鹽酸克倫特羅的快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子印跡技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鹽酸克倫特羅的快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘦肉精是具有腎上腺素受體激動作用的一類藥物的統(tǒng)稱，又稱β 2-興奮劑，具有 促進肌肉生長、提高瘦肉率的作用，曾作為生長添加劑被廣泛關(guān)注，但β 2-受體激動劑在 動物體內(nèi)有一定的殘留時間，通過食物鏈進入人體后會使一些易感人群產(chǎn)生明顯的中毒癥 狀，危害人類健康。鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLB)是瘦肉精中的一種，它能夠明顯促 進動物生長，并增加瘦肉率，因而被一些不法分子使用在動物生產(chǎn)中用來增加瘦肉率。研宄 表明，殘留在動物體內(nèi)的鹽酸克倫特羅被人使用后會毒害腎臟、肝臟等器官，會出現(xiàn)頭痛不 適、惡心嘔吐、肌肉顫抖、心率加快、頭暈?zāi)垦５劝Y狀，甚至會導致死亡，因此，我國嚴禁在動 物生產(chǎn)中使用鹽酸克倫特羅。現(xiàn)有檢測鹽酸克倫特羅的方法均需要復雜的樣品處理過程和 分析步驟，需要大型儀器及經(jīng)過專門訓練的專業(yè)人員操作，時間長、成本高，遠不能滿足在 線檢測的要求。
[0003] 試紙法由于具有攜帶方便、操作簡單、測定速度快等特點，在食品、水質(zhì)、醫(yī)療衛(wèi)生 等領(lǐng)域有較多應(yīng)用。如2001年河南省農(nóng)科院動物免疫學重點實驗室與河南百奧生物工程 有限公司于成功研發(fā)了"瘦肉精"專用快速檢測試紙技術(shù)并投放市場，使用該試紙可在60 秒內(nèi)快速直觀地檢測出肉品中是否含有超過安全標準的"瘦肉精"，該試紙檢測技術(shù)以單克 隆抗體為基礎(chǔ)設(shè)計而成，檢測時膠體金標記的"瘦肉精"單抗被檢測線上固定化的"瘦肉精" 人工結(jié)合抗原捕獲，形成一條棕紅色的檢測線，過量的膠體金標記單抗繼續(xù)涌動被對照線 上固定化的羊抗鼠抗體捕獲形成一條棕紅色的對照線，如果樣品中含有"瘦肉精"，它將與 固定化在檢測線上的人工抗原競爭有限的膠體金標記單抗。申請?zhí)枮?00810219632. 1的 中國專利，公開了一種鹽酸克倫特羅檢測試紙及其檢測方法，該紙包括支撐固定粘襯層，在 支撐固定粘襯層上依次有樣品吸附層、結(jié)合墊、微孔虹吸反應(yīng)層和吸水材料層，在結(jié)合墊上 有示蹤粒子標記的鹽酸克倫特羅抗體和示蹤粒子標記的抗體A，當樣品中含有5納克以上 的鹽酸克倫特羅時，檢測區(qū)出現(xiàn)兩條線，當樣品中鹽酸克倫特羅含量小于5納克時，檢測區(qū) 出現(xiàn)一條線，該試紙具有與夾心法等同的檢測模式及判讀方式且成本低，該檢測方法簡便 快捷，操作簡單。但上述方法在使用中存在以下問題：超過判讀時間容易出現(xiàn)假陰性、假陽 性結(jié)果，質(zhì)控線有時不顯現(xiàn)，檢測線顏色模糊不清，漏檢率偏高等，因此，尋找一種快捷、方 便、高選擇、高靈敏的檢測鹽酸克倫特羅的試紙方法具有重要意義。
[0004] 分子印跡是近年來興起的分子特異性識別技術(shù)，具有對模板分子在功能基團、分 子尺寸、空間結(jié)構(gòu)具有記憶功能的結(jié)合位點，可以根據(jù)預定的選擇性和高度識別性能進行 分子識別，在印跡中形成的特異性識別位點能和被分析物選擇性作用，并且這種作用是可 逆的，這種合成的材料機械強度和化學穩(wěn)定性好，能在極端環(huán)境中使用?，F(xiàn)已有將分子印跡 技術(shù)結(jié)合試紙法制備得到的分子印跡試紙條，不僅具備了分子印跡特異識別能力，且具有 試紙條檢測速度快、攜帶方便的特點，但是目前尚未采用分子印跡試紙條檢測鹽酸克倫特 羅的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有的經(jīng)典鹽酸克倫特羅的檢測方法前處理復雜、時間長、成本高，現(xiàn) 有的試紙法易出現(xiàn)假陰性假陽性結(jié)果、漏檢率高等現(xiàn)狀，提供了一種鹽酸克倫特羅的快速 檢測方法，該方法簡單、快速、成本低。本發(fā)明可用于待測樣品中鹽酸克倫特羅的在線痕量 檢測。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] 一種鹽酸克倫特羅的快速檢測方法，該方法包括以下步驟：
