本發(fā)明屬于農業(yè)栽培中通過組織培養(yǎng)技術的植物再生領域，具體涉及一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法。

背景技術：

醉馬草為禾本科、芨芨草屬的多年生植物，是我國北方草原主要的烈性毒草之一， 廣泛分布在我國甘肅、新疆、內蒙古、青海等省區(qū)（史志誠，1997）。醉馬草具有抗高寒、耐干旱等優(yōu)勢，加之家畜對其多不食，因此其在退化草地群落種間競爭中具有較大的優(yōu)勢，面積不斷擴大，特別是在干旱、退化的草地中蔓延日益嚴重，某些?。▍^(qū)）醉馬草已成為優(yōu)勢種群（李學森，1996）。

組織培養(yǎng)是指在無菌條件下利用人工培養(yǎng)基對植物組織進行培養(yǎng)，是生物工程研究的基礎，也是進行遺傳轉化和植物改良研究的基本環(huán)節(jié)。組織培養(yǎng)技術既不受季節(jié)限制、也不受地理位置限制，且遺傳背景一致、生長周期短、成本低。醉馬草作為一種頗具開發(fā)價值的禾草，有較強的抗逆性，自生繁衍能力強，適應性廣等特點，由于醉馬草根系發(fā)達、枝葉茂盛、具有極強的生命力、繁殖力、耐旱耐寒力，可以用作荒漠沙化土地等非放牧地區(qū)的防風固沙和水土保持植物，在干旱半干旱的惡劣環(huán)境條件下，醉馬草在草地群落中具有明顯的生長優(yōu)勢。目前，以醉馬草成熟胚為外植體進行組織培養(yǎng)的研究還鮮有報道，因此建立以醉馬草成熟胚為外植體的組織培養(yǎng)再生體系很有必要，同時也為今后的轉基因研究奠定了基礎。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法；通過醉馬草成熟胚為外植體，構建愈傷組織誘導、植株再生獲得再生體系，為進行遺傳轉化和性狀改良提供重要的基礎性材料。

本發(fā)明提供一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法，步驟如下：

（1）選擇醉馬草種子并消毒；

（2）誘導培養(yǎng)基、分化增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的篩選：

誘導培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基+0.1-0.5 mg·L^-1 6-BA +1.0-3.0 mg·L^-1 2,4-D；

分化增殖培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基+0.5-3.0mg/L 6-BA + 0.1-0.3mg/L NAA，

生根培養(yǎng)基：1/2基礎培養(yǎng)基+0.1-0.4 mg/L NAA；

所述基礎培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+蔗糖30g·L^-1+瓊脂10g·L^-1；

（3）成熟胚的處理和誘導分化：取步驟（1）中消毒的醉馬草種子，置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼代幾次后轉入分化和增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，繼代幾次后轉入生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待分化苗的根長4-6cm時，將瓶苗移出，閉瓶煉苗，2d后注入自來水，開瓶煉苗3d，然后洗凈根部，滅菌，用基質培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。

作為優(yōu)選，所述醉馬草為夏河醉馬草、天祝醉馬草或新疆醉馬草。

作為優(yōu)選，當醉馬草為夏河醉馬草時，

愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+0.3 mg·L^-1 6-BA +3.0 mg·L^-1 2,4-D；

分化增殖培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；

生根培養(yǎng)基為：1/2基礎培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA。

作為優(yōu)選，當醉馬草為天祝醉馬草時，

愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+0.5 mg·L^-1 6-BA+3.0 mg·L^-1 2,4-D；

增殖培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+3.0mg/L6-BA + 0.1mg/L NAA；

生根培養(yǎng)基為：1/2基礎培養(yǎng)基+0.2 mg/L NAA。

作為優(yōu)選，當醉馬草為新疆醉馬草時，

愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+ 0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2,4-D；

增殖培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；

生根培養(yǎng)基為：1/2基礎培養(yǎng)基+0.4 mg/L NAA。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：于恒溫25±2℃條件下黑暗培養(yǎng)30d。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述分化增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培養(yǎng)溫度為25℃。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：在 25±2℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間16h·d^-1條件下培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果如下：

（1）本發(fā)明公開了一種醉馬草成熟胚愈傷組織誘導培養(yǎng)及再生體系的構建方法，以采集夏河、新疆和天祝的醉馬草成熟胚為外植體，通過不同生長調節(jié)物質對愈傷組織的誘導、分化、生根等步驟的影響，進行各種培養(yǎng)基的篩選，獲得以下最佳培養(yǎng)基以及最佳培養(yǎng)條件，提供了一種有效的適宜于不同生態(tài)型的醉馬草組織培養(yǎng)方法。最佳培養(yǎng)基如下：

