專利名稱：植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YA1及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YAl及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響植物生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應(yīng)答與信號傳導(dǎo)機(jī)制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務(wù)之一。在逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對逆境的反應(yīng)機(jī)制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細(xì)胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來改進(jìn)植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應(yīng)能力。在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細(xì)胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達(dá)或參與信號傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強(qiáng)對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、 滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定了它對基因表達(dá)起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有AP2結(jié)構(gòu)域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/ leucinezipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、結(jié)合CCAAT-box的主要核轉(zhuǎn)錄因子的CBF(CCAAT binding factor) 類轉(zhuǎn)錄因子、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇 (Trp cluster)的MTO家族。這些轉(zhuǎn)錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應(yīng)外， 其它四個家族均參與調(diào)節(jié)植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應(yīng)。其中，NF-Y轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，近年來，在擬南芥、玉米、水稻均有報(bào)道，這表明NF-Y轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。NF-Y (核轉(zhuǎn)錄因子，Nuclear Factor Y)是一種結(jié)合CCAAT_box的主要的核轉(zhuǎn)錄因子，特異的識別并結(jié)合許多真核生物組成型、誘導(dǎo)性和細(xì)胞周期依賴性基因的啟動子或增強(qiáng)子中的保守序列CCAAT-box，并調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。NF-Y是由NF_YA、NF_YB 和NF-YC三個不同亞基組成的三聚體。NF-TO和NF-YC的組蛋白折疊基序(HFM)相互作用使之形成二聚體，然后結(jié)合NF-YA形成異源三聚體的NF-Y復(fù)合物，從而結(jié)合CCAAT-box，調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-YA至少有兩個結(jié)構(gòu)域用于蛋白質(zhì)的結(jié)合富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域 (Q-rich domain)和一個亞基相互作用的結(jié)構(gòu)域(subunitinteraction domain)。NF-YB 也有兩個蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域組蛋白折疊基序(histone-fold motif)和TATA結(jié)合蛋白 (TATA-binding protein)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBP-binding domain)。NF-YC 有三個蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域組蛋白折疊基序，TBP結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域。NF-YA和NF-YC 的結(jié)構(gòu)氨基酸序列與組蛋白折疊基序同源，NF-YB與H2B組蛋白折疊基序相關(guān)，而NF-YC于 H2A組蛋白折疊基序相關(guān)，該基序由三個α螺旋和兩個環(huán)組成，負(fù)責(zé)Η2Α/Η2Β 二聚體的形成。目前，在植物中關(guān)于NF-Y轉(zhuǎn)錄因子的功能的報(bào)道較少，都在干旱脅迫中起重要的作用(Nelson et al，2007)。Nelson等認(rèn)為，與擬南芥AtNF-YBl轉(zhuǎn)錄因子同源的ZmNF_YB2， 在缺水的條件下過表達(dá)ZmNF-YB2的轉(zhuǎn)基因玉米可以明顯增強(qiáng)抗旱性，由于ZmNF_YB2可以是多個與植物干旱有關(guān)參數(shù)發(fā)生改變，包括葉綠素含量、氣口導(dǎo)度、葉片溫度、減少萎蔫和維持光合作用，從而提高抗旱性(Nelson, Peter P. Repetti, TomR. Adams, Jingrui Wu, 2007)。Wen-Xue Li, Youko Oono等的研究證實(shí)，AtNF_YA5的表達(dá)受到干旱和ABA處理的誘導(dǎo)。對其啟動子GUS分析表明部分誘導(dǎo)反應(yīng)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。NF-YA5有一個靶位點(diǎn)miR169， 在干旱條件下，miR169表達(dá)受到抑制。NF-YA5在微管組織和保衛(wèi)細(xì)胞有很高的表達(dá)，因此， 利用一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)多個功能基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YAl及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為一種結(jié)合CCAAT-box的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，名稱為 GmNF-YAl，來源于大豆屬大豆(Glycine max L.)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列1所示蛋白質(zhì)由348個氨基酸殘基組成，自氨基端第213-217位氨基酸殘基序列為可能的核定位信號區(qū)，自氨基端第184-240位氨基酸殘基序列為保守的NF-YA結(jié)構(gòu)域。為了使(a)中的GmNF-YAl便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，優(yōu)選為如下1)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA 分子1)序列表中序列2自5’端第2 至1274位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5’端第2M至1315位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2自5’端第181至1315位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的 DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為 YEP-GAP-GmNF-YAl 或 pBI12I-GmNF-YAl所述YEP-GAP-GmNF-YAl為將權(quán)利要求2所述基因插入YEP-GAP的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第2M至1315位核苷酸所示的DNA片段插入 YEP-GAP的BamHI和BioI酶切識別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒；所述pBI121-GmNF-YAl為將權(quán)利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第181至1315位核苷酸所示的DNA片段插入 PBI121的SmaI和McI酶切識別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒。
5.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2所述基因?qū)肽康闹参镏校玫侥湍嫘愿哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2所述基因通過權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐旱。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥，優(yōu)選為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；所述方法為將權(quán)利要求2所述基因通過所述pBI121-GmNF-YAl導(dǎo)入所述目的植物中。
9.擴(kuò)增權(quán)利要求2所述基因或其任意片段的引物對。
10.權(quán)利要求1所述蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YA1及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的GmNF-YA1在干旱、鹽、ABA和乙烯的誘導(dǎo)下表達(dá)，編碼的蛋白定位到細(xì)胞核上。本發(fā)明的GmNF-YA1可以提高植物的抗旱性，為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號A01H5/00GK102234322SQ20101016169
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者徐兆師, 李連城, 陳明, 馬有志 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所