本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)相關(guān)基因grmzm2g020814的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米是全世界重要的糧食作物和能源作物，中國(guó)雖然是全世界玉米第二大生產(chǎn)國(guó)，但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和適應(yīng)性廣的優(yōu)質(zhì)玉米種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因育種是改良玉米種質(zhì)資源的重要途徑之一。幼胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織這一過(guò)程是整個(gè)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)效率的高低直接影響著轉(zhuǎn)基因成功率的高低。

研究和生產(chǎn)實(shí)踐表明，幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，在玉米自交系間存在顯著的基因型差異。大多數(shù)玉米骨干自交系胚性愈傷組織誘導(dǎo)率很低，有些甚至根本無(wú)法誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，因而不能直接作為外源基因的直接受體，只能以回交轉(zhuǎn)育的方法接受來(lái)源于轉(zhuǎn)基因自交系的目的基因。我國(guó)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因玉米品種培育技術(shù)體系須經(jīng)歷遺傳轉(zhuǎn)化、自交純化、回交轉(zhuǎn)育、雜交組配等幾個(gè)環(huán)節(jié)，僅轉(zhuǎn)化體中目標(biāo)基因回交轉(zhuǎn)育至骨干自交系則需3～5年時(shí)間，極大的延長(zhǎng)了玉米轉(zhuǎn)基因育種周期。鑒定控制玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)相關(guān)基因，闡明愈傷組織形成的分子機(jī)理，為培育更多高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率骨干自交系提供理論支持，為加快轉(zhuǎn)基因玉米育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)，另一方面也能促進(jìn)整個(gè)基因功能研究領(lǐng)域的快速發(fā)展。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(gwas)是一種在自然群體中基于連鎖不平衡(ld)鑒定表型性狀與遺傳標(biāo)記間關(guān)系的分析方法，是挖掘優(yōu)良等位基因的有效途徑。qtl定位則是利用連鎖群體基于遺傳標(biāo)記與qtl是否連鎖鑒定影響數(shù)量性狀的基因在染色體上所處的區(qū)段。qtl定位是針對(duì)全基因組的qtl掃描，而關(guān)聯(lián)分析可以對(duì)某個(gè)snp進(jìn)行更精確地定位。因此，關(guān)聯(lián)分析和qtl定位是互補(bǔ)的，可用關(guān)聯(lián)分析鑒定出顯著的snp位點(diǎn)，然后在連鎖群體中對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，兩種方法的整合將大大促進(jìn)復(fù)雜數(shù)量性狀的剖析。目前，玉米種質(zhì)改良和分子輔助育種中尚未有胚性愈傷組織誘導(dǎo)相關(guān)基因分子標(biāo)記開發(fā)與利用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)相關(guān)基因grmzm2g020814的snp(單核苷酸多態(tài)性)標(biāo)記，該snp標(biāo)記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著相關(guān)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供擴(kuò)增上述snp標(biāo)記的引物對(duì)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述snp標(biāo)記的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案如下：收集了中國(guó)、美國(guó)、墨西哥等地的溫帶、熱帶、亞熱帶玉米自交系301份，作為本研究的關(guān)聯(lián)群體，結(jié)合關(guān)聯(lián)群體自交系幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的表型數(shù)據(jù)和snp基因型數(shù)據(jù)，運(yùn)用tassel軟件的一般線性模型和混合線性模型兩種方法進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，并同時(shí)檢測(cè)到三個(gè)(基因組版本為maizeb73refgen_v3，位置分別為chr6:164781353bp、164781655bp、164781665bp)與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著關(guān)聯(lián)的snp位點(diǎn)。即：第一snp標(biāo)記，所述第一snp標(biāo)記位于玉米6號(hào)染色體164781353bp；第二snp標(biāo)記，所述第二snp標(biāo)記位于玉米6號(hào)染色體164781655bp；第三snp標(biāo)記，所述第三snp標(biāo)記位于玉米6號(hào)染色體164781665bp；

