專利名稱：一種誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長期以來，植物病害的防治主要依賴于抗病品種和化學(xué)農(nóng)藥。但由于現(xiàn)代社會對環(huán)境保護的日益重視，限制或減少化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)上的使用已是大勢所趨；植物的遺傳抗病性狀常常與其它農(nóng)藝性狀常常難以有機結(jié)合，選育既抗病又高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)作物品種的難度越來越大，例如至今也未能培育出抗黃萎病的棉花品種，而且現(xiàn)推廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種在獲得高效抗蟲性后，抗病性不僅沒有增強，反而大都有所降低。因此，研究探索植物保護的新技術(shù)、新途徑一直是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)科技工作者的重要努力方向。植物誘導(dǎo)抗病性也稱系統(tǒng)抗病性，是指經(jīng)誘導(dǎo)物處理后，植物體本身產(chǎn)生的對多種有害病原菌抗性，而非專一抗性的現(xiàn)象，植物體內(nèi)未直接接觸誘導(dǎo)物的部位也被誘導(dǎo)表達PRs蛋白(病程相關(guān)蛋白，Pathogenesis related proteins)是其最重要的生理指標(biāo)。植物誘導(dǎo)抗病性具有抗病譜廣、持續(xù)時間長和利用安全方便等特點，被認(rèn)為是植物病害防治的一種新途徑、新技術(shù)，目前已成為國際上重要的農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域。
為使植物誘導(dǎo)抗病性應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，近20多年來國際上研究篩選有效的抗病誘導(dǎo)物，特別是能商業(yè)化生產(chǎn)的化學(xué)藥劑，迄今已發(fā)現(xiàn)2，6-二氯異煙酸(INA)、苯并噻唑類制劑(BTH)和氨基丁酸(BABA)等化合物可誘導(dǎo)作物產(chǎn)生對黃萎病、枯萎病及葉斑病的抗性，其中苯并噻唑類制劑(BTH)已開始商業(yè)化生產(chǎn)；但因該誘導(dǎo)物為化學(xué)制劑，對多數(shù)農(nóng)作物有藥害，因此開發(fā)效果一般。而開發(fā)活的微生物作為誘導(dǎo)物雖可避免這個問題，但實際應(yīng)用效果常常受到環(huán)境條件的影響，而且誘導(dǎo)物的制備工序復(fù)雜，成本較高，開發(fā)難度也很大。目前，研究開發(fā)無污染、施用安全的生物制劑是該領(lǐng)域的熱點，發(fā)明人曾開發(fā)了一種誘導(dǎo)植物表達病程相關(guān)蛋白的有機肥(專利授權(quán)號zl200510010824.8)，它同時具備良好肥效，又可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機肥，但由于營養(yǎng)物質(zhì)完全來自于青霉素的發(fā)酵殘渣，其N、P、K比例是固定的，不能適應(yīng)各種不同植物生長發(fā)育的需求，且制備過程中的高溫破壞了其中的多糖等活性成分，造成活性下降、資源浪費，因此，直接開發(fā)活性強的一種誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑，活性較高，既可以單獨使用，又可以加入其它肥料中，是一種經(jīng)濟節(jié)約、適用面更廣的方法。
參考文獻1.Huges，D.W.and Galau，A.G.(1988)，Preparation of RNA from cotton leaves and pollen.Plant Mol.Bio.Rep.6253-2572.Melissa K.Hill，Lyon Karin J.，Lyon Bruce R.(1999)Identification of disease response genes expressedin Gossypium hirsutum upon infection with the wilt pathogen Verticillium dahliae.Plant MolecularBiology，40289-2963.Sambrook J，Russell DW(2001)Molecular cloninga laboratory manual.3rd edn..ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于通過對可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)表達PRs蛋白的滅活青霉素生產(chǎn)殘渣的研究，提供一種誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用。
本發(fā)明的有機活性誘導(dǎo)劑成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)21.5-52.5％(其中多糖含量0.3-15％)，無定形SiO230-54％，全N 1.2-5％，P0.1-1.5％和K 0.2-1.2％，其他9.8-23％。該有機活性誘導(dǎo)劑由下列步驟制成；(1)將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣倒入預(yù)混池，按照殘渣∶硅藻土質(zhì)量比為10∶1-3的比例加入干燥的硅藻上，攪拌混合均勻；(2)將上述預(yù)混合料100℃-200℃鼓風(fēng)干燥滅活0.5-2.5小時；擠壓造粒或直接用，即得到誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明的有機活性誘導(dǎo)劑可加水制成混懸液直接灌根、也可按1份誘導(dǎo)劑加10-50份有機肥或其它肥料的形式以基肥、追肥的形式施用，既可誘導(dǎo)植物表達病程相關(guān)蛋白從而產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一、有機活性誘導(dǎo)劑的制備(1)將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣倒入預(yù)混池，按照殘渣∶硅藻土質(zhì)量比為10∶1-3的比例加入干燥的硅藻上，攪拌混合均勻；