[0008] 1.取鹽酸克倫特羅分子印跡試紙條，在其反應(yīng)區(qū)內(nèi)滴加30 μ L活性為200-400ug/ mL的葡萄糖氧化酶標記鹽酸克倫特羅溶液，孵化反應(yīng)5-10分鐘，40°C烘干后，用70 μ L水淋 洗反應(yīng)區(qū)；
[0009] 2.在淋洗過的反應(yīng)區(qū)內(nèi)滴加25 μ L待測樣品溶液，競爭反應(yīng)8-12分鐘，用70 μ L 水淋洗反應(yīng)區(qū)；
[0010] 3.在淋洗過的反應(yīng)區(qū)內(nèi)滴加20 μ L 0. lg/mL葡萄糖溶液，再滴加20 μ L 8 X 10_5mol/L署紅Y溶液，酶催化反應(yīng)3-7分鐘，將試紙條在40°C烘干；
[0011] 4.取熒光比色皿，將步驟3得到的干燥試紙條貼在比色皿透光一側(cè)，將比色皿置 于熒光分光光度計中，設(shè)定以下檢測條件：激發(fā)波長為500nm，狹縫寬度EX = 3. Onm，EM = 3. Onm，對試紙條熒光強度進行檢測，即得。
[0012] 以上所述鹽酸克倫特羅的快速檢測方法，所述待測樣品溶液的制備方法為：稱取 待測樣品，加入20mL lmol/L鹽酸溶解，再加入180mL水，避光震蕩20-30分鐘，以3000r/ min的速率離心20-30分鐘，取上清液，用lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為7. 5-8. 5,即 得。
[0013] 以上所述鹽酸克倫特羅的快速檢測方法，所述分子印跡試紙條，包括基底和反應(yīng) 區(qū)，所述反應(yīng)區(qū)為覆蓋基底鏤空區(qū)域的對鹽酸克倫特羅具有選擇性識別能力的硝酸纖維素 膜；
[0014] 所述對鹽酸克倫特羅具有選擇性識別能力的硝酸纖維素膜的制備方法為：將硝酸 纖維素膜放入鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物溶液中浸泡30分鐘，取出后置40°C烘箱內(nèi)烘 干，用15-40 %乙醇洗滌硝酸纖維素膜，再用水洗滌硝酸纖維素膜，晾干，即得；
[0015] 所述鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物溶液是以鹽酸克倫特羅為模板分子，以α -甲 基丙烯酸為功能單體，以氫鍵形式進行相互作用，加入交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、弓丨 發(fā)劑過硫酸銨發(fā)生自由基共聚，得到鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物溶液；所述模板分子、功 能單體、交聯(lián)劑的摩爾比為117-274:1-300:30-90。
[0016] 以上所述分子印跡試紙條，所述反應(yīng)區(qū)可位于基底的任一位置，為方便操作，優(yōu)選 位于基底的一端。
[0017] 以上所述分子印跡試紙條，所述基底的材料可為不影響試驗的任何材料，優(yōu)選為 塑料或相片紙。
[0018] 一種以上所述的分子印跡試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0019] 1.鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物溶液的制備：
[0020] a.配制濃度為3 X 10_3-3 X 10_5mol/L的鹽酸克倫特羅水溶液；
[0021] 匕將3-7 4 1^-甲基丙烯酸加入到10-3011^濃度為3\10_3-3\10_5111〇1/1鹽酸克 倫特羅水溶液中，超聲處理5-15分鐘，再加入0. 0014-0. 0042g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，繼 續(xù)超聲處理10-30分鐘，靜置過夜，得混合液；
[0022] c.將80-120 μ L濃度為0. 5mol/L的過硫酸銨溶液，緩慢加入到步驟b得到的混合 液中，超聲處理10-20分鐘，即得到鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物。
