專利名稱：低和無過氧化氫酶大腸桿菌菌株、構建方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物突變制備的微生物，尤其是關于過氧化氫酶基因katG被鈍化的大腸桿菌新菌株Ecoli C93和過氧化氫酶基因katG和katE被雙重鈍化的大腸桿菌新菌株Ecoli D11及其構建方法，以及該兩菌株應用作為宿主菌用于表達GL-7ACA?；富蚧騞aao基因，用于CPC轉化生成7-ACA的反應。
在兩步酶法轉化頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)生產(chǎn)7-ACA(7-氨基頭孢烷酸)的過程中，CPC首先在D-氨基酸氧化酶(DAAO)的作用下裂解生成α-酮基-已二酰-7ACA(AKA-7ACA)和過氧化氫，再進一步脫羧形成戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-Amino-Cephalosporin Acid，GL-7ACA)，而后GL-7ACA在GL-7ACA?；傅拇呋律?-ACA。其中第一步反應，即CPC裂解生成GL-7ACA反應的順利進行，有賴于反應初伴隨AKA-7ACA生成的另一中間產(chǎn)物-H2O2能繼續(xù)作為氧化劑參與AKA-7ACA脫羧生成GL-7ACA的反應。(見圖1)目前用于生產(chǎn)DAAO的三角酵母多倍體細胞(Trigonopsis Variabilis)及生產(chǎn)GL-7ACA酰化酶的基因工程宿主菌大腸桿菌(E.coli)自身均具有較高活力的過氧化氫酶。它們的存在，會令第一步反應初始生成的過氧化氫迅速分解，從而阻止了AKA-7ACA生成GL-7ACA反應的順利進行，造成AKA-7ACA的積累，降低了反應速度和CPC的轉化率。
利用外加過氧化氫的方法，雖可促使部分AKA-7ACA生成GL-7ACA，但作為氧化劑，過量的過氧化氫不但會對CPC、GL-7ACA、7-ACA產(chǎn)生破壞，而且會抑制DAAO及GL-7ACA?；傅幕钚?。為解決這一問題，本發(fā)明人曾應用堿處理的方法(參考文獻Teffery，T.V.等EnzymeMicrob Technol，1993，vol 15，April)，成功地對T.variabilis的過氧化氫酶進行了選擇性抑制，減少了第一步酶反應中AKA-7ACA的積累，提高了GL-7ACA的轉化率。但為使兩菌在同一體系內(nèi)對CPC實行兩酶共轉化、一步生成7-ACA的方案順利實施，還需確保參與第二步酶反應的GL-7ACA?；傅幕蚬こ趟拗骶?E.coli中的過氧化氫酶也受到相應抑制。本發(fā)明人在實驗中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對于堿處理不敏感，暫時還找不到一個合適的選擇性抑制E.coli過氧化氫酶的方法。最近，T.variabilis中的daao基因克隆成功，并在E.coli中獲得了較高表達。DAAO基因工程菌進一步在CPC轉化反應中的應用，亦亟待宿主菌E.coli過氧化氫酶問題的解決。
為此，本發(fā)明的目的是提供低過氧化氫酶或無過氧化氫酶的大腸桿菌E.coli菌株及其構建方法，又一目的是該兩菌株應用作為宿主菌，表達GL-7ACA?；富蚧騞aao基因，使在轉化CPC生成7-ACA的反應中，于同一體系內(nèi)對CPC實行兩酶共轉化一步生成7-ACA的反應順利進行，在生產(chǎn)上具有廣泛的應用前景。
本發(fā)明提供低過氧化氫酶大腸桿菌菌株E.coli C93(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，1998年12月15日，保藏登記號為CGMCC 0375)和無過氧化氫酶大腸桿菌菌株E.coli D11(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，1998年12月15日，保藏登記號為CGMCC 0376)。
