本發(fā)明屬于組培技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用苜蓿松散型胚性愈傷組織在化學(xué)誘變劑作用下進行耐鹽突變體的一種育種方法。

背景技術(shù)：

苜蓿(Medicago)是世界上最重要、種植面積最廣泛的豆科牧草之一,由于其適應(yīng)性廣、產(chǎn)草量高,且富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),被譽為“牧草之王”。全世界的苜蓿種植面積約3.22×107hm2,美國、俄羅斯和阿根廷約占70％。中國雖是苜蓿種植大國,但從未列入農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主體。在美國苜蓿被視為第四大作物之一,僅次于玉米、大豆和小麥,種植面積約為8.5×106hm2。我國苜蓿種植面積約3.77×106hm2,居各類人工草地之首。近年來苜蓿的育種主要采用常規(guī)雜交育種法和人工選育的方法進行，隨著苜蓿種植面積的擴大，市場需求苜蓿具備越來越優(yōu)良性狀，而以上制種技術(shù)已經(jīng)不能解決現(xiàn)實問題，因此一些育種人員將目光轉(zhuǎn)移到一些現(xiàn)代育種新技術(shù)上來。近幾年通過基因轉(zhuǎn)化的方法，已經(jīng)培育出一些具備某種獨特形狀的苜蓿新品種，但由于環(huán)境釋放極為嚴(yán)格，短時間不能進入市場，因此還只停留在實驗室階段。而采用誘變育種技術(shù)也可以獲得一些特殊性狀，但因其效率低、遺傳穩(wěn)定性差，使得這一技術(shù)一直被擱置。最近幾年，有關(guān)采用體細胞誘變育種的報道越來越多，在苜蓿的育種研究中也得到了應(yīng)用。

國內(nèi)外有關(guān)植物耐鹽性的研究進展非常迅速，利用誘變技術(shù)與離體培養(yǎng)相結(jié)合進行農(nóng)作物耐鹽突變體篩選的工作做得較多，目前已在紅薯、番茄等農(nóng)作物上取得成功，而在苜蓿的耐鹽育種中很少見到報道。隨著土地資源的減少，一些鹽堿地區(qū)也需要種植苜蓿，因此苜蓿的耐鹽育種也逐漸收到了重視。采用誘變技術(shù)與體細胞離體再生技術(shù)相結(jié)合進行定向育種研究中，多采用愈傷組織作為誘變對象，而愈傷組織的形態(tài)及生理狀態(tài)各不相同，采用松散型胚性愈傷組織進行體細胞育種是效率最高的，其中原因主要表現(xiàn)為：一是誘變效率高。因為松散型胚性愈傷組織細胞間空隙較大，細胞之間影響較小，誘變劑的作用比較均勻，愈傷組織中每個細胞都受到相同的影響，不會因為內(nèi)外位置效應(yīng)而使得一些細胞作用力較大，一些影響力較??；二是松散型愈傷組織再生多為單細胞再生，因為細胞間聯(lián)系較小，胚性多發(fā)生于單個細胞，因此誘變產(chǎn)生的突變體一般都為純合體，可以直接用于育種研究，而避免嵌合體的遺傳不穩(wěn)定性；三是松散型胚性愈傷組織進行篩選時，由于細胞間聯(lián)系較少，每個細胞都受到相同篩選壓力的作用，從而可以精準(zhǔn)確定篩選壓力，從而提高誘變效率；四是松散型胚性愈傷組織分割容易，可以很容易控制愈傷組織團的大小，從而使得誘變操作變得簡單易行。五是采用松散型胚性愈傷組織還因為其為胚性特性，生理狀態(tài)活躍，容易誘導(dǎo)其遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，在誘變上具有相應(yīng)的優(yōu)勢。除了以上優(yōu)點，胚性愈傷組織還可以很容易獲得再生植株，一旦獲得突變的愈傷組織，隨后就可以獲得再生突變株，而不需要再進行愈傷組織再生的誘導(dǎo)，為育種節(jié)約了時間。因此本發(fā)明采用苜蓿的松散型胚性愈傷組織作為誘變對象可以獲得高效的誘變率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種利用松散型胚性愈傷組織誘變獲得耐鹽苜蓿新品種的方法。本發(fā)明為苜蓿體細胞誘變育種提供了一個高效、簡單易行的新途徑。此方法對于其它植物采用相同方法進行新品種選育也具有一定的參考價值。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種利用松散型胚性愈傷組織誘變獲得耐鹽苜蓿新品種的方法，步驟如下