所述第一、第二、第三snp標(biāo)記，位于grmzm2g020814基因內(nèi)部，其等位基因均為t和c。在供試自交系中有t/t和c/c兩種純合基因型，第一個(gè)snp位點(diǎn)側(cè)翼序列如seqidno.1所示，第二、三個(gè)snp位點(diǎn)側(cè)翼序列如seqidno.2所示。

3個(gè)snp分子標(biāo)記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著相關(guān)，位點(diǎn)基因型為t/t的玉米自交系材料胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高于位點(diǎn)基因型為c/c的玉米自交系材料。

篩選到三個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的snp后，基于位點(diǎn)側(cè)翼序列，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了包含上述snp位點(diǎn)的檢測(cè)玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相關(guān)基因grmzm2g020814的特征性引物對(duì)。

引物對(duì)序列如下所示：第一引物對(duì)，所述第一引物對(duì)具有seqidno.3-4所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)所述第一snp標(biāo)記；

第二引物對(duì)，所述第二引物對(duì)具有seqidno.5-6所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)所述第二snp標(biāo)記以及第三snp標(biāo)記。

本發(fā)明還提供用于檢測(cè)所述snp分子標(biāo)記的試劑盒，包含上述引物對(duì)。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了上述snp分子標(biāo)記、引物對(duì)或試劑盒在鑒定玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力相關(guān)基因grmzm2g020814中的應(yīng)用；在篩選或鑒定玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力高的種質(zhì)資源中的應(yīng)用；在玉米種質(zhì)改良中的應(yīng)用。以及在提高玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率中的應(yīng)用。優(yōu)選地，snp分子標(biāo)記的位點(diǎn)基因型t/t為優(yōu)異基因型。本發(fā)明還提供了上述snp分子標(biāo)記在玉米轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種檢測(cè)玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力的方法，用上述3組引物對(duì)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增待檢測(cè)玉米材料的基因組dna，根據(jù)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，確定所述待測(cè)玉米的所述一組snp標(biāo)記中每一種的基因型；以及基于所述待測(cè)玉米的所述一組snp標(biāo)記中每一種的基因型，預(yù)測(cè)所述待測(cè)玉米的胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力。位點(diǎn)基因型為t/t的玉米材料，具有較高的胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力。

pcr程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；98℃變性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35個(gè)循環(huán)；68℃再延伸10min。

同時(shí)，發(fā)明人利用已構(gòu)建的玉米ibmsyn10dh(b73×mo17)群體的239個(gè)家系為連鎖群體，結(jié)合binmarker基因型數(shù)據(jù)和幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行qtl定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述snp分子標(biāo)記落在qtl定位的區(qū)段里，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述snp分子標(biāo)記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的重要性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證所開發(fā)標(biāo)記的有效性，發(fā)明人在關(guān)聯(lián)群體和連鎖群體里各挑選8份玉米自交系，測(cè)定其幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率(見圖1)，并以基因組dna為模板，利用上述引物和程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示三個(gè)snp位點(diǎn)成功在16份玉米自交系進(jìn)行基因分型(見圖2，圖3)。

本發(fā)明利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和qtl定位相結(jié)合的策略，揭示了該基因與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率之間的內(nèi)在聯(lián)系，發(fā)掘其中顯著的功能snp位點(diǎn)，并作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于玉米分子育種，對(duì)加快玉米轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程具有重要意義。

本發(fā)明的有益效果在于：結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析和qtl定位策略，快速精確地檢測(cè)到與特定性狀顯著關(guān)聯(lián)的snp或indel位點(diǎn)。玉米第6號(hào)染色體164781353、164781655和164781665bp位置的三個(gè)snp位點(diǎn)(maizeb73refgen_v3:chr6:164781353,164781655,164781665bp)與幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著相關(guān)，解釋表型變異分別為4.7％、5.2％、3.7％。三個(gè)snp位點(diǎn)能夠作為遺傳標(biāo)記，用于分子育種，提高玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為8份關(guān)聯(lián)群體自交系(027、141、155、208、333、336、339、356)和8份連鎖群體自交系(003、009、062、097、144、182、270、327)的幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。其中003、027、097、141、155、182、208、270表現(xiàn)出較高的誘導(dǎo)率，而009、062、144、327、333、336、339、356的誘導(dǎo)率幾乎為0。

