專利名稱:新型大腸桿菌菌株及其制備方法和它們在l-蘇氨酸生產(chǎn)發(fā)酵方法中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及新型大腸桿菌(Escherichia coli)菌株和利用這些微生物的發(fā)酵方法。本發(fā)明尤其涉及經(jīng)基因改造的大腸桿菌菌株和它們在氨基酸,特別是天冬氨酸族氨基酸成員,如蘇氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的大腸桿菌菌株的制備方法。
背景技術(shù):
在大腸桿菌中,氨基酸L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸和L-甲硫氨酸的全部或部分碳原子通過下面的共同生物合成途徑由天冬氨酸衍生而來(G.N.Cohen,“賴氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸合成的共同途徑,(The common pathway to lysine,methionine and threonine,)”pp.147-171《氨基酸生物合成及遺傳調(diào)控》(Amino Acids:Biosynthesis andGenetic Regulation),K.M.Herrmann和R.L.Somerville編,Addison-Welesley出版有限公司,Reading,Mass.(1983))天冬氨酸→天冬氨酰磷酸→天冬氨酸半醛→高絲氨酸→甲硫氨酸/蘇氨酸/異亮氨酸↓賴氨酸這個(gè)共同途徑的第一步反應(yīng)是由三種不同的天冬氨酸激酶(AKⅠ、Ⅱ或Ⅲ)中的一種催化的,每一種天冬氨酸激酶由各自的基因編碼并且其活性和合成的調(diào)控方式與其它的天冬氨酸激酶不同。例如,天冬氨酸激酶Ⅰ由thrA編碼,其活性受蘇氨酸抑制,其合成受蘇氨酸和異亮氨酸的聯(lián)合阻遏。而天冬氨酸激酶Ⅱ是由metL編碼的,并且它的合成受甲硫氨酸的阻遏(盡管它的活性不受甲硫氨酸抑制或甲硫氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸成對的聯(lián)合抑制(F.Falcoz-Kelly等,歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)8:146-152(1969);J.C.Patte等,Biochim.Biophys,Acta136:245-257(1967))。天冬氨酸激酶Ⅲ由lysC編碼,其活性和合成分別受到賴氨酸的抑制和阻遏。
天冬氨酸激酶中的兩種,天冬氨酸激酶Ⅰ和Ⅱ并不是不同的蛋白質(zhì),而是一個(gè)復(fù)合酶的結(jié)構(gòu)域,這個(gè)復(fù)合酶分別含有高絲氨酸脫氫酶Ⅰ和Ⅱ,每一種高絲氨酸脫氫酶催化天冬氨酸半醛還原為高絲氨酸(P.Truffa-Bachi等,歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)5:73-80(12968)]。因此高絲氨酸脫氫酶Ⅰ也是由thrA編碼的,它的合成受到蘇氨酸和異亮氨酸的聯(lián)合阻遏,并且它的活性受到蘇氨酸的抑制。高絲氨酸脫氫酶Ⅱ相似地也由metL編碼并且它的合成受甲硫氨酸阻遏。
蘇氨酸的生物合成包括下列附加反應(yīng)高絲氨酸→高絲氨酸磷酸→蘇氨酸。高絲氨酸的磷酸化也是由高絲氨酸激酶催化的,該酶是一種由thrB編碼的兩個(gè)相同的29kDa的亞單位組成的蛋白質(zhì),并且該蛋白質(zhì)的活性受蘇氨酸抑制(B.Burr等,生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)62:519-526(1976))。最后一步,由高絲氨酸磷酸到L-蘇氨酸的復(fù)雜轉(zhuǎn)化是由蘇氨酸合酶催化的,該酶是由thrC編碼的47kDa的蛋白質(zhì)(C.Parsot等,核酸研究(Nucleic Acids Res.)11:7331-7345(1983))。
thrA、thrB和thrC基因都屬于thr操縱子,這是一個(gè)位于大腸桿菌基因圖譜0分鐘的單獨(dú)操縱子(J.Theze和I.Saint-Girons,細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)118:990-998(1974);J.Theze等,細(xì)菌學(xué)雜志,117:133-143(1974)))。這些基因分別編碼天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。這些酶的生物合成受到蘇氨酸和異亮氨酸的多價(jià)阻遏(M.Freundlich,生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun)10:277-282(1963))。