本發(fā)明構建方法主要運用由P1噬菌體介導的染色體體內(nèi)重組技術，通過六步轉導，二步反向篩選，分別鈍化了大腸桿菌的過氧化氫酶基因katG以及katG和katE，構建了兩株新的大腸桿菌菌株-E.coliC93和E.coli D11。其中單獨鈍化了katG基因的E.coli C93仍保留約40％的過氧化氫酶活力，而katG、katE被雙重鈍化的E.coli D11已無法測出過氧化氫酶活力。本發(fā)明還找到了以這兩株新構建的菌株作宿主的GL-7ACA?；富蚬こ叹虳-氨基酸氧化酶基因工程菌的最適發(fā)酵條件。在該條件下，以它們作宿主表達的GL-7ACA?；负虳-氨基酸氧化酶能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。將E.coli C93和D11作為宿主菌分別應用于轉化CPC生成GL-7ACA，再由GL-7ACA生成7-ACA的反應，E.coli D11可大幅度降低反應中AKA-7ACA的積累，顯著提高反應速度和底物的轉化率。而C93殘余的過氧化氫酶仍能對過氧化氫造成不可忽視的破壞，從而干擾轉化反應的進行。
下面通過五個方面對本發(fā)明內(nèi)容進行詳細闡述1.本發(fā)明提供過氧化氫酶基因katG被鈍化的低過氧化氫酶大腸桿菌菌株E.coli C93和過氧化氫酶基因katG和katE被雙重鈍化的無過氧化氫酶大腸桿菌菌株E.coli D11。這兩株大腸桿菌同時具有ampC基因插入突變，對CPC及其衍生物基本無破壞作用，以及recA基因突變，外源導入的質粒能穩(wěn)定傳代和表達的性狀。
2.低過氧化氫酶的大腸桿菌菌株E.coli C93和無過氧化氫酶的大腸桿菌菌株D11的構建方法表1菌種、噬菌體和質粒
<p>E.coli BL21是一株通常用作表達外源重組基因的表達型宿主菌，它具有正常的過氧化氫酶基因。以該菌作為出發(fā)菌，具體的構建過程如圖2所示。構建過程中所用菌種、噬菌體和質粒見表1。
(1)以E.coli BL21為受體菌，通過P1轉導，使之獲得供體菌E.coliUM197含插入突變的katG∷Tn10遺傳性狀，所得菌株命名為ZBL9。
(2)為避免宿主E.coli中ampC編碼的蛋白對CPC的破壞，需將ampC基因鈍化。故以ZBL9為受體菌，以MMR204為供體菌，通過P1轉導，使ZBL9獲得ampC∷KAPA遺傳性狀。所得菌株命名TBL6。
(3)欲使攜帶外源基因的質粒能在宿主中穩(wěn)定表達，還需鈍化宿主E.coli的recA基因。但由于受體菌MMR204中缺失突變的recA基因是以其緊密連鎖的srl基因中插入的Tn10作遺傳標記，故為進一步轉導后的篩選作準備，需先篩出丟失了Tn10而對四環(huán)素敏感的受體菌。Tn10的丟失會導致原插入位點染色體的畸變，故丟失了Tn10的菌株仍將保持katG鈍化的性狀。將TBL6經(jīng)四環(huán)素敏感菌篩選平板(Tetracycline-Sensitive-Selected Plate，TSS平板)篩選后得到的對四環(huán)素敏感的E.coli菌株命名為BBLA1和BBLC2。
(4)再以BBLA1為受體，以MMR204為供體，篩出四環(huán)素抗性的轉導子，再利用紫外超敏感性篩選獲得了與srl∷Tn10緊密連鎖的recA缺失突變的轉導子，命名為E.coli C93，其KatG、ampC、recA基因均被鈍化。
(5)為獲得katG、katE雙突變的宿主E.coli，可以katE突變的E.coliUM2作供體菌。但因E.coli UM2的katE2基因自身及鄰近基因均未攜帶遺傳標記，故我們先要在katE2基因的染色體鄰近部位插入一個遺傳標記。為此，我們以帶有zdj-276∷Tn10標記的E.coli CAG18464為供體，通過P1轉導、篩選，使受體E.coli UM2在鄰近katE2基因的染色體位置zdj-276上獲得Tn10的遺傳標記。新得E.coli菌株命名A10。
(6)以A10為供體，第3步轉導所得的BBLC2作受體，經(jīng)轉導，在含四環(huán)素的平板上篩出獲得了zdj-276∷Tn10的E.coli菌株。再逐一測其過氧化氫酶活力，選擇其中同時獲得了與zdj-276∷Tn10發(fā)生共轉導的katE2基因的E.coli，命名為B3，其過氧化氫酶活力無法測出。
(7)在TSS平板上篩選出丟失了Tn10的B3，將其命名為C23。
(8)以C23為受體，MMR204為供體，經(jīng)過如第4步中所述的轉導和篩選使C23的recA基因被鈍化，新得菌株命名為D11，其具有katG和katE雙重缺失突變、過氧化氫酶活力無法測出，以及ampC插入突變、recA缺失突變的遺傳特征。
