專利名稱：攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的領(lǐng)域為生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是上個世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，在東南亞、東亞和南亞一些國家局部發(fā)生，對水稻生產(chǎn)造成一定影響。目前主要發(fā)生流行于我國的廣西、福建、湖南、江西、貴州、云南等地。病株表現(xiàn)濃綠矮縮，葉片扭曲呈鋸齒狀缺刻，在葉背和葉鞘生有細(xì)長脈腫。分蘗期前發(fā)病不能抽穗，后期發(fā)病，抽穗不完全、谷粒不充實等癥狀。發(fā)病田塊一般減產(chǎn)10% 20%，嚴(yán)重的減產(chǎn)可達(dá) 80% 100%,是影響水稻產(chǎn)量比較嚴(yán)重的病毒病害之一。RRSV為呼腸孤病毒科水稻病毒屬(Oryzavirus)的典型成員，引起水稻齒葉矮縮病。RRSV基因組包括10條雙鏈RNA片段 (Sl-SlO)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和基因組雙鏈RNA的電泳圖譜與該科另外兩個屬一植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)和斐濟病毒屬(Fifivirus)的病毒有較大的區(qū)別。RRSV具有雙層衣殼， 呈二十面體結(jié)構(gòu)，完整病毒粒體的直徑約為65nm，核心顆粒約50nm。電鏡下可觀察到直徑 50 66nm或是40nm的病毒粒子分布在感病水稻葉片韌皮細(xì)胞的病毒質(zhì)體(viro-plasm) 中；帶毒蟲體內(nèi)的器官或組織里也可觀察到直徑40 45nm或50 75nm兩類球形結(jié)晶狀粒子，聚集或是分散地排列在細(xì)胞質(zhì)的病毒質(zhì)體中。水稻鋸齒葉矮縮病毒主要由介體昆蟲褐飛虱傳播，病株液汁、種子和土壤均不傳毒。其自然寄主有水稻、蟋蟀草、水蜈蚣和稗草，人工侵染的植物有大麥、小麥、燕麥、玉米、甘鹿、稗等10多種。RRSV的介體昆蟲褐飛風(fēng) (NiIaparvatalugens)是一種遷飛性昆蟲,其傳播為持久性方式,但不經(jīng)卵傳播。褐飛風(fēng)的若蟲蛻皮但不失毒，病毒在蟲體中的分布以唾液腺中含量最高。介體最小獲毒時間是3小時(h)，平均9天(d)。最短的傳毒期是lh，接種后10-36d顯示癥狀，傳毒率大約為40%。 幼蟲可能比成蟲的傳毒效率更高，雌蟲和雄蟲，長翅型和短翅型傳毒效率相同。介體傳毒通常具有間歇性傳毒期，可保持1-4周或終生傳毒。不同地理種群的褐飛虱具有相似的傳毒特性。目前RRSV在我國多個省份流行，已嚴(yán)重影響我國的水稻糧食生產(chǎn)，而抗病品種應(yīng)用是水稻病毒病最經(jīng)濟、最有效的方法，這就決定迫切需要建立一種RRSV水稻抗性品種的鑒定方法，為抗RRSV的水稻資源的發(fā)掘、抗性品種鑒定和品種選育提供技術(shù)手段。因為 RRSV傳播方式的特殊性，不能用病汁液摩擦接種方式進(jìn)行接種且不經(jīng)卵傳播，本發(fā)明專利采用在病株或凍存病樣上飼喂的方式獲得攜帶RRSV的褐飛虱，這為水稻抗性品種的鑒定、 抗病選育、抗RRSV的特異性單克隆抗體的篩選以及褐飛虱與RRSV的互作研究提供物質(zhì)和技術(shù)支持。且本發(fā)明提供的通過飼喂方式使褐飛虱從冷凍葉片上獲得RRSV的方法，解決了患病植株難以長期保存的問題，拓寬了研究的時間，有利于抗病品種的選育、抗RRSV的特異性單克隆抗體的篩選以及褐飛虱與RRSV的互作等研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法及其應(yīng)用。攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法的步驟如下
1)褐飛虱的獲得
從非水稻齒葉矮縮病毒發(fā)生地區(qū)的水稻田間捕獲褐飛虱后，在室內(nèi)用非抗蟲水稻品種的無毒秧苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;待褐飛虱成蟲交配后單頭蟲單獨產(chǎn)卵，隨機抽取種群中10%的褐飛虱用RT-PCR和dot-ELISA 方法分析帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)種群，以后每代隨機抽取種群中10% 的褐飛虱用RT-PCR、dot-ELISA方法確定褐飛虱不帶水稻齒葉矮縮病毒，即獲得不攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng);
2)褐飛虱的獲毒
褐飛風(fēng)從冷凍保存感病水稻病株中獲毒