在thr操縱子的第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的上游發(fā)現(xiàn)了一個(gè)調(diào)控區(qū),其序列已經(jīng)確定(J.F.Gardner,美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl,Acad.Sci.USA)76:1706-1710(1979))。thr弱化子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游,包含一段編碼先導(dǎo)肽的序列,該序列包含8個(gè)蘇氨酸密碼子和4個(gè)異亮氨酸密碼子。thr弱化子還包含典型的互斥型二級結(jié)構(gòu),其依賴于帶電荷的蘇氨酰-和異亮氨酰-tRNA的水平允許或阻止RNA聚合酶對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。
因?yàn)殛P(guān)系到通過自然生物合成獲得高水平氨基酸產(chǎn)量的問題(例如thr操縱子受目的產(chǎn)物的抑制),構(gòu)建了具有包含一個(gè)thr操縱子的質(zhì)粒的細(xì)菌菌株,該操縱子帶有編碼抗反饋酶的thrA基因。利用這些質(zhì)粒,已經(jīng)在工業(yè)規(guī)模上通過利用多種微生物,例如,黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)了L-蘇氨酸。
例如,大腸桿菌菌株BKIIM B-3996(Debabov等,美國專利第5,175,107號)含有質(zhì)粒pVIC40,在36小時(shí)產(chǎn)生蘇氨酸約85g/L。該宿主是一種蘇氨酸需求型菌株,因?yàn)樗奶K氨酸合酶是缺陷的。在BKIIMB-3996中,重組質(zhì)粒pVIC40提供了蘇氨酸生物合成必需的關(guān)鍵酶活性,即抗反饋天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。該質(zhì)粒還互補(bǔ)了宿主的蘇氨酸缺陷。
大腸桿菌菌株29-4(E.Shimizu等,Biosci.Biotech.Biochem.59:1095-1098(1995))是重組大腸桿菌蘇氨酸產(chǎn)生菌的另一個(gè)例子。菌株29-4的構(gòu)建是通過將一個(gè)蘇氨酸過量產(chǎn)生突變株,大腸桿菌K-12(βIM-4)(來自大腸桿菌ATCC 21277)的thr操縱子克隆至質(zhì)粒pBR322,再將該質(zhì)粒引入親株(K.Wiwa等,農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)47:2329-2334(1983))。菌株29-4在72小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生約65g/L蘇氨酸。
利用其它微生物構(gòu)建了相似的重組菌株。例如粘質(zhì)沙雷氏菌菌株T2000含有編碼抗反饋的thrA基因產(chǎn)物的thr操縱子的質(zhì)粒,且在96小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生約100g/L蘇氨酸(M.Masuda等,應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(Applied Biochemistry and Biotechnology)37:255-262(1992))。所有這些菌株都含有帶多拷貝編碼蘇氨酸生物合成酶的基因的質(zhì)粒。該質(zhì)粒允許過量表達(dá)這些酶。這種來自質(zhì)粒的編碼蘇氨酸生物合成酶的基因的過量表達(dá),尤其是編碼抗反饋天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ的thrA基因,使得這些菌株產(chǎn)生大量的蘇氨酸。其它的含有質(zhì)粒的微生物的例子也已被描述,如美國專利第4,321,325;4,347,318;4,371,615;4,601,983;4,757,009;4,945,058;4,946,781;4,980,285;5,153,123;和5,236,831號。
然而這些含質(zhì)粒的菌株還存在限制它們在商業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸上的應(yīng)用的問題。例如這些菌株的一個(gè)顯著的問題是必須確保在整個(gè)發(fā)酵過程中維持包含質(zhì)粒的菌株的完整性。因?yàn)樵诩?xì)胞生長和分化過程中質(zhì)??赡軄G失。要避免這個(gè)問題,就有必要在培養(yǎng)過程中選擇性地淘汰不含質(zhì)粒的細(xì)胞,例如通過在質(zhì)粒上加上抗生素抗性基因。然而這種需要向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一種或多種抗生素的方法對大規(guī)模的發(fā)酵在商業(yè)上是不實(shí)用的。
包含質(zhì)粒的菌株的另一個(gè)顯著的問題是質(zhì)粒的穩(wěn)定性?;蚓幋a在質(zhì)粒上的酶的高表達(dá)是對商業(yè)化實(shí)用性的發(fā)酵方法而言所必要的,但卻經(jīng)常引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定性(E.Shimizu等.Biosci.Biotech.Biochem.59:1095-1098(1995))。質(zhì)粒的穩(wěn)定性還依賴于諸如培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基中的溶解氧水平等因素。例如,包含質(zhì)粒的菌株29-4在較低的培養(yǎng)溫度(30℃比37℃)和較高的溶解氧水平時(shí)更穩(wěn)定(E.Shimizu等,Biosci.Biotech.Biochem.59:1095-1098(1995))。