基礎培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30g·L^-1和瓊脂10g·L^-1；

A、出愈率較高的誘導培養(yǎng)基分別為：1）夏河醉馬草：基礎培養(yǎng)基+0.3 mg·L^-1 6-BA +3.0 mg·L^-1 2,4-D，誘導率為93%；（2）天祝醉馬草：基礎培養(yǎng)基+0.5 mg·L^-1 6-BA+3.0 mg·L^-1 2,4-D，誘導率為96%；(3)新疆醉馬草：基礎培養(yǎng)基+ 0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2,4-D誘導率為95%。

B、最佳分化和不定芽增殖培養(yǎng)基為 ：（1）夏河醉馬草：基礎培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率90%；（2）天祝醉馬草：基礎培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA，增殖率83%； (3)新疆醉馬草 基礎培養(yǎng)基+1.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率88%。

C、最佳生根成苗培養(yǎng)基為：（1）夏河醉馬草：1/2基礎培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA；（2）天祝醉馬草：1/2基礎培養(yǎng)基+0.2 mg/L NAA；(3)新疆醉馬草：1/2基礎培養(yǎng)基+0.4 mg/L NAA，生根率均達100%。

（2）本發(fā)明選用醉馬草成熟胚為外植體，進行組織再生培養(yǎng)，不受取材材料時空限制。本發(fā)明為醉馬草愈傷組織誘導的組培方法，操作簡單，成本廉價；建立的醉馬草成熟胚培養(yǎng)植株再生方法體系，為進行遺傳轉化和性狀改良提供重要的基礎性資料。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為夏河醉馬草成熟胚誘導愈傷組織；

圖2為夏河醉馬草愈傷組織分化綠苗；

圖3為夏河醉馬草生根的幼苗；

圖4為夏河醉馬草移栽后的再生植株。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

本發(fā)明的方法具體步驟如下：

（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的醉馬草成熟種子，去除外稃后在流水下沖洗30分鐘，然后用75%酒精處理5min，無菌水沖洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水沖洗3-5次，將種子置于無菌濾紙，直至種子水分吸干后待用；所述的醉馬草種子指的是：采集于夏河、新疆和天祝的醉馬草種子。

（2）誘導和分化增殖培養(yǎng)基篩選：基礎培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30g·L^-1和瓊脂10g·L^-1；

誘導培養(yǎng)基、分化增殖培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基附加不同處理激素。

誘導培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基的基礎上添加6-BA和2,4-D。設置6-BA濃度為0.1mg·L^-1、0.3mg·L^-1、0.5mg·L^-1；2,4-D的濃度為1.0mg·L^-1、2.0mg·L^-1、3.0mg·L^-1；

分化和增殖培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基的基礎上添加6-BA和NAA。設置6-BA濃度為0.5mg·L^-1、1.0mg·L^-1、1.5mg·L^-1、2.0mg·L^-1、2.5mg·L^-1、3.0mg·L^-1；NAA的濃度為0.1mg·L^-1、0.2mg·L^-1、0.3mg·L^-1；

生根培養(yǎng)基是在1/2 基礎培養(yǎng)基的基礎上添加NAA。設置1/2 MS培養(yǎng)基添加NAA濃度為0.1mg·L^-1、0.2mg·L^-1、0.3mg·L^-1、0.4mg·L^-1。以上培養(yǎng)基pH均調至5.8～6.0，在121℃下高壓濕熱滅菌20min；

（3）成熟胚的處理和誘導分化：本步驟對各部分的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化選擇，在以下培養(yǎng)條件時能夠取得最佳的培養(yǎng)效果。具體培養(yǎng)方法如下：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置于含有不同濃度的誘導培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱(25±2)℃條件下黑暗培養(yǎng)30d，期間將意外染菌重復除去，統(tǒng)計出愈率和生長狀況。并將愈傷組織轉入最優(yōu)的誘導培養(yǎng)基進行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次后轉入含有不同濃度的分化和增殖培養(yǎng)基進行光照培養(yǎng)，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培養(yǎng)溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d后統(tǒng)計愈傷組織分化率及出苗率；

（4）待分化苗長至2-3cm時，將最優(yōu)分化率和出苗率的分化苗轉入含有不同濃度的NAA生根培養(yǎng)基，在 (25±2)℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間16h·d^-1條件下培養(yǎng)。待分化苗的根長5cm左右，將瓶苗移出培養(yǎng)室，自然光下閉瓶煉苗，2d后注入自來水，自然光下開瓶煉苗，3d后統(tǒng)計生根率。洗凈根部后，移入高壓蒸汽滅菌后基質（珍珠巖：蛭石：營養(yǎng)土（杭州瑞波園藝資材部）=2:3:1）培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。

