本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用愈傷組織繁殖香根草種苗的方法。

背景技術(shù)：
香根草(VetiveriazizanioidesL.)，又名培地茅、巖蘭草，是一種禾本科多年叢生的草本植物，原產(chǎn)于印度等國(guó)，現(xiàn)主要分布于東南亞、印度和非洲等(亞)熱帶地區(qū)，我國(guó)主要分布在廣東、云南等地。香根草極難結(jié)實(shí)或不結(jié)實(shí)，主要靠分蘗繁殖，即每年春季，上年留在田里的香根草根部會(huì)萌發(fā)新的分蘗，一般情況下，每兜香根草根部在春季可增生40株左右的分蘗。理論上講，每個(gè)分蘗都可以長(zhǎng)成獨(dú)立的具有6-10節(jié)的莖，實(shí)際上，只有較大分蘗(平均有15株分蘗/兜)形成的莖節(jié)數(shù)可達(dá)6-10節(jié)。香根草具有適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖快，根系發(fā)達(dá)，耐旱耐瘠等特性，在水土保持，改良生態(tài)環(huán)境、經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)利用中有重要的應(yīng)用，受到國(guó)內(nèi)外的廣泛重視并得到迅速的推廣。目前國(guó)內(nèi)對(duì)香根草的需求較大，種苗供不應(yīng)求，而導(dǎo)致種苗缺乏的主要原因是繁殖速度過(guò)慢。目前生產(chǎn)上香根草種苗繁殖方式有三種，一是通過(guò)分離香根草新生分蘗苗法獲得。該方法的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)簡(jiǎn)單，存在的主要問(wèn)題是種苗繁殖系數(shù)低，一般情況下1畝香根草種苗圃可以繁殖4-6畝種苗，限制了香根草的大規(guī)模開(kāi)發(fā)利用。二是直接利用香根草外植體(如葉鞘、莖段、蘗節(jié)等)，通過(guò)體細(xì)胞發(fā)育形成完整植株。第三種方法是應(yīng)用香根草愈傷組織再生新苗。其生產(chǎn)程序是，先選擇外植體→外植體消毒→外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織細(xì)胞形成→(或?qū)⒂鷤M織細(xì)胞繼代培養(yǎng))→將愈傷組織塊接種在生芽培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生芽→將芽接種在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根→成苗，形成一個(gè)完整的植株。后兩種方法的優(yōu)點(diǎn)是繁殖系數(shù)較低一種方法明顯增高，但是存在培養(yǎng)過(guò)程污染率不容易控制的問(wèn)題。污染的主要原因是誘導(dǎo)成苗過(guò)程需要轉(zhuǎn)接3次，每一次轉(zhuǎn)接都有可能引起污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用愈傷組織繁殖香根草種苗的方法，旨在解決現(xiàn)有的繁殖香根草種苗方法存在培養(yǎng)過(guò)程污染率不容易控制的問(wèn)題。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種利用愈傷組織繁殖香根草種苗的方法，所述利用愈傷組織繁殖香根草種苗的方法包括：配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分包括，1×MS營(yíng)養(yǎng)元素，30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、2mg/L6-BA、0.2mg/LIBA；培養(yǎng)基用5mol/L的氫氧化鈉調(diào)至pH＝5.5～6.5，高溫濕熱滅菌20～30分鐘，后冷卻至50℃時(shí)，分裝在無(wú)菌組配瓶?jī)?nèi)，自然冷卻凝固后備用；S102：選取外植體：從生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的香根草基部剪取具4個(gè)以上莖節(jié)的莖，去除葉、葉鞘和頂芽，在莖節(jié)上下1cm處用剪刀剪斷，留下帶掖芽的莖段作為外植體；組培苗培養(yǎng)：將接種的培養(yǎng)瓶密封瓶口，然后放置在25±1℃培養(yǎng)室內(nèi)先暗培養(yǎng)3天，然后在16/18光暗交替下繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第30天在掖芽基部切口處形成愈傷組織，第50天愈傷組織分化形成叢狀新芽，第70天在新芽周?chē)L(zhǎng)出新根，形成高3cm的叢狀香根草幼苗。