用濾紙保濕下I 2齡褐飛虱若蟲饑餓2 3小時；-10 _80°C冰箱中取出冷凍保存的感染水稻齒葉矮縮病毒的水稻病株I 3株，放置溫室或4°C冰箱中解凍I 3小時后移入以尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器或燒杯中，然后放入已饑餓2 3小時的20-300只 I 2齡褐飛虱若蟲，飼毒I 2天后將存活的褐飛虱移至養(yǎng)蟲的健康水稻苗，飼毒褐飛虱在健康水稻苗上經(jīng)過約10 15天病毒循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA方法檢測褐飛虱體內(nèi)的水稻齒葉矮縮病毒，分析其帶毒率，獲得攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng);
或者，褐飛虱從種植于溫室或植物生長箱內(nèi)的水稻病株上獲毒用濾紙保濕下I 2齡褐飛虱若蟲饑餓2 3小時；攜帶RRSV的水稻病株I 5株用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制植物生長箱中培養(yǎng)，每個裝置中放入饑餓3小時后的20 300頭I 2齡無毒的褐飛虱若蟲，飼毒2 10天后將存活的褐飛虱移入新鮮健康水稻苗上飼養(yǎng)7 12天直至渡過病毒的循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA 方法檢測褐飛虱體內(nèi)的水稻齒葉矮縮病毒，分析其帶毒率，獲得攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng);
攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種的抗性，篩選水稻的抗病品種，為抗水稻齒葉矮縮病毒抗病育種服務(wù)；
攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種抗性的方法為 將攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱移入待鑒定的種植于溫室或植物生長箱的I. 5-3葉期水稻苗，采用單苗5頭蟲方法接種待鑒定水稻品種，飼養(yǎng)2-7天后移出全部褐飛虱，將稻苗移栽至溫室或植物生長箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為65 %-75 %，光周期為16L: 8D ;7天以后開始觀察病毒癥狀，連續(xù)調(diào)查30-40天；用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測水稻； 根據(jù)飼喂接毒水稻的病毒癥狀及其RT-PCR和dot-ELISA檢測結(jié)果判斷水稻的抗性；
所述的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于篩選抗水稻齒葉矮縮病毒特異、靈敏的單抗，從而建立以單抗為核心的檢測水稻及褐飛虱體內(nèi)水稻齒葉矮縮病毒的免疫學(xué)方法； 攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于研究水稻齒葉矮縮病毒與介體昆蟲之間的互作及其傳毒機理提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果1)提供的通過飼喂方式使褐飛虱從冷凍葉片上獲得水稻齒葉矮縮病毒的方法，解決了患病植株難以長期保存的問題，這樣就能在任何時候提供帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于開展抗病品種選育、抗RRSV的特異性單克隆抗體的篩選以及褐飛虱與水稻齒葉矮縮病毒的互作等研究工作。2)通過血清學(xué)方法篩選到攜帶RRSV的褐飛虱可用于篩選抗RRSV的單抗，建立免疫學(xué)方法可有效地用于田間作物及褐飛虱中的RRSV的檢測，對該病毒病的發(fā)生流行進(jìn)行監(jiān)測，為科學(xué)防控提供依據(jù)。


圖I RT-PCR方法鑒定RRSV感病水稻的結(jié)果；
圖2 dot-ELISA方法鑒定RRSV感病水稻的結(jié)果；
圖3人工條件下冷凍保存后的病樣及活的感病水稻植株飼毒褐飛虱的裝置圖；左-冷凍保存后的病葉，右-活的感病水稻植株；
圖4 dot-ELISA方法分析褐飛虱的獲毒情況；
圖5 RT-PCR方法分析褐飛虱的獲毒情況；
圖6獲毒褐飛虱篩選抗RRSV單抗結(jié)果；
圖7 RT-PCR方法檢測獲毒褐飛虱傳毒能力的結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明利用攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱可篩選抗RRSV的單抗，鑒定水稻品種對該病毒的抗性，為抗水稻齒葉矮縮病毒的水稻資源的發(fā)掘、抗性品種選育提供手段和物質(zhì)基礎(chǔ)，還可為進(jìn)一步研究RRSV與媒介昆蟲之間的互作提供材料和手段。褐飛虱的獲得從非水稻齒葉矮縮病毒發(fā)生地區(qū)的水稻田間捕獲褐飛虱后，在室內(nèi)用非抗蟲水稻品種的無毒秧苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %， 光周期為16L 8D ;待褐飛虱成蟲交配后單頭蟲單獨產(chǎn)卵，隨機抽取種群中10%的褐飛虱用 RT-PCR和dot-ELISA方法分析帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)種群，以后每代隨機抽取種群中10%的褐飛虱用RT-PCR、dot-ELISA方法確定褐飛虱不帶水稻齒葉矮縮病毒，即獲得不攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱；