經(jīng)試驗，在上述選擇的培養(yǎng)基配方范圍內，均有較好的誘導、分化或生根的效果，采用上述不同的培養(yǎng)基，對夏河醉馬草的誘導率在82%-93%之間，增殖率在80%-90%之間，生根率在95%-100%之間；對天祝醉馬草的誘導率在86%-96%之間，增殖率在76%-83%之間，生根率在94%-100%之間；對新疆醉馬草的誘導率在90%-95%之間，增殖率在80%-88%之間，生根率在95%-100%之間。

其中，最優(yōu)培養(yǎng)基如下：

A、出愈率較高的誘導培養(yǎng)基分別為：1）夏河醉馬草：基礎培養(yǎng)基+0.3 mg·L^-1 6-BA +3.0 mg·L^-1 2,4-D，誘導率為93%；（2）天祝醉馬草：基礎培養(yǎng)基+0.5 mg·L^-1 6-BA+3.0 mg·L^-1 2,4-D，誘導率為96%；(3)新疆醉馬草：基礎培養(yǎng)基+ 0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2,4-D誘導率為95%。

B、最佳分化和不定芽增殖培養(yǎng)基為 ：（1）夏河醉馬草：基礎培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率90%；（2）天祝醉馬草：基礎培養(yǎng)基+3.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA，增殖率83%； (3)新疆醉馬草 基礎培養(yǎng)基+1.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率88%。

C、最佳生根成苗培養(yǎng)基為：（1）夏河醉馬草：1/2基礎培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA；（2）天祝醉馬草：1/2基礎培養(yǎng)基+0.2 mg/L NAA；(3)新疆醉馬草：1/2基礎培養(yǎng)基+0.4 mg/L NAA，生根率均達100%。

實施例1

本發(fā)明的方法具體步驟如下：

（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的醉馬草成熟種子，去除外稃后在流水下沖洗30分鐘，然后用45%酒精處理5min，無菌水沖洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水沖洗3-5次，將種子置于無菌濾紙，直至種子水分吸干后待用；所述的醉馬草種子指的是：采集于夏河的野生醉馬草種子。

（2）誘導培養(yǎng)基、分化增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的配方如下：

基礎培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30 g·L^-1和瓊脂10 g·L^-1；

誘導培養(yǎng)基和分化增殖培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基附加不同處理激素。

愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+0.3 mg·L^-1 6-BA +3.0 mg·L^-1 2,4-D；

分化增殖培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；

生根培養(yǎng)基為：1/2基礎培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA。

以上培養(yǎng)基pH均調至5.8～6.0，在121℃下高壓濕熱滅菌20min；

（3）成熟胚的處理和誘導分化：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置于誘導培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱(25±2)℃條件下黑暗培養(yǎng)30d，期間將意外染菌重復除去，然后進行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次后，測得誘導率為93%；轉入分化增殖培養(yǎng)基進行光照培養(yǎng)，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培養(yǎng)溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d后統(tǒng)計愈傷組織分化率及出苗率，增殖率為90%；

（4）待分化苗長至2-3cm時，轉入生根培養(yǎng)基，在 (25±2)℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間16h·d^-1條件下培養(yǎng)，生根率為100%。待分化苗的根長5cm左右，將瓶苗移出，閉瓶煉苗2d后注入自來水，開瓶煉苗3d后統(tǒng)計生根率。洗凈根部后，移入高壓蒸汽滅菌后基質（珍珠巖：蛭石：營養(yǎng)土=2:3:1）培養(yǎng)，獲得完整的再生植株。

實施例2

本實施例與實施例1的不同之處在于：

所選的醉馬草種子為采集于天祝的醉馬草種子。

基礎培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30 g·L^-1和瓊脂10 g·L^-1；

所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+0.5 mg·L^-1 6-BA+3.0 mg·L^-1 2,4-D，誘導率為96%；

所述的增殖培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+3.0mg/L6-BA + 0.1mg/L NAA，增殖率83%；

所述的生根培養(yǎng)基為：1/2基礎培養(yǎng)基+0.2 mg/L NAA，生根率為100%。

實施例3

本實施例與實施例1的不同之處在于：

所選的醉馬草種子為采集于新疆的醉馬草種子。

基礎培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加蔗糖30 g·L^-1和瓊脂10 g·L^-1；

所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+ 0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2,4-D，誘導率為95%；

所述的增殖培養(yǎng)基為：基礎培養(yǎng)基+1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率88%；

生根培養(yǎng)基為：1/2基礎培養(yǎng)基+0.4 mg/L NAA，生根率為100%。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。