進(jìn)一步，所述配制培養(yǎng)基后需要：選取外植體：從生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的香根草基部剪取具4個(gè)以上莖節(jié)的莖，去除葉、葉鞘和頂芽，在莖節(jié)上下1cm處用剪刀剪斷，留下帶掖芽的莖段作為外植體；消毒外植體：取所修剪后莖段，放入去污液中并浸泡2h，然后用流水清洗浸泡后的莖稈2h；接著在工作臺(tái)內(nèi)再依次分別用75％酒精、0.1％升汞和5％的多菌靈浸沒(méi)莖段消毒0.5、6和10分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗莖段4-6遍，于無(wú)菌濾紙上晾干后備用；接種外植體：取消毒晾干后的莖段，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌剪刀將掖芽基部0.1-0.3cm以上頂端部分剪去；用無(wú)菌解剖刀在莖節(jié)基部等距離縱切3個(gè)傷口，傷口深度0.1cm，傷口長(zhǎng)度均為0.3cm；用無(wú)菌鑷子將去除掖芽頂端且切傷后的莖段按自然生長(zhǎng)方向插入培養(yǎng)基中，扎入深度為莖節(jié)基部剛好接觸培養(yǎng)基上平面。進(jìn)一步，所述去污液為1％洗衣粉的蒸餾水。進(jìn)一步，所述組培苗培養(yǎng)后需要：配制幼苗移栽培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)基由花土、壤土和沙按照1：1：1的比例配制，營(yíng)養(yǎng)缽選用高度為25cm，缽底和缽口直徑不小于5cm，混勻的營(yíng)養(yǎng)土盛裝在營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)基用量為營(yíng)養(yǎng)缽高度的1/2，移栽前將裝有營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)缽放置在自來(lái)水內(nèi)，使?fàn)I養(yǎng)土飽和吸水，然后再將營(yíng)養(yǎng)缽自然控水5小時(shí)后備用；幼苗的分離與移栽：從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)取出叢狀香根草幼苗，去除連帶在幼苗上的培養(yǎng)基殘?jiān)?，用剪刀或鑷子輕輕將具有獨(dú)立根系的單個(gè)幼苗從叢狀香根草幼苗上分離出來(lái)，然后將單個(gè)幼苗移栽到裝有營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)；移栽苗的培養(yǎng)：剪取比營(yíng)養(yǎng)缽口徑稍大的透明薄塑料布?jí)K，并將其展開(kāi)輕輕覆蓋在移栽后的營(yíng)養(yǎng)缽口上；然后將覆蓋有塑料布的營(yíng)養(yǎng)缽放置培養(yǎng)室內(nèi)保濕培養(yǎng)7天，然后去掉塑料布繼續(xù)培養(yǎng)60天，幼苗即可長(zhǎng)至10-15cm大小，培養(yǎng)是條件是25±1℃、16/18光暗交替。本發(fā)明提供的利用愈傷組織繁殖香根草種苗的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于1)優(yōu)化了培養(yǎng)基成分，提高了莖節(jié)掖芽愈傷組織誘導(dǎo)效率(按最初接種外植體數(shù)量計(jì)，最高可達(dá)88.3％)；2)采用一次接種培養(yǎng)即可完成三個(gè)培養(yǎng)環(huán)節(jié)(愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化生芽和不定芽生根)，中間不需要進(jìn)行轉(zhuǎn)接，減少了雜菌污染的機(jī)會(huì)，提高了成苗率(按最初接種外植體數(shù)量計(jì)，成苗率超過(guò)70％，最高可達(dá)73.3％)。本發(fā)明提供的方法就是在整個(gè)香根草組培苗培養(yǎng)過(guò)程中只進(jìn)行一次接種，這樣就杜絕了愈傷組織細(xì)胞和不定芽被真菌細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)，減少培養(yǎng)過(guò)程中污染率，因?yàn)樘岣吡顺擅缏?。為進(jìn)一步證明這種效果，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基為本發(fā)明優(yōu)化的培養(yǎng)基(含1×MS營(yíng)養(yǎng)元素、7g/L瓊脂、2mg/L6-BA、0.2mg/LIBA、30g/L蔗糖)，香根草掖芽基部外植體的選擇和消毒處理措施同本發(fā)明一樣。