褐飛虱從冷凍保存感病水稻病株中獲毒用濾紙保濕下I 2齡褐飛虱若蟲饑餓2 3小時；_10 _80°C冰箱中取出冷凍保存的感染水稻齒葉矮縮病毒的水稻病株I 3株,放置溫室或4°C冰箱中解凍I 3小時后移入以尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器或燒杯中， 然后放入已饑餓2 3小時的20-300只I 2齡褐飛虱若蟲，飼毒I 2天后將存活的褐飛虱移至養(yǎng)蟲的健康水稻苗，飼毒褐飛虱在健康水稻苗上經(jīng)過約10 15天病毒循回期后， 用RT-PCR、dot-ELISA方法檢測褐飛虱體內(nèi)的水稻齒葉矮縮病毒，分析其帶毒率，獲得攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng);
褐飛虱從種植于溫室或植物生長箱內(nèi)的水稻病株上獲毒用濾紙保濕下I 2齡褐飛虱若蟲饑餓2 3小時；攜帶RRSV的水稻病株I 5株用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制植物生長箱中培養(yǎng)，每個裝置中放入饑餓3小時后的20 300頭 I 2齡無毒的褐飛虱若蟲，飼毒2 10天后將存活的褐飛虱移入新鮮健康水稻苗上飼養(yǎng) 7 12天直至渡過病毒的循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA方法檢測褐飛虱體內(nèi)的水稻齒葉矮縮病毒，分析其帶毒率，獲得攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng);攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種的抗性，篩選水稻的抗病品種，為抗水稻齒葉矮縮病毒抗病育種服務(wù)；
攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種抗性的方法為 將攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱移入待鑒定的種植于溫室或植物生長箱的I. 5-3葉期水稻苗，采用單苗5頭蟲方法接種待鑒定水稻品種，飼養(yǎng)2-7天后移出全部褐飛虱，將稻苗移栽至溫室或植物生長箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為65 %-75 %，光周期為16L: 8D ;7天以后開始觀察病毒癥狀，連續(xù)調(diào)查30-40天；用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測水稻； 根據(jù)飼喂接毒水稻的病毒癥狀及其RT-PCR和dot-ELISA檢測結(jié)果判斷水稻的抗性；
攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于篩選抗水稻齒葉矮縮病毒特異、靈敏的單抗，從而建立以單抗為核心的檢測水稻及褐飛虱體內(nèi)水稻齒葉矮縮病毒的免疫學(xué)方法；
攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于研究水稻齒葉矮縮病毒與介體昆蟲之間的互作及其傳毒機理提供物質(zhì)基礎(chǔ)。下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。I、感染RRSV水稻的獲得
I)在RRSV發(fā)生水稻地區(qū)，根據(jù)感染RRSV水稻癥狀，采集感染RRSV水稻植株，如2011 年9月于云南施甸縣舊城鄉(xiāng)的水稻齒葉矮縮病毒發(fā)生區(qū)采集具有濃綠矮縮、葉片扭曲呈鋸齒狀缺刻、在葉背和葉鞘生有細(xì)長脈腫的水稻病樣。2 ) RT-PCR方法鑒定水稻病樣
參照Trizol試劑提取水稻病樣的總RNA,根據(jù)根據(jù)GenBank中報道的水稻齒葉矮縮病毒的衣殼蛋白基因(CP基因)序列(登陸號EU523360)設(shè)計特異性引物，RRSV-CP-F 5，CGAATCATCACTGAACAAGTATTTGG 3，和 RRSV-CP-R :5，TCATACACCGGAACCGCTGG 3，。采用 RT-PCR方法檢測確定病樣感染水稻鋸齒葉矮縮病毒。第一鏈cDNA的合成按照RevertAidTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，即模板RNA 2 W，下游引物I W，RNase Free H2O 9 W。混勻后 70°C下 5 min，取出置冰上 3-5 min ;加入4 W 5 X RT Buffer, 2 dNTP Mix, I W Rnasin Inhibitor,混勻后 37°C下 5 min ;加入 I Ml Reverse Transcriptase,混合后 42°C下反應(yīng) lh，70°C下10 min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系如下預(yù)變性 94°C 2 min,變性 94°C 45 sec,退火 52°C I min,延伸 72°C 2 min，循環(huán)擴增 35 次，最后延伸72°C 10 min。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖I所示， 鑒定了采集的樣品為感染RRSV的病株。3) Dot-ELISA方法鑒定水稻病樣