⑴獲取苜蓿無菌苗；

⑵苜蓿松軟愈傷組織的誘導(dǎo)

采用苜蓿組培苗的下胚軸為外植體，在1/2MS+0.5-1.0mg/L2.4-D+20g/L蔗糖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)；培養(yǎng)條件為：溫度24-25℃，24h光照，光照強度為2000Lux，20-25d即可獲得理想的松軟型愈傷組織；

⑶苜蓿胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將步驟⑵中誘導(dǎo)出的松軟愈傷組織從外植體上分離下來，將其接種在事先配好的MS+1-2mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；培養(yǎng)條件為：溫度22-23℃，24h光照，光照強度為2500Lux；接種14-16d后繼代一次，所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不變；在繼代時盡量轉(zhuǎn)移質(zhì)地較硬的愈傷組織，大約經(jīng)過3-5次繼代后，愈傷組織質(zhì)地完全變硬，并在鏡檢時，愈傷組織基本由體積小、球形、細胞質(zhì)濃、細胞核大并含有多個分裂相的細胞構(gòu)成，此時說明已經(jīng)誘導(dǎo)出了苜蓿的胚性愈傷組織；

⑷苜蓿松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將步驟⑶中誘導(dǎo)出的苜蓿胚性愈傷組織分成直徑為3-5mm的小塊，然后將其接種到MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養(yǎng)基上；在20-22℃下培養(yǎng)，并在7-10d繼代一次，經(jīng)過5-8次繼代培養(yǎng)，愈傷組織在結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)明顯的變化，當(dāng)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地緊密，鏡檢為胚性愈傷組織時，此時即獲得了苜蓿松散型胚性愈傷組織；培養(yǎng)愈傷組織時采用24h光照，光照強度為2500Lux；

⑸誘變材料的制備

將誘導(dǎo)出的苜蓿松散型胚性愈傷組織在超凈臺中用解剖刀分成直徑大小為2-3mm的小塊，放到培養(yǎng)皿中備用；另將愈傷組織培養(yǎng)基(MS+1-0.5mg/LKT+1-0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖)在微波爐中融化，待其溫度降到50℃時，加入0.3％的EMS，然后分裝到100ml的三角瓶中，每瓶倒入20ml的培養(yǎng)基；待到培養(yǎng)基凝固后將愈傷組織接種到三角瓶中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為24℃,24h光照，光照強度為2000Lux；

⑹耐鹽細胞系的篩選

經(jīng)過20d的誘變處理后，將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0.8-1.0％NaCl濃度的培養(yǎng)基上進行耐鹽篩選，經(jīng)過20d的生長，從中篩選出生長正常并具備再生能力的愈傷組織；培養(yǎng)條件為23-24℃,24h光照，光照強度為3000Lux；

⑺耐鹽突變株的培養(yǎng)

將篩選出的耐鹽愈傷組織轉(zhuǎn)移到不含激素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再生植株；培養(yǎng)基中加入濃度為0.8-1.0％NaCl，經(jīng)過20-30d的生長，即可獲得生長健壯的耐鹽苜蓿再生植株；此過程的培養(yǎng)條件為24-25℃,24h光照，光照強度為3000Lux。

而且，所述步驟⑴獲取苜蓿無菌苗的方法如下：

選取飽滿的苜蓿種子，在70％酒精中浸泡30-40s，然后采用40％的安替福民水溶液進行表面消毒，消毒時間為10-15Min；將消毒處理后的種子用無菌水反復(fù)沖洗5次，每次洗10Min，然后將消過毒的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上進行無菌苗的培養(yǎng)，在25℃溫度下培養(yǎng)7d就可以獲得生長健壯的組培苗。

本申請的優(yōu)點和積極效果如下：

本發(fā)明主要內(nèi)容是先誘導(dǎo)出苜蓿松散型胚性愈傷組織，再以化學(xué)誘變劑對愈傷組織進行體外誘變，并將誘變后的苜蓿松散型胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有一定濃度鹽的培養(yǎng)基上進行定向篩選，從而獲得耐鹽的苜蓿突變愈傷組織，經(jīng)過再生培養(yǎng)，最終得到苜蓿耐鹽突變株。