(2)將上述預(yù)混合料100℃-200℃鼓風(fēng)干燥滅活0.5-2.5小時；擠壓造?；蛑苯佑?，即得到誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑。該工序利用青霉素高于80℃分解的特性，高溫分解殘留的青霉素，全部殺死青霉菌。
3、將制備的樣品按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)檢測，成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)21.5-52.5％(其中多糖含量0.3-15％)，無定形SiO230-54％，全N1.2-5％，P0.1-1.5％和K0.2-1.2％，其他9.8-23％。
二、誘導(dǎo)抗病性試驗1、病原菌培養(yǎng)分別引起甜瓜、棉花枯萎病的病原菌Fusarium oxysporum f.sp.Melonis(race0、race1、race2、race1，2四個生理小種)；Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)，15天后收集孢子，用細(xì)胞計數(shù)器將孢子濃度調(diào)整到106-107個/ml。
2、病原菌的接種試驗a.樣品水提液的制備取該有機活性誘導(dǎo)劑50g，加蒸餾水至10L，浸泡24小時，過濾得到0.5％濃度的水提液，或稀釋到所需濃度。
b.對甜瓜枯萎病四個生理小種的抗病性實驗甜瓜(Cucumis melo L.cv.En-Dor)、按常規(guī)栽培管理，每種處理選長勢一致的健康苗200株，用2％的有機肥水提液灌根，分別按標(biāo)準(zhǔn)方法接種甜瓜枯萎病病原菌四個生理小種的孢子，以植株1/3以上部分出現(xiàn)枯萎癥狀作為指標(biāo)，統(tǒng)計病株率，可知該樣品對有關(guān)作物病害的防治效果。
試驗結(jié)果0.1-0.5％的該有機活性誘導(dǎo)劑對于甜瓜枯萎病的四個生理小種均表現(xiàn)顯著的防治作用，發(fā)病病株率可降低20-75％，說明該有機活性誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的對甜瓜枯萎病不同生理小種的抗性沒有選擇性，符合誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的一般規(guī)律。與原誘導(dǎo)抗病有機肥2-5％濃度效果相同，濃度卻降低了100倍。
c.對不同棉花品種抗枯萎病的試驗四個品種棉花(Gossypium hirsutum L.cv.H552，Vered；Gossupium barbadense L.cv.P906，PF15)，按常規(guī)栽培管理，每種處理選長勢一致的健康苗200株，用0.1-0.5％的有機活性誘導(dǎo)劑水提液灌根，分別按標(biāo)準(zhǔn)方法接種棉花枯萎病病原菌的孢子，以植株1/3以上部分出現(xiàn)枯萎癥狀作為指標(biāo)，統(tǒng)計病株率，可知該樣品對棉花病害的防治效果。
實驗結(jié)果雖然4個供試品種對棉花枯萎病的遺傳抗病性差別很大，陸地棉H552、Vered為感病品種和海島棉P906，PF15為抗病品種，但使用本發(fā)明的有機活性誘導(dǎo)劑0.1-0.5％水提液灌根后，發(fā)病株率皆比各自空白對照顯著降低20％-50％，說明品種的遺傳抗病性并不影響該有機活性誘導(dǎo)劑的防病效果。與原誘導(dǎo)抗病有機肥2-5％濃度效果相同。
3、病程相關(guān)蛋白基因表達檢測a.樣品水提液的制備取該有機活性誘導(dǎo)劑50g，加蒸餾水至10L，浸泡24小時，過濾得到0.5％濃度的水提液。
b.棉苗的培養(yǎng)和誘導(dǎo)取陸地棉(Gossypium hirsutum L)品種魯棉研21號的種子，采用常規(guī)沙培的方法于28℃的條件下培養(yǎng)。待棉苗子葉平展后，以濃度0.5％的誘導(dǎo)抗病性肥水提液灌根，以蒸餾水灌根為對照。于灌根后6、8、12、24和48h取下子葉，置液氮中冷凍固定，然后于-80℃下保存?zhèn)錅y。
c.總RNA的提取根據(jù)Hughes和Galau(1988)的方法和Melissa(1999)的改進方法，分別提取各處理組的子葉總RNA。利用260/280光吸收值和瓊脂糖電泳的方法確保各樣品濃度和質(zhì)量一致；d.PR蛋白基因表達的檢測每個樣品取10μg RNA經(jīng)過甲醛變性膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至Hybond-N+膜上，亞甲蘭染色，根據(jù)28S rRNA的量，確保膜上每個樣品RNA的濃度和質(zhì)量得一致性。將8種不同PRs蛋白基因片段(見表1)以內(nèi)切酶切下后，利用隨機引物法將片段標(biāo)記32pdCTP，作為探針，用于Northern雜交分析。Northern雜交根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進行(Sambrooket al.，2001)，雜交完成后壓X-光片(Kodark)-80℃曝光5-6天。根據(jù)X-光片上的曝光強度可以直觀的觀察到不同處理時間各種PR蛋白基因的相對表達量。