將水稻病葉稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30 (w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 U I上清點到NC膜上，同時設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽性對照；室溫(10°C -35°C)干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉 30 min ； NC膜放入適度稀釋的抗RRSV的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4 次，每次3 min ； NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min; PBST 洗膜 4 5 次，每次 3 min; 66 u L NBT 和 33 u L BCIP 底物(Promega)加入到 10 ml 底物緩沖液(0. I mol/L Tris C1、0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時自來水漂
6洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。結(jié)果如圖2所示，進(jìn)一步證明了所采集的樣品為感染RRSV的病株。檢測后確定帶水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)的病株培養(yǎng)于溫室或物質(zhì)生長箱內(nèi)或保存于-10 -80°C冰箱中。2、褐飛虱的獲得
從非RRSV發(fā)生地區(qū)的水稻田間捕獲褐飛虱后，在室內(nèi)用非抗蟲水稻品種的無毒稻苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;待褐飛虱成蟲交配后單頭蟲單獨產(chǎn)卵，隨機抽取群體中10%的褐飛虱用RT-PCR和dot-ELISA方法分析帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并以其建立室內(nèi)種群，以后每代隨機抽取群體中10%的褐飛虱用RT-PCR和dot-ELISA方法確定其確實不帶毒，即獲得不帶RRSV的褐飛虱；
I) dot-ELISA檢測揭飛風(fēng)體是否帶毒
單頭褐飛風(fēng)放入I. 5 mL的eppendorf的離心管中，并加入100 u L PBS (0. 01mol/L, PH7. 4)，用牙簽搗爛褐飛虱后、5000 rpm離心3 min，取3 U L上清點到NC膜上，膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測水稻中RRSV方法相同，不同的只是二抗為適度稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，顯色底物是HRP的顯色底物，即TMB顯色底物。同時設(shè)非帶毒和帶毒的褐飛虱作為陰性和陽性對照。檢測結(jié)果表明褐飛虱沒有攜帶RRSV。2) RT-PCR方法檢測褐飛虱是否帶毒
參照Trizol試劑說明書提取單頭褐飛虱的總RNA，根據(jù)上述水稻齒葉矮縮病毒的衣殼蛋白基因(CP基因)序列設(shè)計的特異性引物，采用上述檢測水稻樣品一樣的RT-PCR方法檢測褐飛虱是否帶毒，檢測結(jié)果進(jìn)一步證明褐飛虱為非帶毒的蟲子。3、褐飛虱從感染RRSV的水稻植株中獲毒 I)褐飛風(fēng)從冷凍保存感病水稻病株中獲毒
用濾紙保濕下20-300只f 2齡褐飛虱若蟲饑餓2-3小時。-10 _80°C冰箱中取出冷凍保存的感染RRSV的水稻病樣1-3株，放置溫室(IO0C -350C )或4°C冰箱中解凍，1-3小時后移入以尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器或燒杯中，然后放入饑餓2-3小時的20-300只 r2齡褐飛虱若蟲，這樣就有較好的空氣流動性確保褐飛虱存活，同時又可防止褐飛虱逃出容器。飼毒1-2天后將存活的褐飛虱移至養(yǎng)蟲的健康水稻苗，并記錄存活的褐飛虱數(shù)量。飼毒褐飛虱在健康水稻苗上經(jīng)過病毒循回期，約10-15天后，記錄存活的褐飛虱數(shù)量。對一部分褐飛虱進(jìn)行上述RT-PCR和dot-ELISA方法進(jìn)行帶毒率分析。結(jié)果如圖4、5所示，表明飼喂凍存保存的病株的褐飛虱的存活率為80%，帶毒率為30%。2)褐飛虱從種植于溫室或植物生長箱內(nèi)的水稻病株上獲毒