附圖說明

圖1為苜蓿松散型胚性愈傷組織；

圖2為左側(cè)為苜蓿松散型愈傷組織，右側(cè)為耐鹽篩選出的苜蓿突變愈傷組織；

圖3為苜蓿耐鹽再生植株。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。

實例1

一種利用松散型胚性愈傷組織誘變獲得耐鹽苜蓿新品種的方法，步驟如下：本實施例利用上述方法篩選得到耐鹽“青睞”苜蓿的突變體

⑴苜蓿無菌苗的制備

選取飽滿的“青睞”苜蓿種子，在70％酒精中浸泡30s，然后采用40％的安替福民水溶液進行表面消毒，消毒時間為15Min。將消毒處理后的種子用無菌水反復(fù)沖洗5次，每次洗10Min，然后將消過毒的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上進行無菌苗的培養(yǎng)。在25℃溫度下培養(yǎng)7d就可以獲得生長健壯的組培苗。

⑵苜蓿松軟愈傷組織的誘導(dǎo)

采用“青睞”苜蓿組培苗的下胚軸為外植體，在1/2MS+1.0mg/L2.4-D+20g/L蔗糖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)。培養(yǎng)條件為：溫度24℃，24h光照，光照強度為2000Lux。20d即可獲得理想的松軟型愈傷組織。

⑶苜蓿胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將步驟⑵中誘導(dǎo)出的松軟愈傷組織從外植體上分離下來，小心地將其接種在事先配好的MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。培養(yǎng)條件為：溫度23℃，24h光照，光照強度為2500Lux。接種14d后繼代一次，所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不變。在繼代時盡量轉(zhuǎn)移質(zhì)地較硬的愈傷組織，大約經(jīng)過5次繼代后，愈傷組織質(zhì)地完全變硬，并在鏡檢時，愈傷組織基本由體積小、球形、細胞質(zhì)濃、細胞核大并含有多個分裂相的細胞構(gòu)成，此時說明已經(jīng)誘導(dǎo)出了苜蓿的胚性愈傷組織。

⑷苜蓿松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將步驟⑶誘導(dǎo)出的“青睞”苜蓿胚性愈傷組織分成直徑為5mm的小塊，然后將其接種到MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養(yǎng)基上。在22℃下培養(yǎng)，并在7d繼代一次，經(jīng)過8次繼代培養(yǎng)，愈傷組織在結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)明顯的變化，當(dāng)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地緊密，鏡檢為胚性愈傷組織時，此時即獲得了苜蓿松散型胚性愈傷組織。培養(yǎng)愈傷組織時采用24h光照，光照強度為2500Lux。

⑸誘變材料的制備

將誘導(dǎo)出的“青睞”苜蓿松散型胚性愈傷組織在超凈臺中用解剖刀分成直徑大小為3mm的小塊，放到培養(yǎng)皿中備用；另將愈傷組織培養(yǎng)基(MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖)在微波爐中融化，待其溫度降到50℃時，加入0.3％。的EMS，然后分裝到100ml的三角瓶中，每瓶倒入20ml的培養(yǎng)基。待到培養(yǎng)基凝固后將愈傷組織接種到三角瓶中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為24℃,24h光照，光照強度為2000Lux。

⑹耐鹽細胞系的篩選

經(jīng)過20d的誘變處理后，將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0.8％NaCl濃度的培養(yǎng)基上進行耐鹽篩選，經(jīng)過20d的生長，從中篩選出生長正常并具備再生能力的愈傷組織。培養(yǎng)條件為24℃,24h光照，光照強度為3000Lux。

⑺耐鹽突變株的培養(yǎng)

將篩選出的耐鹽愈傷組織轉(zhuǎn)移到不含激素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再生植株。培養(yǎng)基中加入濃度為0.8％NaCl，經(jīng)過30d的生長，即可獲得生長健壯的耐鹽“青睞”苜蓿再生植株。此過程的培養(yǎng)條件為25℃,24h光照，光照強度為3000Lux。