，因而dtt也可用于bsa包裹磁性微球的制備。表3實(shí)施例3一種還原自組裝蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，包括以下步驟：(1)物理混合：取一定體積的超順磁性氧化鐵納米粒(spio)，確保spio的質(zhì)量為5mg。加入3ml乙醇后渦旋30s，磁鐵收集spio，去上清，加入100μl正己烷重新將spio溶解，再加入100μl乙醇，1mlph7.27trisbuffer。于超聲清洗器中超聲3min將spio轉(zhuǎn)至25ml玻璃瓶中繼續(xù)超聲1min，然后邊超聲邊加入4mlph7.27trisbuffer，再超聲2min，將50mg的人血清白蛋白(has)加入spio中，血漿混勻器上混勻12h得到粗乳液。(2)還原自組裝包裹：將粗乳液轉(zhuǎn)至25ml圓底燒瓶中，37℃水浴、300rpm機(jī)械攪拌下加入1.38mol/l3-巰基-1，2-丙二醇，反應(yīng)6min。(3)分離純化：以反應(yīng)液和4℃trisbuffer1:1的比例終止反應(yīng)。用磁鐵將蛋白質(zhì)包裹的磁性微球吸在ep管底部，倒去上清，加入trisbuffer渦旋、這樣清洗兩次，最后用2.5mltrisbuffer保存hsa包裹的磁性微球，其最終濃度為2mg/ml。如表4所示，收集到的hsa包裹磁性微球的水合粒徑為228.5nm，pdi為0.113；按照該步驟將hsa換成血紅蛋白、酪蛋白、膠原蛋白、腹水、乳汁，都可以收集到水合粒徑在230nm左右的蛋白質(zhì)包裹磁性微球。表4蛋白質(zhì)水合粒徑(nm)pdi人血清白蛋白228.50.113血紅蛋白230.10.237酪蛋白226.60.156膠原蛋白231.40.212腹水225.90.189乳汁237.10.168實(shí)施例4還原自組裝偶聯(lián)igg的蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法，包括以下步驟：(1)物理混合：取一定體積的spio，確保spio的質(zhì)量為5mg。加入3ml乙醇后渦旋30s，磁鐵收集spio，去上清，加入100μl氯仿重新將spio溶解，再加入100μl乙醇，1mlph7.27trisbuffer。于超聲清洗器中超聲3min將spio轉(zhuǎn)至25ml玻璃瓶中繼續(xù)超聲1min，然后邊超聲邊加入4mlph7.27trisbuffer，再超聲2min，將50mg的bsa加入spio中，血漿混勻器上過(guò)夜混勻得到粗乳液。磁分離，用等體積(5ml)的ph7.27trisbuffer重懸后，以spio和igg的質(zhì)量比為1:0.07的比例加入igg，300rpm機(jī)械攪拌混合50min后得到粗乳液。(2)還原自組裝包裹：將粗乳液轉(zhuǎn)至25ml圓底燒瓶中，37℃水浴、300rpm機(jī)械攪拌50min，加入1.38mol/l3-巰基-1，2-丙二醇，反應(yīng)50min。(3)分離純化：以反應(yīng)液和4℃trisbuffer1:1的比例終止反應(yīng)。用磁鐵將蛋白質(zhì)包裹的磁性微球吸在ep管底部，倒去上清，加入trisbuffer渦旋、這樣清洗兩次，最后用2.5mltrisbuffer保存偶聯(lián)igg的bsa包裹的磁性微球，最終濃度為2mg/ml。以下為抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)磁性微球活性試驗(yàn)：用1％pbst溶解bsa，制備1％的bsa溶液作為展層液，分別取2μl、4μl、6μl，8μl、10μl上述制備的偶聯(lián)igg的bsa包裹磁性微球，均加入100μl的展層液，渦旋混勻后用包被有羊抗鼠二抗(gam，作為質(zhì)控線(xiàn)、即c線(xiàn))的試紙條進(jìn)行磁性免疫層析試驗(yàn)。