不合質(zhì)粒的微生物盡管不如上述那些菌株有效,也已用作蘇氨酸產(chǎn)生菌。大腸桿菌如菌株H-8460是通過一系列常規(guī)誘變和對幾種代謝類似物的抗性篩選獲得的,它在70小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生大約75g/L的L-蘇氨酸(Kino等,美國專利第5,474,918號)。菌株H-8460沒有攜帶重組質(zhì)粒,在染色體上有一個(gè)蘇氨酸生物合成基因的拷貝。這個(gè)菌株的產(chǎn)量與含有質(zhì)粒的菌株如BKIIM B-3996相比較低,據(jù)信是由于酶活性較低的緣故(尤其是那些由thr操縱子編碼的酶),因?yàn)檫@些不合質(zhì)粒的菌株僅僅含有一個(gè)拷貝的蘇氨酸生物合成基因。其它適合的不含質(zhì)粒的微生物的例子也有描述,如美國專利第5,376,538;5,342,766;5,264,353;5,217,883;5,188,949;5,164,307;5,098,835;5,087,556;5,077,207;5,019,503;5,017,483;4,996,147;4,463,094;4,452,890;3,732,144;3,711,375;3,684,654;3,684,653;3,647,628;3,622,453;3,582,471;3,580,810;3,984,830;和3,375,173。
無論是不含質(zhì)粒還是含有質(zhì)粒的大腸桿菌菌株,其thr操縱子都是由該菌株自身的蘇氨酸啟動子所調(diào)控的。如前面所述,自身啟動子的表達(dá)受到由一段DNA區(qū)域控制的弱化機(jī)制的調(diào)節(jié),這段DNA編碼一個(gè)先導(dǎo)肽并含有大量的蘇氨酸和異亮氨酸密碼子。這段DNA區(qū)域由一個(gè)能感受蘇氨酰-tRNA和異亮氨酰-tRNA水平的核糖體所翻譯,當(dāng)這兩種氨酰-tRNA的水平足夠使先導(dǎo)肽翻譯時(shí),轉(zhuǎn)錄被過早地終止。但是當(dāng)其水平不足以使先導(dǎo)肽翻譯時(shí),轉(zhuǎn)錄不被終止而整個(gè)操縱子被轉(zhuǎn)錄,隨后進(jìn)行翻譯,導(dǎo)致蘇氨酸生物合成酶產(chǎn)量增加。于是當(dāng)蘇氨酰-tRNA和/或異亮氨酰-tRNA水平低時(shí),thr操縱子被最大程度地轉(zhuǎn)錄并且蘇氨酸生物合成酶產(chǎn)量最大。
在大腸桿菌蘇氨酸產(chǎn)生菌株BKIIMB-3996中,質(zhì)粒上的蘇氨酸操縱子被其自身的啟動子所調(diào)控。因此,只有當(dāng)菌株缺乏蘇氨酸和/或異亮氨酸時(shí),thr操縱子才能被最大程度地表達(dá)。因?yàn)樵诋a(chǎn)蘇氨酸菌株中不可能存在蘇氨酸饑餓,這些菌株被賦予異亮氨酸缺陷型來獲得較高水平的酶活性。
克服弱化控制的另一條途徑是降低細(xì)胞中蘇氨酰-tRNA和/或異亮氨酰-tRNA水平。例如,一個(gè)帶蘇氨酰-tRNA合酶的thrS突變株,該酶對蘇氨酸的表觀親和力降低了200倍,結(jié)果使thr操縱子過量表達(dá),原因可能是蘇氨酰-tRNA的水平較低(E.J.Johnson等.細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)129:66-70(1977))。
然而在利用這些菌株的發(fā)酵方法中,必須在生長期補(bǔ)加異亮氨酸,因?yàn)榧?xì)胞的異亮氨酸生物合成不足。隨后在生產(chǎn)期細(xì)胞缺乏誘導(dǎo)蘇氨酸生物合成酶表達(dá)的異亮氨酸。所以,利用自身蘇氨酸啟動子控制蘇氨酸生物合成酶表達(dá)的一個(gè)主要缺點(diǎn)是必須為細(xì)胞補(bǔ)加異亮氨酸。
已知抗生素疏螺旋體素(borrelidin)能降低蘇氨酰-tRNA合酶的酶學(xué)活性,并因而抑制大腸桿菌生長(G.Nass等。生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)34:84(1969))。鑒于這種降低的酶活,某些大腸桿菌的疏螺旋體素敏感菌株被用于生產(chǎn)高水平的蘇氨酸(日本公開專利申請第6752/76號;美國專利第5,264,353號)。發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)物中添加疏螺旋體素可以增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量。短桿菌屬(Brevibacterium)和棒桿菌屬(Corynebacterium)的菌株也已被用于生產(chǎn)高水平的蘇氨酸(日本專利第53-101591號)。