3.新構建菌株過氧化氫酶活力的比較測定新構建的各菌株的過氧化氫酶活力，并進行比較。結果如表2所示。
可以看出，只鈍化了過氧化氫酶基因katG的各菌株仍殘留了20％～40％的過氧化氫酶活力；而過氧化氫酶基因katG和katE被雙重鈍化的菌株中已測不出過氧化氫酶活力。
表2不同菌株過氧化氫酶活力比較菌株 相關表型 過氧化過氧化氫過氧化氫酶相對活過氧化氫酶相對比氫酶活 酶比活力 活(以kat基因為野力 (u/ml (以kat基因為野生生型的BL21的CAT(u/ml) OD600) 型的BL21的CAT 為100％)為100％)BL21 kat基因野生型49.28 10.18 11MMR204 kat基因野生型50.3 10.23 1.021.005UM197katG-12032 2.22 0.25 0.22ZBL9 katG-15.4 3.68 0.31 0.36TBL6 katG-17.6 4.63 0.40 0.43BBLA1katG-12.32 3.68 0.22 0.35BBLC2katG-17.6 4.97 0.36 0.51C93 katG-28.6 7.28 0.25 0.26UM56-64 katE-，katG--- --UM2 katE-，katG--- --A10 katE-，katG--- --B3katE-，katG--- --C23 katE-，katG--- --D11 katE-，katG--- --(注)CAT是過氧化氫酶的英文縮寫。
4.新構建的E.coli C93、D11作宿主菌的應用(1)表達連接于質粒pMR24或pZC1上的GL-7ACA?；富蚺c已報道宿主菌E.coli MMR204的比較。由于pMR24和pZC1在各菌株中的表達情況類似，故僅以pMR24為例說明，見表3。
為使新構建的兩株菌能實際應用于同一體系內(nèi)共轉化CPC一步生成7-ACA的反應，需要它們在過氧化氫酶鈍化的同時，表達外源基因的能力也能滿足轉化反應的要求。因此，通過轉化將pMR24轉入E.coli MMR204、C93和D11，找到它們的最適發(fā)酵條件、產(chǎn)酶比活、產(chǎn)酶總量并進行比較。由發(fā)酵結果來看，過氧化氫酶基因katG被鈍化、過氧化氫酶活力約為正常菌株40％的菌株E.coli C93，在LB培養(yǎng)基中的生長與MMR204類似。而過氧化氫酶基因kat G、kat E雙突變，基本無過氧化氫酶活力的菌株E.coli D11，它在LB發(fā)酵培養(yǎng)基中生長受到影響，菌濃度較低。當它們表達GL-7ACA酰化酶時，在含不同濃度葡萄糖的LB發(fā)酵液中，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度由0.05％升至0.2％，MMR204、C93產(chǎn)?；傅谋然?即單位濃度菌體的產(chǎn)酶活力)幾乎不受影響，而D11的比活則隨葡萄糖濃度的升高而下降，顯示了D11對培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度比MMR204更敏感。但采用間歇式補加低濃度葡萄糖的方法，可以克服高濃度葡萄糖對D11產(chǎn)酶比活的影響，在不降低D11產(chǎn)酶比活的情況下提高菌濃度，使D11總產(chǎn)酶量達到與MMR204相當?shù)乃?。因此，E.coli C93、D11和MMR204的最適發(fā)酵條件均是在發(fā)酵中間歇式補加低濃度葡萄糖，即每隔兩小時補一次葡萄糖。這說明D11可以作為表達外源GL-7ACA酰化酶的宿主菌應用于生產(chǎn)，具有實用價值。
(2)表達連接于質粒pJL上的daao基因見表3。(與已報道宿主菌E.coli MMR204比較)表達D-氨基酸氧化酶時，C93、D11也呈現(xiàn)與上述表達GL-7-ACA?；笗r相似的趨勢。即C93的產(chǎn)酶比活與總產(chǎn)酶量與MMR204基本相同；D11產(chǎn)酶比活與MMR204、C93相當，而菌濃度低，所以總產(chǎn)酶量低于MMR204，但其表達的D-氨基酸氧化酶單位已能滿足生產(chǎn)的要求。連接于pJL上的DAAO基因在E.coli生長對數(shù)前期表達，十小時達到產(chǎn)酶高峰，在培養(yǎng)基中補加葡萄糖對MMR204、C93、D11產(chǎn)DAAO無明顯促進或抑制作用。表3以MMR204、C93、D11為宿主表達pMR24或pJL在不同發(fā)酵條件下的酶活比較<
