一種蒼柏袪痛制劑hplc指紋圖譜的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥制劑質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種蒼柏柱痛制劑HPLC(高效液相 色譜）指紋圖譜的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蒼柏柱痛散組方源于甘肅省名老中醫(yī)賈奇峰的經(jīng)典驗(yàn)方，主要由蒼術(shù)(款炒)、黃 柏、赤巧、防己等多味藥組成，具有清熱利濕，枯疲降濁，通絡(luò)止痛之效。該藥臨床上常與別 嚷醇聯(lián)合使用，W緩解痛風(fēng)急性發(fā)作期的紅、腫、熱、痛癥狀，還可進(jìn)一步穩(wěn)定痛風(fēng)患者血尿 酸水平從而控制痛風(fēng)復(fù)發(fā)。然而，聯(lián)合使用的別嚷醇毒副作用大，容易產(chǎn)生皮疹，腹瀉、惡 屯、、嘔吐、胃痛，手腳麻木、刺痛，過敏性血管炎等不良反應(yīng)，此外蒼柏柱痛散存在容易吸濕 結(jié)塊、藥物穩(wěn)定性差、具有不良?xì)馕?、患者服用劑量大，?dǎo)致患者依從性差等缺點(diǎn)，所W新的 制劑開發(fā)勢(shì)在必行。
[0003] 蘭州市肺科醫(yī)院制劑室對(duì)該蒼柏柱痛散組方進(jìn)行改進(jìn)，研制出一種蒼柏柱痛制 劑，其由W下中藥材的有效成分組成；蒼術(shù)7. 5-30重量份、黃柏7. 5-30重量份、川牛膝 5-20重量份、防己6-24重量份、赤巧6-24重量份、牡丹皮6-24重量份、細(xì)辛2. 5-10重量 份、苦參7. 5-30重量份、秦巧6-24重量份、松節(jié)7. 5-30重量份、萃游7. 5-30重量份、紫草 5-20重量份、黃花菜7. 5-30重量份、甘草1-4重量份。如何使成批生產(chǎn)的蒼柏柱痛制劑達(dá) 到質(zhì)量穩(wěn)定、安全可控，是實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)急需解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的提供一種蒼柏柱痛制劑HPLC指紋圖譜的測(cè)定方法。
[0005] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案如下： 一種蒼柏柱痛制劑HPLC指紋圖譜的測(cè)定方法，包括如下步驟： (1) 所述蒼柏柱痛制劑用己膳-磯酸提取，得到供試品溶液； (2) 供試品溶液上高效液相色譜儀檢測(cè)得到HPLC指紋圖譜，色譜條件為：色譜柱；C18 柱，檢測(cè)波長；284nm，W己膳-0. 1%磯酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)流動(dòng)相中己膳 的體積比隨時(shí)間變化為；〇-15min，1〇-18〇/〇 ;15-30min，18-50〇/〇 ;3〇-35min，50〇/〇。
[0006] 進(jìn)一步，步驟（1)中己膳與磯酸的體積比為（36~500:巧0~64)。
[0007] 優(yōu)選地，所述己膳與磯酸的體積比為36:64。
[0008] 優(yōu)選地，步驟（1)所述磯酸的濃度為0.1~0.2%。
[0009] 進(jìn)一步，步驟（1)所述提取的方式為加熱回流提取或超聲波提取。
[0010] 進(jìn)一步，所述蒼柏柱痛制劑由W下中藥材的有效成分組成： 蒼術(shù) 7. 5-30重量份 黃柏 7. 5-30重量份 川牛膝 5-20重量份 防己 6-24重量份 赤巧 6-24重量份 牡丹皮 6-24重量份 細(xì)辛 2. 5-10重量份 苦參 7. 5-30重量份 秦巧 6-24重量份 松節(jié) 7. 5-30重量份 萃游 7. 5-30重量份 紫草 5-20重量份 黃花菜 7. 5-30重量份 甘草 1-4重量份。
[0011] 進(jìn)一步，所述HPLC指紋圖譜特征峰歸屬的鑒定； 取鹽酸黃柏堿、龍膽苦巧、巧藥巧、粉防己堿、鹽酸小窠堿對(duì)照品，用己膳-磯酸溶解， 制成混合對(duì)照品溶液； 按蒼柏柱痛制劑的中藥材組成，分別制備不含黃柏、苦參、秦巧、防己、赤巧的陰性樣 品，再用己膳-磯酸提取，得到陰性樣品溶液； 將陰性樣品溶液W及混合對(duì)照品溶液上高效液相色譜儀檢測(cè)，分別得到陰性樣品和對(duì) 照品的圖譜； 根據(jù)供試品、陰性樣品和對(duì)照品的圖譜確定HPLC指紋圖譜特征峰的歸屬。
【附圖說明】
[001引圖1為對(duì)照品、樣品、陰性樣品的HPLC指紋圖譜； 圖2樣品的HPLC指紋圖譜； 圖3為10批次樣品的HPLC指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下述實(shí)施例只是用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例中所用的試劑和儀器 如未進(jìn)行特別說明，均為可從一般商業(yè)渠道獲得的常規(guī)試劑和儀器。