大腸桿菌的疏螺旋體素抗性突變株同樣表現(xiàn)出蘇氨酰-tRNA合酶活性的改變。更進(jìn)一步說,疏螺旋體素抗性的大腸桿菌表現(xiàn)為具備下列特征之一(ⅰ)組成型地增加野生型蘇氨酰-tRNA合酶的水平;(ⅱ)結(jié)構(gòu)上改變了的蘇氨酰-tRNA合酶;或(ⅲ)一些未知的細(xì)胞變化,可能由于一種膜的改變(G.Nass和J.Thomale,FEBS Lett.39:182-186(1974))。然而這些突變株還沒有一種被用于L-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)上。
鑒于上述討論,在現(xiàn)有技術(shù)上尚存對這種微生物菌株的需求,它們可以有效地產(chǎn)生氨基酸,如蘇氨酸,但不存在與現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供能夠有效地產(chǎn)生大量的L-蘇氨酸,而不需要任何含有編碼蘇氨酸生物合成酶基因的重組質(zhì)粒,并且優(yōu)選地沒有對氨基酸營養(yǎng)的需求的微生物。本發(fā)明其它的目的、特性和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述中給出,并且部分將通過說明書得到明確或從本發(fā)明的實(shí)踐中學(xué)習(xí)到。本發(fā)明的這些目的和優(yōu)點(diǎn)將通過在此次書面描述和權(quán)利要求中特別指出的方法得以實(shí)現(xiàn)。
這些目的和其它目的是通過本發(fā)明的方法完成的;在本發(fā)明第一實(shí)施方案中涉及一種用于生產(chǎn)氨基酸如蘇氨酸的方法,該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種大腸桿菌菌株并從培養(yǎng)基中回收氨基酸的步驟。本方法中采用的大腸桿菌菌株具有下列特征(ⅰ)它在染色體上含有一個(gè)處于非自身啟動子控制之下的氨基酸生物合成遺傳決定子,如蘇氨酸操縱子(該操縱子編碼蘇氨酸生物合成酶);且(ⅱ)它不需要任何含有編碼蘇氨酸生物合成酶基因的重組質(zhì)粒用于產(chǎn)生蘇氨酸。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及具有上述特征的大腸桿菌菌株的生物純培養(yǎng)。
本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于生產(chǎn)氨基酸,如蘇氨酸的方法,它包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種大腸桿菌菌株并從培養(yǎng)基中回收氨基酸的步驟,其中大腸桿菌菌株為疏螺旋體素抗性。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種產(chǎn)生用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸,如蘇氨酸的大腸桿菌菌株的方法,它包括這樣幾個(gè)步驟(a)將遺傳物質(zhì)從一種氨基酸產(chǎn)生菌引入到一種大腸桿菌缺陷型的染色體中,使得該大腸桿菌成為原養(yǎng)型;(b)在該氨基酸生物合成基因的染色體位置之前插入一個(gè)非自身啟動子到染色體上以控制其表達(dá);以及選擇性地,(c)從該染色體上去除氨基酸生物合成對氨基酸的營養(yǎng)需求,和/或氨基酸生物合成的調(diào)控障礙。
需要理解的是,前面的一般性描述和后面的描述都僅僅意在舉例和解釋,目的在于提供根據(jù)權(quán)利要求的本發(fā)明的進(jìn)一步解釋。
附圖簡述
圖1描繪的是由質(zhì)粒Kohara′sλ676和質(zhì)粒pUC19構(gòu)建質(zhì)粒pAD103的過程。圖2描繪的是由質(zhì)粒pAD103和質(zhì)粒pUC4k構(gòu)建質(zhì)粒pAD106的過程。圖3描繪的是由質(zhì)粒pAD103和質(zhì)粒pKK223-3構(gòu)建質(zhì)粒pAD115的過程。圖4描繪的是由質(zhì)粒pAD115和質(zhì)粒pAD106構(gòu)建質(zhì)粒pAD123的過程。圖5描繪的是將啟動子區(qū)域從質(zhì)粒pAD123整合到大腸桿菌染色體的過程。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳述在第一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及可以用于氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)方法的新細(xì)菌菌株。本發(fā)明的新細(xì)菌菌株具有以下特征(ⅰ)該菌株在染色體上至少含有一個(gè)處于非自身啟動子的控制之下的thr操縱子,即至少一套編碼蘇氨酸生物合成酶的基因;以及(ⅱ)該菌株不需要任何編碼蘇氨酸生物合成酶的重組質(zhì)粒用于產(chǎn)生蘇氨酸。
