專利名稱：水稻抗逆相關(guān)基因OsPP2C44及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與水稻抗逆性相關(guān)的基因，具體地說，涉及一種新的水稻抗逆相關(guān)基因及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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干旱缺水是造成全球糧食減產(chǎn)的重要因素之一。干旱脅迫嚴(yán)重影響植物生長和發(fā)育，甚至造成植物死亡。水稻是重要的糧食作物之一，水稻需水占農(nóng)業(yè)用水的65%，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)研究植物抗旱的生理生化反應(yīng)，克隆重要的抗旱基因，進(jìn)而轉(zhuǎn)入植物中培育抗逆性增強(qiáng)的作物新品種特別是培育節(jié)水抗旱的水稻新品種是緩解全球干旱缺水、人口增長帶來的糧食生產(chǎn)壓力的有效途徑。植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列的適應(yīng)機(jī)制來應(yīng)對干旱等逆境脅迫。干旱脅迫下，植物一方面通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉來減少水分蒸騰，同時通過促進(jìn)根系生長來增加水分吸收，從而有效避免干旱脅迫對植物的傷害。同時，植物可通過合成有機(jī)大分子等滲透調(diào)節(jié)和保護(hù)的分子以及抗氧化酶類來增強(qiáng)自身對逆境的耐受能力。植物生理學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)的研究使得植物的抗逆機(jī)制逐漸明晰，一些重要的抗逆基因被克隆。與抗逆相關(guān)的基因根據(jù)功能不同基本分為兩類一類是編碼滲透調(diào)節(jié)蛋白、抗氧化酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等功能蛋白的基因；另一類是編碼轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等起調(diào)節(jié)作用蛋白的基因。蛋白的磷酸化和去磷酸化在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色，其中蛋白去磷酸化的過程由蛋白磷酸酶負(fù)責(zé)。蛋白磷酸酶根據(jù)底物蛋白氨基酸殘基的種類分為蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶，絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶依據(jù)它們不同的底物特異性及對特定抑制劑的不同敏感性來劃分的主要分PPl和PP2兩類。PP2又按照亞基的結(jié)構(gòu)、活力及對二價陽離子的依賴而被進(jìn)一步分為3個亞類PP2A、PP2B、PP2C。PP2C是一種單體蛋白磷酸酶，活力依賴Mg2+。植物中PP2C蛋白磷酸酶廣泛參與植物抗病信號傳導(dǎo)、植物創(chuàng)傷、抗病反應(yīng)及ABA調(diào)控的抗逆信號途徑等生長發(fā)育及抵抗生物與非生物脅迫反應(yīng)。植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多種PP2C類磷酸酶均參與ABA通路的信號傳導(dǎo)，擬南芥中的兩種PP2C類磷酸酶-ABI1/2便是直接從對ABA不敏感型的突變植株的基因中克隆到的。它們體現(xiàn)出的蛋白憐酸酶活力受:ABA的影響而升聞，在它們聞表達(dá)或活力提聞以后又會使植株對ABA的敏感性明顯降低。本發(fā)明中的 基因克隆自水稻第4染色體的抗旱QTL區(qū)段，在干旱、鹽、夕卜源ABA處理下的基因表達(dá)譜分析表明，該基因可響應(yīng)逆境脅迫。超表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因水稻抵抗?jié)B透脅迫的能力顯著增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的水稻抗逆相關(guān)基因，及其編碼的蛋白磷酸酶，具有典型的PP2C催化結(jié)構(gòu)域，屬PP2C類型，可響應(yīng)逆境脅迫，超量表達(dá)后可提高轉(zhuǎn)基因植物的抗?jié)B透脅迫能力。本發(fā)明的再一目的是提供水稻抗逆相關(guān)基因0sPP2C44在提高水稻抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明從水稻中分離克隆的一段完整編碼區(qū)段的DNA片段，對這個基因編碼的蛋白序列進(jìn)行分析表明，它編碼蛋白磷酸酶，具有典型的PP2C催化結(jié)構(gòu)域，屬于PP2C亞家族，因此命名為0sPP2C44。本發(fā)明分離和應(yīng)用一種包含0sPP2C44基因的DNA片段，該基因能響應(yīng)冷、鹽、外源ABA等脅迫處理，發(fā)生表達(dá)變化。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，提供一種與水稻抗逆性相關(guān)的 基因，其中，所述基因的序列如下列之一SEQ ID NO: I所示的DNA序列；與SEQ ID NO: I至少90%同源的DNA序列；功能相當(dāng)于SEQ ID NO: I所示序列的亞片段。 本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案是，所述的0sPP2C44基因的序列為如下列之一
SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列；或與SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列相似性達(dá)90%的DNA序列。本發(fā)明還提供一種包含0sPP2C44基因編碼的蛋白，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者為所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性變異體、或等位變異體、或天然突變體、或誘導(dǎo)突變體。本發(fā)明還提供一種包含 基因編碼的重組載體，其中，構(gòu)建所述重組載體所選用的載體為Ti質(zhì)?；蛑参锊《据d體。本發(fā)明還提供一種包含0sPP2C44基因的一種植物轉(zhuǎn)化體，其中，所述植物轉(zhuǎn)化體的宿主為水稻。本發(fā)明另一優(yōu)先方案是提供一種提高植物抗逆性中的應(yīng)用，其中，所述抗逆性中應(yīng)用的植物包含權(quán)利要求I或2所述0SPP2C44的基因，所述植物為水稻。獲得上述采用已克隆的0sPP2C44基因?yàn)樘结?，從cDNA文庫和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。