>5.以C93、D11為宿主的GL-7ACA?；富蚬こ叹癉AAO基因工程菌在CPC轉化反應中的應用(與已報道的宿主菌MMR204比較)(1)DAAO基因工程菌轉化CPC生成GL-7ACA的反應分別將基因工程菌MMR204/pJL、C93/pJL、D11/pJL濕菌體(相當于6U的D-氨基酸氧化酶活力)與5ml 3％的CPC溶液混合及1mg/ml的舒巴坦鈉按實施例6中所述混合并反應。圖3、圖4、圖5、圖6分別為MMR204/pJL、C93/pJL、D11/pJL以及經(jīng)溶劑處理鈍化了過氧化氫酶的三角酵母細胞轉化反應液反應至210分鐘的HPLC檢測圖。由圖可以看出，MMR204/pJL反應至210分鐘時，反應液中AKA-7ACA的峰很高，而GL-7ACA峰很小?？梢姶蟛糠钟蒀PC轉化生成的AKA-7ACA無法繼續(xù)被過氧化氫氧化生成GL-7ACA而積累了起來。C93/pJL的GL-7ACA峰雖較MMR204/pJL略有改善，但AKA-7ACA峰仍然很高，說明宿主菌C93中殘余的過氧化氫酶仍對反應中生成的過氧化氫破壞明顯，AKA-7ACA仍不能順利地被過氧化氫氧化成GL-7ACA。但D11/pJL的情況有了根本改進。它的AKA-7ACA峰很小而GL-7ACA峰很高，說明D11可以對反應中的過氧化氫不造成破壞，因而使AKA-7ACA氧化生成GL-7ACA的反應順利進行。它的反應情況與經(jīng)處理的三角酵母類似，說明D11確能取代經(jīng)處理的三角酵母，在工業(yè)生產(chǎn)上有良好的應用前景。
(2)GL-7ACA酰化酶基因工程菌及預處理除過氧化氫酶的三角酵母多倍體細胞共轉化CPC生成7-ACA的反應將基因工程菌MMR204/pMR24、C93/pMR24、D11/pMR24濕菌體分別與經(jīng)處理鈍化了過氧化氫酶的三角酵母細胞以及3％的CPC溶液如實施例7中所述混合并反應。圖7、圖8、圖9依次為以上三株基因工程菌的轉化反應液反應至210分鐘時的HPLC檢測圖。各株菌的轉化效率如表4所示。由圖、表可以看出，以D11為宿主的GL-7ACA?；富蚬こ叹糜诠厕D化反應時，可以使AKA-7ACA積累而阻止反應繼續(xù)向生成GL-7ACA和7-ACA進行的題得到解決，CPC總轉化效率由MMR204的22.13％提高至60.13％，故其已具備了應用于工業(yè)化生產(chǎn)的條件。C93雖不足以解決這一問題，但對緩解過氧化氫的破壞對生產(chǎn)帶來的不利影響也有一定作用。
表4 MMR204/pMR24、C93/pMR24、D11/pMR24與處理后的三角酵母細胞參與CPC共轉化反應210分鐘后結果比較
本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明提供了一種低過氧化氫酶的大腸桿菌菌株E.coliC93及一種無過氧化氫酶的大腸桿菌菌株E.coli D11。其中由于E.coli C93的katG基因被鈍化，它的過氧化氫酶活力僅為原來的40％左右。由于E.coli D11的過氧化氫酶基因katG和katE被雙重鈍化，其體內(nèi)已測不出過氧化氫酶活力。又因該兩菌株的ampC基因被鈍化，它們對于CPC及其衍生物沒有破壞。另外，該兩菌株recA基因也被鈍化，它們作為宿主時，GL-7ACA?；富蚣癲aao基因能在其中穩(wěn)定表達。將它們應用于CPC轉化生成7-ACA的反應，可減少或避免宿主菌過氧化氫酶對反應中間物過氧化氫的破壞，使過去需在兩個體系中分別進行，先由體外鈍化了過氧化氫酶的三角酵母轉化CPC生成GL-7ACA，再由GL-7ACA?；富蚬こ叹D化GL-7ACA生成7-ACA的反應，簡化為于同一體系內(nèi)兩酶對CPC實施共轉化，一步生成7-ACA。特別是E.coliD11，它能基本消除由過氧化氫酶導致的過氧化氫分解，明顯降低CPC轉化生成7-ACA反應中AKA-7ACA的積累，使共轉化反應順利進行，轉化反應的速度和轉化效率得到提高。該兩菌株還可避免ampC基因編碼的β-內(nèi)酰胺酶對CPC及其衍生物的破壞，在生產(chǎn)上具有廣泛的應用前景。
本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1.酶法轉化CPC生成7-ACA的反應過程。