優(yōu)選地,這些創(chuàng)造性的菌株能夠在約30小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約50g/L左右的L-蘇氨酸;更優(yōu)選地在約30小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約70g/L,甚至更優(yōu)選地在約30小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約80g/L,最優(yōu)選地在約30小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約90g/L L-蘇氨酸。優(yōu)選地,這些創(chuàng)造性的菌株能夠在約48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約90g/L,更優(yōu)選地在約48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約100g/L,最優(yōu)選地在約48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約110g/L的蘇氨酸。
優(yōu)選地,這些創(chuàng)造性的菌株能夠以至少2克/升/小時(shí)左右的速率產(chǎn)生L-蘇氨酸,更優(yōu)選地以至少2.5克/升/小時(shí)左右的速率,更優(yōu)選地以至少3克/升/小時(shí)左右的速率,最優(yōu)選地以至少3.6克/升/小時(shí)左右的速率產(chǎn)生L-蘇氨酸。
在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中,用于發(fā)酵產(chǎn)生蘇氨酸的新細(xì)菌菌株同樣沒有對氨基酸營養(yǎng)的需求,即不需要添加氨基酸用于細(xì)胞生長和產(chǎn)生蘇氨酸。
根據(jù)本發(fā)明,創(chuàng)造性的細(xì)菌菌株不需要任何包含一種或多種編碼用于產(chǎn)生蘇氨酸的蘇氨酸生物合成酶基因的重組質(zhì)粒,即該菌株能夠產(chǎn)生蘇氨酸而不需要由重組質(zhì)粒中所含的基因編碼一種或多種蘇氨酸生物合成酶。當(dāng)然這些創(chuàng)造性的菌株根據(jù)需要可選擇地含有一種或多種重組質(zhì)粒。例如,盡管這樣的質(zhì)粒不是產(chǎn)生蘇氨酸所要求的,這些創(chuàng)造性的菌株可以含有編碼蘇氨酸生物合成酶的重組質(zhì)粒用于增加蘇氨酸的產(chǎn)量。本發(fā)明的菌株同樣可以含有編碼參與蘇氨酸生物合成的其它酶如天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的重組質(zhì)粒。
優(yōu)選地,這些創(chuàng)造性的菌株為大腸桿菌菌株。更優(yōu)選地,這些創(chuàng)造性的菌株是對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素疏螺旋體素呈抗性的大腸桿菌菌株。這些創(chuàng)造性的細(xì)菌菌株的一個(gè)特別優(yōu)選例子是大腸桿菌菌株kat-13,它于1996年6月28日被保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL),1815 NorthUniversity Street,Peoria,Illinois 61604,美國,保藏號為NRRL B-21593。
位于這些創(chuàng)造性細(xì)菌菌株細(xì)胞染色體上的蘇氨酸(thr)操縱子編碼蘇氨酸生物合成所必需的酶。優(yōu)選地,蘇氨酸操縱子包含AK-HD基因(thrA或metL)、高絲氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)。更優(yōu)選地,thr操縱子包含thrA(AKⅠ-HDⅠ基因)、thrB和thrC。合適的thr操縱子可以從諸如大腸桿菌菌株ATCC21277和菌株ATCC21530中獲得。特別優(yōu)選來自菌株ATCC21277的thr操縱子。染色體上可能存在多拷貝的thr操縱子。
優(yōu)選地,thr操縱子含有至少一種非弱化的基因,即該基因的表達(dá)不受(胞外和/或胞內(nèi))一種或多種蘇氨酸生物合成酶水平和/或其產(chǎn)物(如蘇氨酸和異亮氨酸)水平的阻遏。創(chuàng)造性菌株還可能含有具有缺陷型thr弱化子(位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游和第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因上游的調(diào)控區(qū))或沒有thr弱化子的一種thr操縱子。
在本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中,thr操縱子編碼一種或數(shù)種抗反饋的蘇氨酸生物合成酶,即酶的活性不受胞外和/或胞內(nèi)的蘇氨酸生物合成的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物水平的抑制。最優(yōu)選地,thr操縱子含有一個(gè)編碼抗反饋的AK-HD的基因,如抗反饋的AKⅠ-HDⅠ。抗反饋AK-HD的應(yīng)用為蘇氨酸生物合成提供了高水平的酶活性,即使在產(chǎn)生蘇氨酸的狀態(tài)下也是如此。