表1、用于標(biāo)記探針的質(zhì)粒

e.試驗結(jié)果對棉花根部不同時間的水提掖處理，利用Northern雜交的方法，在遠(yuǎn)離根部的子葉中檢測出PR-2、PR-1a、PR-1b、酸性幾丁質(zhì)酶和堿性幾丁質(zhì)酶基因出現(xiàn)持續(xù)性的誘導(dǎo)表達。效果與與原誘導(dǎo)抗病有機肥一致。
已知PRs蛋白的易位累積，均不是通過轉(zhuǎn)移從感染部位或誘導(dǎo)物處理部位移動到其它部分的，因此在未直接處理物的子葉檢出部分PR蛋白的大量表達，說明本發(fā)明制備的有機活性誘導(dǎo)劑能夠誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性(systemic acquired resistance)，而不僅僅是局部抗性(local resistance)。
本發(fā)明具有效果佳、無公害、有廣泛應(yīng)用領(lǐng)域等優(yōu)點，特別適宜需要大量農(nóng)藥才能控制病害的作物種植。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例一將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣倒入預(yù)混池，按照殘渣∶硅藻土質(zhì)量比為10∶1的比例加入干燥的硅藻土，攪拌混合均勻；將上述預(yù)混合料200℃鼓風(fēng)干燥滅活1.5小時；擠壓造粒，即可得到誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑。有機活性誘導(dǎo)劑成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)52.5％，無定形SiO230％，全N5％，P1.5％和K1.2％，其他9.8％；將該有機活性誘導(dǎo)劑按每畝5公斤的量加入普通有機肥中混勻，在煙草品種紅花大金元漂浮育成的小苗移栽入大田時，作為基肥施入土壤，常規(guī)栽培、管理，結(jié)果表明病株率比對照下降28％。
實施例二基本同實施例一，不同之處為殘渣和干燥硅藻土的比例為10∶2，150℃干燥滅活2小時，有機活性誘導(dǎo)劑成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)41.5％，無定形SiO240％，全N3％，P1％和K1％，其他13.5％；將該有機活性誘導(dǎo)劑加水制成混懸液直接灌根，以每畝5公斤用量施入，常規(guī)栽培、管理煙草品種紅花大金元，結(jié)果表明病株率比對照下降42％。
實施例三基本同實施例一，不同之處為∶殘渣和干燥硅藻土的比例為10∶3，100℃鼓風(fēng)干燥滅活2.5小時。不造粒，直接作為誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑。有機活性誘導(dǎo)劑成分的質(zhì)量百分比為質(zhì)量百分比為有機質(zhì)21.5％，無定形SiO254％，全N1.2％，P0.1％和K0.2％，其他23％；將該有機活性誘導(dǎo)劑加水制成混懸液直接灌根，以每畝8公斤用量施入，常規(guī)栽培、管理煙草品種紅花大金元，結(jié)果表明病株率比對照下降40％。
實施例四基本同發(fā)明內(nèi)容中誘導(dǎo)抗病性試驗c步驟的過程。不同之處為取煙草品種紅花大金元漂浮育成的小苗進行試驗。
本發(fā)明的有機活性誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)植物表達PR-1b、PR-3、PR-5、酸性幾丁質(zhì)酶，產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，具備了很好的應(yīng)用開發(fā)前景。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑，其特征在于該有機活性誘導(dǎo)劑成分的質(zhì)量百分比為多糖含量為0.3-15％的有機質(zhì)21.5-52.5％，無定形SiO230-54％，全N 1.2-5％，P 0.1-1.5％和K 0.2-1.2％，其他9.8-23％，該有機活性誘導(dǎo)劑由下列步驟制成；(1)將醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)青霉素的固-液混合廢棄殘渣倒入預(yù)混池，按照殘渣∶硅藻土質(zhì)量比為10∶1-3的比例，加入干燥的硅藻土，攪拌混合均勻；(2)將上述預(yù)混合料100℃-200℃鼓風(fēng)干燥滅活0.5-2.5小時；擠壓造?；蛑苯佑?，即得到誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑。
2.權(quán)利要求1所述的有機活性誘導(dǎo)劑，以制成水懸液直接灌根或添加到其它肥料中作為基肥、追肥的形式施用，作為誘導(dǎo)植物表達病程相關(guān)蛋白從而產(chǎn)生抗病性的應(yīng)用。
全文摘要
一種誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的有機活性誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。該有機活性誘導(dǎo)劑成分的質(zhì)量百分比為有機質(zhì)21.5－52.5％(其中多糖含量0.3－15％)，無定形SiO
文檔編號A01N59/00GK101088340SQ20071006603
公開日2007年12月19日 申請日期2007年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日
發(fā)明者陳穗云, 沈霏, 徐常亮, 姬廣海, 李秀軍, 董合忠 申請人:云南大學(xué)