用濾紙保濕下20-300只f 2齡褐飛虱若蟲饑餓2-3小時。經(jīng)上述檢測鑒定攜帶RRSV 的水稻病株，用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制植物生長箱中培養(yǎng)， 良好的空氣流動確保植株與褐飛虱的存活，又避免褐飛虱的逃逸。每個塑料容器放1-5株病株植物。每個裝置中放入饑餓3小時后的20-300頭1-2齡無毒的褐飛虱若蟲。培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為60 %-75 %，光周期為16L :8D。飼毒2_10天后將存活的褐飛虱移入新鮮健康水稻苗上飼養(yǎng)直至渡過病毒的循回期，約7-12天，并記錄存活的褐飛虱數(shù)量。并通過上述RT-PCR、dot-ELISA等方法檢測驗證。接種后對移出的130褐飛虱進(jìn)行上述RT-PCR 和dot-ELISA檢測，其帶毒率為50%。這表明褐飛虱從培養(yǎng)的水稻病株上獲得RRSV的幾率較聞。
4、獲毒褐飛虱的應(yīng)用
I)獲毒褐飛虱用于篩選抗RRSV的單抗
單頭帶毒褐飛風(fēng)放入I. 5 mL的eppendorf的離心管中，并加入100 u L PBS (0. Olmol/ L，pH7. 4)，用牙簽搗爛褐飛虱后、5000 rpm離心3 min，取3 上清點到NC上，室溫 (IO0C -350C )干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的
0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入不同的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入適度稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min; PBST洗膜4 5次，每次3 min;用 TMB底物顯色。若出現(xiàn)藍(lán)色斑點，則為陽性，表明此細(xì)胞株能產(chǎn)生抗RRSV的抗體。檢測結(jié)果如圖5所示。2)獲毒褐飛虱的傳毒及水稻抗性鑒定
將上述從冷凍保存的病株或活的感病水稻植株上獲毒的褐飛虱移入待鑒定的水稻苗 (I. 5-3葉期)在溫室或植物生長箱飼養(yǎng)2-7天，培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為60 %_75 %，光周期為16L :8D。采用單苗5頭蟲方法接種I. 5-3葉期的待鑒定水稻品種，每個品種選取100水稻苗鑒定，2-7天后移出全部褐飛虱，再將稻苗移栽至溫室或植物生長箱內(nèi)生長。7 天以后開始調(diào)查，每天調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查40天。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照水稻齒葉矮縮病的典型癥狀濃綠矮縮、葉片扭曲呈鋸齒狀缺刻、在葉背和葉鞘生有細(xì)長脈腫。進(jìn)一步用上述RT-PCR 和dot-ELISA方法檢測接種后的水稻，觀察到有典型癥狀的水稻均能擴增到目的條帶，無發(fā)病癥狀的水稻均不能擴增到目的條帶，結(jié)果如圖6所示。這表明褐飛虱從冷凍保存或和活的感病植株上獲得RRSV后能接種到健康水稻上。同理，可根據(jù)飼喂接毒水稻的病毒癥狀及其RT-PCR和dot-ELISA檢測結(jié)果判斷水稻品種的抗性，即建立了 RRSV水稻抗性品種的鑒定方法，為抗RRSV的水稻資源的發(fā)掘、抗性品種鑒定和品種選育提供技術(shù)手段。
權(quán)利要求
1.一種攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法，其特征在于它的步驟如下1)褐飛虱的獲得從非水稻齒葉矮縮病毒發(fā)生地區(qū)的水稻田間捕獲褐飛虱后，在室內(nèi)用非抗蟲水稻品種的無毒秧苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為26 30°C，相對濕度為60 % 75 %，光周期為16L 8D ;待褐飛虱成蟲交配后單頭蟲單獨產(chǎn)卵，隨機抽取種群中10%的褐飛虱用RT-PCR和dot-ELISA 方法分析帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并建立室內(nèi)種群，以后每代隨機抽取種群中10% 的褐飛虱用RT-PCR、dot-ELISA方法確定褐飛虱不帶水稻齒葉矮縮病毒，即獲得不攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng);2)褐飛虱的獲毒褐飛風(fēng)從冷凍保存感病水稻病株中獲毒用濾紙保濕下I 2齡褐飛虱若蟲饑餓2 3小時；-10 _80°C冰箱中取出冷凍保存的感染水稻齒葉矮縮病毒的水稻病株I 3株,放置溫室或4°C冰箱中解凍I 3小時后移入以尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器或燒杯中，然后放入已饑餓2 