也可以采用PCR (polymerase chain reaction)技術(shù),從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的0sPP2C44基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到fls/^尤辦基因，將這一序列與任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體連接后轉(zhuǎn)化植物，可獲得對逆境響應(yīng)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明提供的載體攜帶本發(fā)明 基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞。本發(fā)明0sPP2C44基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)的多種植物。本發(fā)明通過對水稻基因分離克隆及其對逆境脅迫的響應(yīng)，提供了一種水稻DNA片斷包含一個966bp的編碼基因該基因含有蛋白磷酸酶基因家族典型的結(jié)構(gòu)域，為該基因家族PP2C類型成員。0sPP2C44基因受干旱、鹽及外源ABA誘導(dǎo)表達(dá)，與水稻抗逆性相關(guān)。本發(fā)明可以用于研究利用此基因遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物的分子方法。本發(fā)明的水稻基因?qū)δ婢钞a(chǎn)生明顯響應(yīng)，可應(yīng)用于在植物抗逆育種。


圖I為本發(fā)明利用ClustalW2軟件將0sPP2C44基因預(yù)測的蛋白序列與同源蛋白序列進(jìn)行比對的結(jié)果；
圖2為本發(fā)明的0sPP2C44基因在水稻不同組織中的表達(dá)水平；
圖3為本發(fā)明的0sPP2C44基因在苗期水稻受到冷、熱、鹽、PEG和外源ABA處理時的表達(dá)水平；
圖4為本發(fā)明的0sPP2C44基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻植株的Southern blot檢測；
圖5為本發(fā)明的基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻植株的表達(dá)水平檢測；
圖6為本發(fā)明基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻抵抗甘露醇模擬滲透脅
迫比較分析。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I水稻0sPP2C44基因的克隆 I.幼苗培育
將水稻置于30°C萌發(fā)48小時，然后播種于溫室中，待水稻葉片為3-5片時，準(zhǔn)備抽取DNA 或 RNA。2. RNA 的分離
RNA的提取所取樣品在研缽中用液氮冷凍后研磨成粉狀，加入盛有ImL TRNzol-A+試劑(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振蕩后，室溫放置5min，之后加O. 2mL氯仿，劇烈震蕩15s后，室溫放置3min ;后于4°C，12000rpm離心IOmin后，上清液移至新的2mLEP管中，加等體積異丙醇沉淀RNA，加IOOPL RNase-free ddH20溶解。電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。3.逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA
(O反轉(zhuǎn)錄之前需用DNaseI消化所提取RNA樣品，反應(yīng)體系如下
試劑名稱j使用量(μι)
RNA5—
10 X DNaseIBuffer I
DNaseI (5υ/μΡ O. 2—
DEPCH2Q|llptol(^L _
37°C反應(yīng) 15min 后，加入 O. 25μ O. IM EDTA (保證終濃度 >2mM)，70°C溫育 10 min 終
止反應(yīng)，短暫離心后置于冰上備用。(2)第一鏈cDNA的合成參照Promega反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)A3500操作手冊，具體步驟如下
DNaseI消化過的樣品中依次加入下列各試劑配制20μ 的反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種與水稻抗逆性相關(guān)的6(5/ ' 基因，其特征在于，所述6(5/ ' 基因的序列如下列之一 SEQ ID NO: I所示的DNA序列； 與SEQ ID NO: I至少90%同源的DNA序列； 功能相當(dāng)于SEQ ID NO: I所示序列的亞片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因，其特征在于，所述的基因的序列為如下列之一· SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列； 或與SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列相似性達(dá)90%的DNA序 列。
3.一種包含權(quán)利要求I或2所述基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或者為所述SEQ ID NO: 2序列的同源序列、或保守性變異體、或等位變異體、或天然突變體、或誘導(dǎo)突變體。
4.一種包含權(quán)利要求I或2所述基因的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，構(gòu)建所述重組載體所選用的載體為Ti質(zhì)?；蛑参锊《据d體。
6.一種包含權(quán)利要求I或2所述0sPP2C44基因的一種植物轉(zhuǎn)化體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體的宿主為水稻。
8.一種提高植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗逆性中應(yīng)用的植物包含權(quán)利要求I或2所述0sPP2C44的基因，所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種從水稻DNA片斷中分離克隆的與水稻抗逆性相關(guān)的OsPP2C44基因。該基因編碼的蛋白含有蛋白磷酸酶家族保守的催化結(jié)構(gòu)域，為該基因家族PP2C類型成員。OsPP2C44基因受高鹽、低溫、高溫以及ABA誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)OsPP2C44可提高水稻苗期抵抗?jié)B透脅迫的能力，與水稻抗逆性相關(guān)。本發(fā)明的水稻基因?qū)δ婢钞a(chǎn)生明顯響應(yīng)，可應(yīng)用于在植物抗逆育種，提高植物的抗逆性。
文檔編號A01H5/00GK102943084SQ20121049384
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者劉鴻艷, 徐凱, 陳守俊, 羅利軍 申請人:上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心