圖2為上述8份關(guān)聯(lián)群體自交系和8份連鎖群體自交系pcr擴(kuò)增第一個(gè)snp位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果。其中方框標(biāo)識(shí)出t為高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系的位點(diǎn)基因型，而對(duì)應(yīng)低胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系的位點(diǎn)基因型為c。

圖3為上述8份關(guān)聯(lián)群體自交系和8份連鎖群體自交系pcr擴(kuò)增第二、三個(gè)snp位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果。其中方框標(biāo)識(shí)出t為高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系的位點(diǎn)基因型，而對(duì)應(yīng)低胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系的位點(diǎn)基因型為c。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果做進(jìn)一步的闡述，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均可以從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1.玉米基因grmzm2g020814與幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著相關(guān)的三個(gè)snp分子標(biāo)記的獲得。

獲得方法如下：

1)收集301份來(lái)自中國(guó)、美國(guó)、墨西哥的玉米自交系，構(gòu)建了作圖所用的關(guān)聯(lián)群體。該群體有著豐富的遺傳多樣性，包含121個(gè)溫帶玉米自交系和180個(gè)熱帶/亞熱帶玉米自交系。

2)關(guān)聯(lián)群體表型鑒定。分別于2015年和2016年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西雙版納基地和崇州基地對(duì)獲得的301份玉米自交系進(jìn)行田間種植，設(shè)置單行區(qū)，每行7穴，每穴2株，54000株/hm2，3次重復(fù)。以套袋自交種子用作幼胚培養(yǎng)的試驗(yàn)材料，授粉12-15天左右，每個(gè)dh系取自交果穗3個(gè)(即3次重復(fù))，每個(gè)果穗接種3個(gè)培養(yǎng)皿(即每個(gè)重復(fù)3個(gè)觀察值)，每個(gè)培養(yǎng)皿36個(gè)幼胚，幼胚大小控制在1.0-1.5cm。用含2mg/l2,4-d的n6誘導(dǎo)培養(yǎng)基，27℃暗培養(yǎng)30天后，調(diào)查胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率(出現(xiàn)胚性愈傷組織幼胚數(shù)占接種幼胚數(shù)的百分率)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)其中胚性愈傷組織誘導(dǎo)率在40％～80％的材料有3個(gè)，30％～40％的材料有3個(gè)，20％～30％的材料有12個(gè)，10％～20％的材料有25個(gè)，0％～10％的材料有69個(gè)，0％的材料有188個(gè)。方差分析表明，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率在不同自交系間差異達(dá)極顯著水平(表1)。

表1玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的方差分析

表1中**表示在0.01水平下顯著。

3)全基因組關(guān)聯(lián)分析。結(jié)合步驟2中玉米自交系幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的表型數(shù)據(jù)和高密度snp分子標(biāo)記，分別利用tessel5.0的一般線性模型(glm)和混合線性模型(mlm)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，等位基因頻率閾值設(shè)為0.05，在p<0.0001水平上，判定snp標(biāo)記與性狀關(guān)聯(lián)的顯著性。結(jié)果檢測(cè)到三個(gè)snp位點(diǎn)與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著相關(guān)，位置分別為chr6:164781353、164781655、164781665bp，三個(gè)位點(diǎn)位于grmzm2g020814基因內(nèi)部，等位基因均為t和c，在供試自交系中有t/t和c/c兩種純合基因型，第一snp標(biāo)記的等位基因的側(cè)翼序列如seqidno.1所示；所述第二snp標(biāo)記和第三snp標(biāo)記的等位基因的側(cè)翼序列如seqidno.2所示。glm模型的檢測(cè)p值分別為0.0234、0.0434、0.0446，可解釋的表型變異分別為3.91％、4.77％、3.08％，mlm模型的檢測(cè)p值分別為0.0554、0.0907、0.0985，可解釋的表型變異分別為4.65％、5.20％、3.71％。兩個(gè)不同模型的相互驗(yàn)證，避免了在0.01水平該位點(diǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果的假陽(yáng)性可能，進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果的真實(shí)可靠性。