[0014] 實(shí)驗(yàn)例；蒼柏柱痛制劑HPLC指紋圖譜的測(cè)定 1材料和方法 1. 1儀器與試藥 高效液相色譜儀（Waters2695,美國），PDA檢測(cè)器（Waters2998)，Empowers色譜工作 站，色譜柱WatersXSELECTCSH-C18 (4.6mmX150mm，5ym)。
[001引鹽酸小窠堿對(duì)照品冊(cè)號(hào)110713-201212 )，鹽酸黃柏堿對(duì)照品冊(cè)號(hào) 111895-201202)，龍膽苦巧(批號(hào) 110770-201314)，巧藥巧(批號(hào) 110736-201438)，粉防己 堿(批號(hào)110711-200708)均購自中國食品藥品檢定研究院，蒼柏柱痛制劑（膠囊）（蘭州 市肺科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)分別為 20130828、20130925、20131017、20131126、20131218、 20140121、20140226、20140312、20140415、20140513)。己膳為色譜純?cè)噭?，其他試劑均為?析純，水為超純水。
[0016] 1.2方法 1.2.1色譜條件1.2.1.1色譜條件的建立 W鹽酸黃柏堿為考察指標(biāo)，比較不同洗脫方式、流動(dòng)相組成和比例下，鹽酸黃柏堿的含 量和各個(gè)目標(biāo)峰的分離度，從而建立指紋圖譜分析方法的色譜條件。即取本品樣品，混勻， 研細(xì)，取約2g，精密稱定，用甲醇-水（36:64)超聲處理（功率250W，頻率50曲Z) 45分鐘， 取出，放冷，再稱定重量，用甲醇-水（36:64)補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾紙濾過，取續(xù)濾液， 用0. 45ym微孔濾膜過濾，即得。
[0017] 1. 2. 1. 2提取方法的建立 在1. 2. 1. 1建立的色譜條件下測(cè)定鹽酸黃柏堿含量，考察不同提取方法和不同提取溶 劑的差異。
[0018] 1. 2. 1. 3檢測(cè)波長的確定 對(duì)樣品全波長掃描，其中鹽酸黃柏堿^。。,=284皿、龍膽苦巧A。。,=254皿、巧藥巧 入"x=274. 8皿和230皿、粉防己堿^。。,=280皿、鹽酸小窠堿^。。,=265皿。提取不同吸收波長 的色譜圖，選擇最佳檢測(cè)波長。
[0019] 1.2. 2方法學(xué)考察 1. 2. 2. 1供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品樣品，混勻，研細(xì)，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加 入己膳-0. 1%磯酸（36:64,V/V) 25血，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50曲Z) 30分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用己膳-0. 1%磯酸（36:64巧h足減失的重量，混勻，用定量 濾紙過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，用0. 45ym微孔濾膜過濾，即得。
[0020] 1. 2. 2. 2陰性樣品溶液的制備 按蒼柏柱痛制劑的處方分別制備不含黃柏、苦參、秦巧、防己、赤巧提取物的陰性樣品， 按"1. 2. 2. 1"項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。
[0021] 1.2. 2. 3對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品鹽酸黃柏堿、龍膽苦巧、巧藥巧、粉防己堿、鹽酸小窠堿適量，分別用己 膳-0.1%磯酸（36:64)溶解，配成濃度分別為 1.880、1.920、27.400、1.100、1.056111肖.111。 的單一對(duì)照品溶液。分別吸取各對(duì)照品溶液0. 4mL、3. 0血、0. 2血、1. 0血、1. 4mL置10血 量瓶中，^己膳-〇.1%磯酸（36:64)定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為0.0752111肖-111。鹽酸黃 柏堿、0. 5760mg?m。的龍膽苦巧、0. 548mg?血-1的巧藥巧、0.llOmg?血-1粉防己堿和 0. 1478mg?m。鹽酸小窠堿混合對(duì)照品溶液。