3小時的20-300只 I 2齡褐飛虱若蟲，飼毒I 2天后將存活的褐飛虱移至養(yǎng)蟲的健康水稻苗，飼毒褐飛虱在健康水稻苗上經(jīng)過約10 15天病毒循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA方法檢測褐飛虱體內(nèi)的水稻齒葉矮縮病毒，分析其帶毒率，獲得攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng);或者，褐飛虱從種植于溫室或植物生長箱內(nèi)的水稻病株上獲毒用濾紙保濕下I 2齡褐飛虱若蟲饑餓2 3小時；攜帶RRSV的水稻病株I 5株用尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器封閉在溫濕度控制植物生長箱中培養(yǎng)，每個裝置中放入饑餓3小時后的20 300頭I 2齡無毒的褐飛虱若蟲，飼毒2 10天后將存活的褐飛虱移入新鮮健康水稻苗上飼養(yǎng)7 12天直至渡過病毒的循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA 方法檢測褐飛虱體內(nèi)的水稻齒葉矮縮病毒，分析其帶毒率，獲得攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛風(fēng)。
2.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的應(yīng)用，其特征在于所述的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種的抗性， 篩選水稻的抗病品種，為抗水稻齒葉矮縮病毒抗病育種服務(wù)。
3.如權(quán)利要求2所述的一種攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法，其特征在于所述的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于飼喂健康水稻苗來鑒定水稻品種抗性的方法為將攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱移入待鑒定的種植于溫室或植物生長箱的I. 5-3葉期水稻苗，采用單苗5頭蟲方法接種待鑒定水稻品種，飼養(yǎng)2-7天后移出全部褐飛虱，將稻苗移栽至溫室或植物生長箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為26-30°C，相對濕度為65 %-75 %，光周期為16L 8D ;7天以后開始觀察病毒癥狀，連續(xù)調(diào)查30-40天；用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測水稻； 根據(jù)飼喂接毒水稻的病毒癥狀及其RT-PCR和dot-ELISA檢測結(jié)果判斷水稻的抗性。
4.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的應(yīng)用，其特征在于所述的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于篩選抗水稻齒葉矮縮病毒特異、靈敏的單抗，從而建立以單抗為核心的檢測水稻及褐飛虱體內(nèi)水稻齒葉矮縮病毒的免疫學(xué)方法。
5.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的應(yīng)用，其特征在于所述的攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱用于研究水稻齒葉矮縮病毒與介體昆蟲之間的互作及其傳毒機理提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
全文摘要
本發(fā)明公開了攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法及其應(yīng)用。利用感染RRSV的水稻活體植株或者冷凍保存的水稻病樣飼喂褐飛虱，使其獲得水稻齒葉矮縮病毒，再將褐飛虱移至不帶毒的健康水稻葉片上飼喂，直至渡過病毒的循回期而獲毒。本發(fā)明獲得的帶毒褐飛虱可用于篩選抗RRSV的高靈敏度、高特異性的單抗，從而為該病毒病的預(yù)警預(yù)報，科學(xué)防控該病毒病提供物質(zhì)和技術(shù)手段。同時，本發(fā)明專利獲得的攜帶RRSV的褐飛虱可進(jìn)行水稻接種實驗鑒定水稻品種的抗性，篩選抗病品種，并為抗病育種服務(wù)。另外，本發(fā)明獲得的攜帶RRSV褐飛虱為RRSV與褐飛虱介體間的互作及其傳毒機理等的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號A01K67/033GK102578050SQ20121005258
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者倪躍群, 劉歡, 吳建祥, 周文武, 周雪平, 徐毅, 祝增榮, 饒黎霞 申請人:浙江大學(xué)