這些創(chuàng)造性菌株中蘇氨酸操縱子的表達(dá)受非自身啟動子的控制,即通常不控制自然界中大腸桿菌菌株中的thr操縱子表達(dá)的啟動子。把蘇氨酸生物合成酶自身啟動子替換成一種非自身的強(qiáng)啟動子來控制thr操縱子的表達(dá),使得即使只有一個(gè)基因組拷貝的thr操縱子也能得到較高產(chǎn)量的蘇氨酸。另外,既然用一種非自身的啟動子來控制蘇氨酸操縱子的表達(dá),也就沒有必要為了獲得更高產(chǎn)量的蘇氨酸而賦予菌株異亮氨酸缺陷型了。合適的啟動子的示范性的例子包括,但并不局限于lac啟動子;trp啟動子;λ噬菌體的PL啟動子;PR啟動子;lpp啟動子和tac啟動子。特別優(yōu)選用于這些創(chuàng)造的細(xì)菌菌株的是tac啟動子。
除了蘇氨酸操縱子以外,該創(chuàng)造性細(xì)菌菌株的細(xì)胞染色體上優(yōu)選地還含有至少一種編碼天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的基因。最優(yōu)選地,本發(fā)明中的細(xì)胞染色體含有至少一種asd基因,至少一種thrA基因,至少一種thrB基因和至少一種thrC基因。當(dāng)然該染色體可以含有一種或多種這些基因的多個(gè)拷貝。
蘇氨酸脫氫酶(tdh)催化L-蘇氨酸氧化為α-氨基-β-丁酮酸。相應(yīng)地,在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中,該創(chuàng)造性的細(xì)胞的染色體還含有至少一種缺陷型蘇氨酸脫氫酶(tdh)基因。該缺陷型tdh基因可能是一個(gè)蘇氨酸脫氫酶表達(dá)水平降低的基因,或者是一個(gè)編碼與自身蘇氨酸脫氫酶相比活性降低的蘇氨酸脫氫酶突變體的基因。優(yōu)選地,在該創(chuàng)造性菌株中采用的缺陷型tdh基因不表達(dá)蘇氨酸脫氫酶。不表達(dá)蘇氨酸脫氫酶的合適的tdh基因的示范性例子包括一種具有插入到tdh基因中的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因的tdh基因,或一種具有插入到tdh基因中的Tn5轉(zhuǎn)座子的tdh基因,如在美國專利第5,175,107號中所述。
本發(fā)明的細(xì)菌菌株可以通過任何為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知和可行的方法和技術(shù)加以制備。構(gòu)建該創(chuàng)造性的細(xì)菌菌株合適的方法的示范性例子包括用合適的試劑如NTG進(jìn)行誘變;通過轉(zhuǎn)化線性DNA片段和同源重組所介導(dǎo)的基因整合技術(shù);以及由噬菌體P1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。這些方法在本領(lǐng)域是眾所周知的,也有文獻(xiàn)描述,例如在J.H.Miller的《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》(Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring HarborLaboratory出版社,Cold Spring Harbor,紐約(1972));J.H.Miller的《細(xì)菌遺傳學(xué)簡明教程》(A Short Course in Bacterial Genetics,Cold SpringHarbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,紐約(1992));M.Singer和P.Berg的《基因與基因組》(Genes & Genomes,UniversityScience Books,Mill Valley,California(1991));J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,紐約(1989));P.B.Kaufman等的《生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的分子和細(xì)胞學(xué)方法手冊》(Handbook of Molecular and CellularMethods in Biology and Medicine,CRC出版社,Boca Raton,Florida(1995));B.R.Giick和J.E.Thompson主編的《植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法》(Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,CRC出版社,Boca Raton,Florida(1993))以及P.F.Smith-Keary的《大腸桿菌的分子遺傳學(xué)》(Molecular Genetics ofEscherichia coli,The Guilford出版社,紐約,NY(1989))。