圖2.E.coli C93、D11的構建過程。其中虛線框表示每一步轉導中所用受體菌及相關性狀。實線框表示每步轉導中所用供體菌及有關性狀。粗線框表示最終獲得了所有性狀的菌株。
圖3.MMR204/pJL用于CPC轉化反應至210分鐘時的HPLC檢測圖。
圖4.C93/pJL用于CPC轉化反應至210分鐘時的HPLC檢測圖。
圖5.D11/pJL用于CPC轉化反應至210分鐘時的HPLC檢測圖。
圖6.過氧化氫酶被鈍化的三角酵母細胞用于CPC轉化反應至210分鐘時的HPLC檢測圖。
圖7.MMR204/pMR24與過氧化氫酶被鈍化的三角酵母細胞共轉化CPC至210分鐘時的HPLC檢測圖。
圖8.C93/pMR24與過氧化氫酶被鈍化的三角酵母細胞共轉化CPC至210分鐘時的HPLC檢測圖。
圖9.D11/pMR24與過氧化氫酶被鈍化的三角酵母細胞共轉化CPC至210分鐘時的HPLC檢測圖。
實施例1.P1轉導本實驗步驟參考文獻Miller，J.H.et al 1972 Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbors，N.Y。步驟1.制備供體菌裂解液首先將過夜的供體菌培養(yǎng)物接種于含5mmol/LCaCl2的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)2小時。同時將P1裂解液稀釋成10-2、10-4、10-6、10-8系列濃度。然后將新鮮的供體菌培養(yǎng)物0.2ml與0.1ml不同稀釋度的P1裂解液均勻混合，于37℃水浴靜置20分鐘，加入3ml冷至50℃的R-top瓊脂，迅速倒于事先備好的鋪有含50mmol/LCa2+的LB下層瓊脂的平板中，然后于37℃溫育約6小時，每小時觀察一下平板，看噬菌斑的生長情況。再選出噬菌斑交連成片的平板，加入3～4ml液體LB，于4℃過夜。第二天用無菌吸管吸出LB液，轉入一帶磨口塞的試管，再加入5～10滴氯仿，使勁振搖。再離心，將上清液移入一支無菌試管，滴幾滴氯仿，制成供體菌裂解液。步驟2.轉導將生長過夜的受體菌接種于含50mmol/LCa2+的LB培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)2小時。然后收集受體菌菌體，重懸于1/10體積的MC溶液(5mmol/LCaCl2，0.1mol/L MgSO4)中。同時將供體菌的裂解液與生理鹽水按1∶1比例混合，用紫外線照射5分鐘。而后取一支無菌試管，加入0.2ml受體菌，0.5ml供體裂解液，0.5ml液體LB，5ul lMCaCl2，。并另取二支試管作對照，一支不加受體菌，一支不加供體菌裂解液，其余同上。然后將試管于37℃水浴靜置20分鐘，離心，棄上清，菌體重懸于0.2mlLB中。取0.1ml菌體涂于含相應抗生素的平板，次日觀察，挑出長出的單菌落繼續(xù)鑒定，確定其是否為獲得了供體菌目的性狀的轉導菌。
在構建E.coli C93和D11時，上述P1轉導共進行六次，如圖2所示。實施例2.四環(huán)素敏感菌株篩選的實驗本實驗步驟參考文獻Loewen，P.C.et al J Bacteriol，Nov.1984，p668～675。
將生長至對數(shù)期的帶有Tn10的E.coli培養(yǎng)物涂布于TSS平板，于37℃培養(yǎng)，挑出其中單菌落于TSS平板上反復劃線，并在含四環(huán)素的平板上檢查其是否確實丟失了四環(huán)素抗性。
在構建E.coli C93和D11時，上述四環(huán)素敏感菌株的篩選共進行二次，如圖2所示。實施例3.過氧化氫酶活力的測定取1ml發(fā)酵液，4000rpm離心10分鐘，再用10ml H2O重懸菌體(即稀釋10倍)。然后取2ml菌懸液加1ml H2O2溶液，另取2ml加1ml H2O作對照，用島津UV250分光光度計，240nm時間掃描。計算掃描曲線的斜率，代入由H2O2標準曲線(25℃)所得公式，計算出CAT活力。
一個單位的過氧化氫酶活定義為一分鐘內(nèi)分解1μmol H2O2生成O2和H2O所需酶量。
過氧化氫酶活力測定的結果見表2。實施例4GL-7ACA?；富盍Φ臏y定本實驗步驟參考文獻魏中荻，楊蘊劉，金志坤等，中國專利，
發(fā)明者楊蘊劉, 朱彤波, 趙國屏, 張益芬, 姜衛(wèi)紅, 陳軍, 焦瑞身 申請人:中國科學院上海植物生理研究所