實(shí)驗(yàn)處理措施有4個(gè)，分別是A：使用本發(fā)明的方法，用一個(gè)培養(yǎng)基，只接種一次，完成愈傷組織誘導(dǎo)、生芽、生根成苗；B：配置2個(gè)培養(yǎng)基，接種二次，第一次是將掖芽接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)至不定芽生成，第二次是將無(wú)菌不定芽轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上生根成苗；C：配置2個(gè)培養(yǎng)基，接種二次，第一次是將掖芽接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)至愈傷組織細(xì)胞生成，第二次是將無(wú)菌愈傷組織細(xì)胞接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根成苗；D：配置3個(gè)培養(yǎng)基，接種三次，即第一次是將掖芽外植體接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)之愈傷組織生成，第二次是將愈傷組織轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生芽，第三次是將不定芽轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根成苗。按照本發(fā)明的方法，每組培瓶這接種一個(gè)外植體(掖芽、愈傷組織塊、不定芽)，分別在第30、50、70天統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生無(wú)菌愈傷組織瓶數(shù)、分化形成無(wú)菌不定芽瓶數(shù)、分化出根的無(wú)菌苗瓶數(shù)和被污染瓶數(shù)，最后計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率、生芽率、成苗率和污染率。愈傷組織誘導(dǎo)率、生芽率、生根成苗率的計(jì)算同實(shí)驗(yàn)1，污染率＝被污染總瓶數(shù)/接種掖芽總數(shù)×100％。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)路線進(jìn)行培養(yǎng)，香根草掖芽誘導(dǎo)成苗率為73.3％，而方式B、C、D的成苗率分別為53.3％、48.3％和56.8％，顯著小于A，成苗率分別為A培養(yǎng)方式的70.％、65.9％和47.7％，而污染率則顯著上升，說(shuō)明減少轉(zhuǎn)接次數(shù)可以顯著降低污染的幾率，提高組培苗成苗率。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用愈傷組織繁殖香根草種苗的方法流程圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明的方法在誘導(dǎo)成苗過(guò)程中只利用一種培養(yǎng)基可完成愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化生芽和生根，中間不需要進(jìn)行轉(zhuǎn)接，因此減少了污染的幾率。同時(shí)本方法也優(yōu)化了培養(yǎng)基成分，提高了誘導(dǎo)效率。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的利用愈傷組織繁殖香根草種苗的方法包括以下步驟：S101：配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分包括，1×MS營(yíng)養(yǎng)元素，30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、2mg/L6-BA、0.2mg/LIBA；培養(yǎng)基用5mol/L的氫氧化鈉調(diào)至pH＝5.5～6.5，高溫濕熱滅菌20～30分鐘，后冷卻至50℃時(shí)，分裝在無(wú)菌組配瓶?jī)?nèi)，自然冷卻凝固后備用；S102：組培苗培養(yǎng)：將接種的培養(yǎng)瓶密封瓶口，然后放置在25±1℃培養(yǎng)室內(nèi)先暗培養(yǎng)3天，然后在16/18光暗交替下繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第30天左右在掖芽基部切口處形成愈傷組織，第50天左右愈傷組織分化形成叢狀新芽，第70天左右在新芽周?chē)L(zhǎng)出新根，形成高約3cm的叢狀香根草幼苗；S103：選取外植體：從生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的香根草基部剪取具4個(gè)以...