4)qtl定位驗(yàn)證。利用已構(gòu)建的玉米ibmsyn10dh(b73×mo17)群體的239個(gè)家系為連鎖群體，田間種植和表型鑒定方法同步驟2，再結(jié)合6618個(gè)binmarker基因型數(shù)據(jù)，進(jìn)行qtl定位。在第6染色體上檢測(cè)到9個(gè)與高胚性愈傷誘導(dǎo)率有關(guān)qtl位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率在6.1074～9.6101％之間，位于區(qū)段chr06.1641.5～chr06.1653.5，對(duì)應(yīng)染色體上的物理位置是164.100mb～165.300mb(maizeb73refgen_v3)。步驟3中檢測(cè)到的三個(gè)snp分子標(biāo)記落在qtl定位的區(qū)段里，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述snp分子標(biāo)記與玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的重要性。

實(shí)施例2.本發(fā)明的snp標(biāo)記在玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率上的應(yīng)用試驗(yàn)。

在關(guān)聯(lián)群體和連鎖群體里各挑選8份玉米自交系，測(cè)定其幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率(見圖1)，并以基因組dna為模板，利用三個(gè)snp分子標(biāo)記位點(diǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異性引物，第一個(gè)snp引物序列如seqidno.3、4所示，第二個(gè)和第三個(gè)snp引物序列如seqidno.5、6所示，采用kodfxneo高保真聚合酶(東洋紡(上海)生物科技有限公司)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；98℃變性10s；59℃退火30s；68℃延伸6s；共35個(gè)循環(huán)；68℃再延伸10min。將特異性的目標(biāo)條帶用膠回收試劑盒(omegabio-tek)回收純化，連接平末端克隆載體peasy-bluntcloningvector(北京全式金生物技術(shù)有限公司)測(cè)序。利用snapgene2.3.2軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)(見圖2，圖3)。結(jié)果顯示三個(gè)snp位點(diǎn)成功在16份玉米自交系進(jìn)行基因分型，其中8份高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系在上述三個(gè)snp位點(diǎn)基因型全為t/t，8份低胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系位點(diǎn)基因型全為c/c。

本試驗(yàn)進(jìn)一步證明本發(fā)明中全基因組關(guān)聯(lián)分析和qtl定位檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，等位基因t被視作優(yōu)異/增效等位基因。本發(fā)明進(jìn)一步證實(shí)三個(gè)snp位點(diǎn)能夠作為有效的遺傳標(biāo)記應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇，提高玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力。

雖然，上文已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做出一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)相關(guān)基因grmzm2g020814的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>97

<212>dna

<213>zeamaysl.

<220>

<221>第一snp分子標(biāo)記位點(diǎn)側(cè)翼序列

<222>(51)..(51)

<223>n=t/c

<400>1

tatgctctggacacatcagtctgttaatcctgaatgggagcaaagacatgnccaagttca60

accaggaagttcctattatgcaggcactgcaagtgat97

<210>2

<211>102

<212>dna

<213>zeamaysl.

<220>

<221>第二和第三snp分子標(biāo)記位點(diǎn)側(cè)翼序列

<222>(37)..(37)

<223>n=t/c

<220>

<221>第二和第三snp分子標(biāo)記位點(diǎn)側(cè)翼序列

<222>(47)..(47)

<223>n=t/c

<400>2

ggcagtgtgctaccaccatctttacataatcaagttnccacaggaantattgatgagagt60

agcagcagtgtcaattttggtgatagtgctattggattcatg102

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gctctggacacatcagtctgt21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tgcagtgcctgcataatagga21

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cagtgtgctaccaccatctttac23

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gaatccaatagcactatcaccaaaa25