如圖3所示，分為a、b、c三組試驗(yàn)，三組試驗(yàn)中2、4、6、8、10代表磁性免疫層析時(shí)所加偶聯(lián)igg的bsa包裹磁性微球的體積(μl)，圖3中a組是進(jìn)行磁性免疫層析后的試紙條，試紙條出現(xiàn)灰色條帶(t線(xiàn))，且顏色隨著所加磁性微球體積量的增加逐漸加深，說(shuō)明磁性微球具有活性。將spio和igg的質(zhì)量比調(diào)整為為1:0.05，1:0.03分別進(jìn)行制備，相同的方式進(jìn)行磁性免疫層析試驗(yàn)，如圖3中b、c組所示，因?yàn)樗涌贵w量減少，試紙條顯色顏色變淺。實(shí)施例5一種還原自組裝偶聯(lián)afp單克隆抗體的蛋白質(zhì)包裹磁性微球的制備方法：(1)物理混合：取一定體積的spio，確保spio的質(zhì)量為5mg。加入3ml乙醇后渦旋30s，磁鐵收集spio，去上清，加入100μl氯仿重新將spio溶解，再加入100μl乙醇，1mlph7.27trisbuffer。于超聲清洗器中超聲3min將spio轉(zhuǎn)至25ml玻璃瓶中繼續(xù)超聲1min，然后邊超聲邊加入4mlph7.27trisbuffer，再超聲2min，將50mg的bsa加入spio中，血漿混勻器上過(guò)夜混勻得到粗乳液。磁分離，用等體積(5ml)的ph7.27trisbuffer重懸后，以spio和afp標(biāo)記抗體(mab1)的質(zhì)量比為1:0.01的比例加入mab1，300rpm機(jī)械攪拌混合50min后得到粗乳液。(2)還原自組裝包裹：將粗乳液轉(zhuǎn)至25ml圓底燒瓶中，37℃水浴、300rpm機(jī)械攪拌50min，加入1.38mol/l3-巰基-1，2-丙二醇，反應(yīng)50min。(3)分離純化：以反應(yīng)液和4℃trisbuffer1:1的比例終止反應(yīng)。用磁鐵將蛋白質(zhì)包裹的磁性微球吸在ep管底部，倒去上清，加入trisbuffer渦旋、這樣清洗兩次，最后用2.5mltrisbuffer保存偶聯(lián)afp單克隆抗體的bsa包裹的磁性微球，最終濃度為2mg/ml。以下是雙抗夾心磁性免疫層析檢測(cè)afp抗原：將afp包被抗體(mab2)和gam包被在試紙條上，作為試紙條上的檢測(cè)線(xiàn)(t線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(c線(xiàn))，即得到組裝好的試紙條。用1％pbst溶解bsa，制備1％的bsa溶液作為展層液，檢測(cè)時(shí)用展層液將afp抗原稀釋成256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5iu/ml十個(gè)濃度梯度，取100μl，加入1.5μl上述制備的偶聯(lián)afp單克隆抗體的bsa包裹的磁性微球，渦旋后室溫于血漿混勻器上混勻1h。將ep管中的液體取出置于96孔板中，用組裝好的試紙條過(guò)夜進(jìn)行磁層析試驗(yàn)。如圖4所示，256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5代表afp抗原的濃度，單位為iu/ml，隨afp抗原濃度的減小，磁性免疫層析后試紙條t線(xiàn)處顏色逐漸變淺，掃描，用光學(xué)比色法測(cè)試紙條t線(xiàn)處的灰度值，通過(guò)四參數(shù)擬合得到灰度值和afp抗原濃度的擬合曲線(xiàn)，如圖5所示，ic50為7.53iu/ml(6.25ng/ml)，其靈敏度低于商品化afp膠體金免疫層析試劑盒的檢測(cè)限(10ng/ml)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12