在本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施方案中,利用P1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用引入蘇氨酸操縱子到大腸桿菌菌株ATCC21277,使生長時(shí)需要蘇氨酸的大腸桿菌菌株472T23轉(zhuǎn)變成蘇氨酸產(chǎn)生菌,大腸桿菌菌株ATCC21277可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到(American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,美國)。這個(gè)thr操縱子包含抗反饋的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶基因(thrA),高絲氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)。
為了提高該創(chuàng)造性菌株的蘇氨酸產(chǎn)量,可以通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)作用引入來自大腸桿菌菌株CGSC6945(相關(guān)基因型tdh-1::cat1212;來自美國耶魯大學(xué)的大腸桿菌基因儲存中心(E.coli Genetic Stock Center,335Osborne Memorial Laboratory,生物系,耶魯大學(xué),New Haven,Connecticut 06520-8104,美國))的缺陷型的蘇氨酸脫氫酶基因。所得到的蘇氨酸產(chǎn)生菌可以通過NTG誘變和/或疏螺旋體素抗性篩選得到進(jìn)一步改良。
攜帶抗生素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒,如kan(編碼卡那霉素抗性),和強(qiáng)啟動子,如PL或tac,可以被構(gòu)建并用作將所需DNA片段引入染色體的載體,啟動子優(yōu)選地位于thrA上游DNA和野生型thrA基因的數(shù)百個(gè)堿基對(即不是整個(gè)thrA基因)之間。該質(zhì)粒上的片段可以通過合適的限制性酶消化得到分離并加以純化,再通過轉(zhuǎn)化或電穿孔法引入到菌株中以去除蘇氨酸操縱子的控制區(qū),再通過同源重組替換成所需的片段,也就是位于thr基因開始處的抗生素抗性標(biāo)記基因和強(qiáng)啟動子。該片段可通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)作用再次轉(zhuǎn)移到疏螺旋體素抗性菌株中。
優(yōu)選的宿主菌株472T23對異亮氨酸的需求可以消除掉,比如通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)作用引入該標(biāo)記基因的野生型等位基因。其它宿主不需要的營養(yǎng)需求可以通過類似的方式,或通過為本領(lǐng)域的技術(shù)人員周知的和可行的其它方法得到消除。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案涉及所述細(xì)菌菌株在生產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸的發(fā)酵方法中的應(yīng)用。例如,蘇氨酸是通過在合成或天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)該創(chuàng)造性的菌株而得到的,培養(yǎng)基中含有至少一種碳源、至少一種氮源以及合適的無機(jī)鹽、生長因子等等。
適當(dāng)?shù)奶荚吹氖痉缎岳影?,但并不局限于碳水化合物類,如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉水解物、纖維素水解物和糖蜜;有機(jī)酸類,如乙酸、丙酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸和延胡索酸,以及醇類,如甘油。
適當(dāng)?shù)牡吹氖痉缎岳影?,但并不局限于氨,包括氨氣和液氨;無機(jī)或有機(jī)酸銨鹽,如氯化銨、磷酸銨、硫酸銨和乙酸銨;以及其它含氮物,包括肉浸出物、胨、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅水解物和酵母浸出物。
經(jīng)過培養(yǎng)后,培養(yǎng)液中積累的L-蘇氨酸可以根據(jù)任何已知的方法分離出來,例如通過利用在美國專利第5,342,766號中描述的離子交換樹脂法。該方法包括首先通過離心去除培養(yǎng)液中的菌體,然后用鹽酸把培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至大約2。酸化液隨后通過一種強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂,吸附物用稀釋的液氨洗脫。氨通過真空蒸發(fā)除去,濃縮所得溶液。加入乙醇并隨后冷卻得到L-蘇氨酸晶體。
天冬氨酸族的其它氨基酸可以通過與上面詳細(xì)描述的方法相似的方法獲得。例如異亮氨酸可以從該創(chuàng)造性的細(xì)菌菌株中得到,在該菌株的染色體上或質(zhì)粒上有一個(gè)擴(kuò)增(amplified)的ilvA基因或tdc基因,這兩個(gè)基因都編碼由蘇氨酸到異亮氨酸的生物轉(zhuǎn)化中的第一個(gè)酶蘇氨酸脫氨酶。對該基因的擴(kuò)增,例如通過使用一種編碼抗反饋酶的ilvA基因,導(dǎo)致異亮氨酸的生物合成增加。