[0023] 2.對鹽酸克倫特羅具有選擇性識別能力的硝酸纖維素膜的制備：將硝酸纖維素 膜放入鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物溶液中浸泡30分鐘，取出后置40°C烘箱內(nèi)烘干，用 15-40%乙醇洗滌硝酸纖維素膜，再用水洗滌硝酸纖維素膜，晾干，剪裁好；
[0024] 3.剪裁基底，在基底內(nèi)剪裁出一鏤空區(qū)域，在鏤空區(qū)域的基底周圍涂上膠水或粘 上雙面膠，將上述步驟2中剪裁好的對鹽酸克倫特羅具有選擇性識別能力的硝酸纖維素膜 粘在基底上，再蓋壓一個具有相同鏤空區(qū)域的基底，即得。
[0025] 以上所述分子印跡試紙條的制備方法，所述步驟3中基底的大小優(yōu)選為 8cmX lcm，所述鏤空區(qū)域的大小優(yōu)選為4cmX0. 8cm。
[0026] 以上所述的分子印跡試紙條的應(yīng)用，用于待測樣品中鹽酸克倫特羅的定性、半定 量或定量檢測。所述待測樣品可為任何可能含有鹽酸克倫特羅物質(zhì)，如飼料、尿液等，通過 酸、堿或酶解等方法進行預處理，制備成待測樣品溶液。
[0027] 以上所述鹽酸克倫特羅的快速檢測方法，所述活性為200_400ug/mL的葡萄糖氧 化酶標記鹽酸克倫特羅溶液采用高碘酸氧化法制備，其制備方法為：稱取5. Omg葡萄糖氧 化酶溶解于ImL水中，加入0. 1~0. 3mL新配的0. lmol/L NaIO4溶液，室溫下避光攪拌10~ 30分鐘；將攪拌好的溶液裝入MW4000透析袋中，對lmmol/L pH值為4. 4的HAc-NaAc緩沖 液透析，4°C過夜；取上清液，加入10~40 μ L 0. 2mol/L pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液，使葡 萄糖氧化酶的pH值升高至9. 0~10. 0,得葡萄糖氧化酶溶液；取IOmL比色管，加入7mg鹽 酸克倫特羅及1~3mL 0.0 lmol/L pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液，待其完全溶解后，加入上述 葡萄糖氧化酶溶液，混勻，室溫避光攪拌1~3h，再加入0.1 mL新配的4mg/mL NaBH4溶液，混 勻，在4°C的環(huán)境中放置1~3h，得混合溶液；將所得混合溶液裝入透析袋中，對0. 15mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析，4°C過夜；透析完成后，將透析袋內(nèi)的溶液取出，并于4°C 避光保存，即得葡萄糖氧化酶標記鹽酸克倫特羅溶液，酶標儀測定其濃度為200~400ug/ mL〇
[0028] 本發(fā)明按照外標法以熒光顯色強度計算待測樣品中鹽酸克倫特羅的含量，計算公 式為：
[0029] Δ If= 218. 030-28. 65 (-IgC)
[0030] Λ If為空白熒光值與待測樣品熒光值的差值，
[0031] C為待測樣品溶液的濃度。
[0032] 本發(fā)明利用化學法聚合得到鹽酸克倫特羅的分子印跡聚合物，制備成對鹽酸克倫 特羅具有特異性識別能力的分子印跡試紙條，試紙條反應(yīng)區(qū)表面的孔穴能夠同時識別鹽酸 克倫特羅及具有相同結(jié)構(gòu)的葡萄糖氧化酶標記的鹽酸克倫特羅。將洗脫模板分子的試紙條 在高濃度的葡萄糖氧化酶標記的鹽酸克倫特羅中孵化后，印跡孔穴被葡萄糖氧化酶標記的 鹽酸克倫特羅占據(jù)。隨后競爭反應(yīng)是在樣品中的鹽酸克倫特羅和印跡膜上的葡萄糖氧化酶 標記的鹽酸克倫特羅之間進行，鹽酸克倫特羅能夠競爭取代葡萄糖氧化酶標記的鹽酸克倫 特羅重新占據(jù)孔穴。隨著樣品中鹽酸克倫特羅分子濃度的增加，印跡膜上被競爭取代的葡 萄糖氧化酶標記的鹽酸克倫特羅就越多，即殘留在印跡膜上的葡萄糖氧化酶就越少。而印 跡膜表面的葡萄糖氧化酶能夠與底液中的葡萄糖發(fā)生酶解反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫進 一步氧化分解底液中的署紅Y使其褪色，因此，通過熒光分光光度計檢測試紙條的熒光強 度，能對樣品中的鹽酸克倫特羅進行快速定量分析。
[0033] 本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 1.本發(fā)明利用分子印跡試紙條及熒光分光光度法來檢測鹽酸克倫特羅，克服了現(xiàn) 有的鹽酸克倫特羅檢測方法前處理復雜、時間長、成本高等現(xiàn)狀，該方法具有簡單、快速、成 本低、準確可靠等優(yōu)點，可用于