[0022] 1. 2. 2. 4精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)蒼柏柱痛制劑的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，W龍膽苦巧作為參照峰，考察 各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。
[0023] 1. 2. 2. 5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)蒼柏柱痛制劑供試品5份，每份2.Og，按"1. 2. 2. 1"項(xiàng)下所述方法制備供試 品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。
[0024] 1. 2. 2. 6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)蒼柏柱痛制劑的供試品溶液，分別在0, 2,4, 8,12,16, 24h進(jìn)樣測(cè)定。
[00巧]1. 2. 3指紋圖譜建立 1.2. 3. 1HPLC指紋圖譜的測(cè)定 取 10 批（S1 ;20130828、S2 ;20130925、S3 ;20131017、S4 ;20131126、S5 ;20131218、S6 ; 20140121、S7 ;20140226、S8 ;20140312、S9 ;20140415、S10 ;20140513)蒼柏柱痛制劑樣品， 按"1. 2. 2. 1"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在已確定的色譜條件下進(jìn)樣分析，即得樣品HPLC 指紋圖譜。
[0026] 分別將不含黃柏、苦參、秦巧、防己、赤巧提取物的陰性樣品W及對(duì)照品按上述色 譜條件測(cè)定。
[0027] 1. 2. 3. 2共有峰的確定 根據(jù)10批蒼柏柱痛制劑樣品的圖譜找出共有峰，選擇保留時(shí)間適中，峰面積適宜，重 現(xiàn)性好的共有峰做為參照峰，將其保留時(shí)間和色譜峰面積記為1，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保 留時(shí)間和相對(duì)峰面積。
[0028] 根據(jù)陰性樣品W及對(duì)照品的圖譜對(duì)上述找出的共有峰進(jìn)行歸屬確認(rèn)。
[0029] 1. 2. 3. 3樣品相似度評(píng)價(jià) 將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)開發(fā)的"中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版"計(jì)算軟件，采用夾角余弦法計(jì)算10批蒼柏柱痛制劑樣品之間指紋圖譜的相似度（W全 圖譜的峰計(jì)算）。一般情況下，相似度大于0. 9即認(rèn)為相似度良好。
[0030] 2.結(jié)果 2. 1色譜條件 2. 1. 1色譜條件的建立 表1通過不同流動(dòng)相測(cè)定的鹽酸黃柏堿含量（yg/g) (n=3)
注： 1、梯度洗脫方式 1 ;〇-15min,l〇-18〇/〇A;15-30min，18-50〇/〇A;3〇-35min，50〇/〇A。
[0031] 2、梯度洗脫方式 2 ;0-15min,l〇-30〇/〇A;15-30min，3〇-50〇/〇A;3〇-35min，50〇/〇A。
[0032] 3、梯度洗脫方式 3 ;0-15min,l〇-50〇/〇A;15-30min，5〇-80〇/〇A;3〇-35min，80〇/〇A。
[003引 4、"0-15min, 10-50%A"表示從第0至第15分鐘，流動(dòng)相中A的體積比由10%線 性變化至50%，其它的依此類推。
[0034] 5、柱溫30°C，流速為1. 0血?min-1，檢測(cè)波長284nm，進(jìn)樣量10yL。
[00巧]流動(dòng)相采用甲醇-水或己膳-水時(shí)，除鹽酸黃柏堿W外的其他目標(biāo)峰分離度均 差，且當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水（50:50,V/V)時(shí)，鹽酸黃柏堿峰形差無法計(jì)算其含量。而當(dāng)水 相改為磯酸后，鹽酸黃柏堿峰形明顯改善，且梯度洗脫明顯優(yōu)于等度洗脫。在梯度洗脫中， 己膳（A)體積比例變化過快時(shí)，鹽酸黃柏堿的分離度R<1. 5,無法計(jì)算其含量。其中采用 己膳-0. 2wt%磯酸時(shí)，目標(biāo)峰分離均好，但粉防己堿的特征峰出現(xiàn)拖尾，且磯酸濃度過高 易出現(xiàn)色譜柱堵塞情況。故選擇己膳-0.Iwt%磯酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0-15min, l〇-18〇/