相似地,甲硫氨酸可以通過如大腸桿菌等微生物得到,該菌株在染色體上至少含有一個(gè)met操縱子,即metL基因(編碼AKⅡ-HDⅡ)、metA基因(編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶)、metB基因(胱硫醚-γ-合酶)、metC基因(編碼胱硫醚-β-裂解酶)以及metE和metH基因(編碼高絲氨酸甲基化酶)。這些基因,包括其抗反饋?zhàn)冎?,以及任選地一種非自身的啟動子,可以根據(jù)一種和多種以上討論的一般方法和/或?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法引入到宿主微生物的染色體上。賴氨酸可以同樣地由微生物得到,該微生物含有編碼賴氨酸生物合成酶的基因(優(yōu)選地由lysC和/或dapA編碼的抗反饋賴氨酸生物合成酶)以及任選地一種非自身啟動子。
本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案涉及抗疏螺旋體素的細(xì)菌菌株在L-蘇氨酸生產(chǎn)的發(fā)酵方法中的應(yīng)用。優(yōu)選地,該疏螺旋體素抗性菌株是大腸桿菌菌株的突變株。這樣的突變株的特定優(yōu)選實(shí)施方案是大腸桿菌菌株kat-13,它于1996年6月28日被保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL),1815North University Street,Peoria,Illinois 61604,美國,保藏號NRRL B-21593。
疏螺旋體素抗性可以用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并公認(rèn)的任何一種方法來測定。例如,按照文獻(xiàn)G.Nass和J.Thomale,FEBS Lett,39:182-186(1974)中描述的方法,抗疏螺旋體素的菌株可以通過將候選菌株涂布到含大約139μM疏螺旋體素的最低培養(yǎng)基上分離得到。另外,特定菌株的疏螺旋體素抗性可以表現(xiàn)為一種或多種細(xì)胞表型特征的改變。例如,大腸桿菌菌株6-8的疏螺旋體素抗性突變株及其派生菌株呈圓形,而不是棒狀。在這樣的例子中,表型特征改變的證據(jù)足夠用以鑒別疏螺旋體素抗性菌株。
在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中有用的疏螺旋體素抗性突變株能夠產(chǎn)生蘇氨酸。編碼蘇氨酸生物合成酶的基因可能存在于染色體上或是在質(zhì)粒中,亦或存在于二者之上。也可能存在這些基因的多重拷貝。優(yōu)選地,編碼蘇氨酸生物合成酶的基因是抗弱化控制的和/或編碼抗反饋酶。
正如上面所提到的,這些創(chuàng)造性的疏螺旋體素抗性菌株根據(jù)需要可以含有一種或多種重組質(zhì)粒。例如,這些創(chuàng)造性的微生物可以含有編碼蘇氨酸生物合成酶的重組質(zhì)粒。這些創(chuàng)造性的細(xì)菌菌株同樣可以含有編碼其它參與蘇氨酸生物合成的酶,如天冬氨酸半醛脫氫酶(asd),或促生長的酶的重組質(zhì)粒。
另外,疏螺旋體素抗性菌株也可以根據(jù)需要加以修飾,例如為了增加蘇氨酸的產(chǎn)量、消除營養(yǎng)需求等等,可以使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知并可行的方法和技術(shù)。用于修飾疏螺旋體素抗性大腸桿菌突變株及其變株的合適方法的示范性例子包括,但不局限于利用紫外線或X-射線照射進(jìn)行誘變;或用化學(xué)誘變劑處理,如亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、甲基甲磺酸、氮芥等;基因整合技術(shù),如由轉(zhuǎn)化線性DNA片段和同源重組介導(dǎo)的技術(shù);以及由噬菌體如P1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知并有文獻(xiàn)描述,如J.H.Miller的《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》;J.H.Miller的《細(xì)菌遺傳學(xué)簡明教程》;M.Singer和P.Berg,的《基因與基因組》;J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》;P.B.Kaufman等的《生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的分子和細(xì)胞學(xué)方法手冊》;B.R.Glick和J.E.Thompson主編的《植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法》以及P.F.Smith-Keary的《大腸桿菌的分子遺傳學(xué)》。
優(yōu)選地,本發(fā)明的疏螺旋體素抗性突變株經(jīng)過修飾,使得位于編碼蘇氨酸生物合成酶的一種或多種基因的上游包括一種非自身的啟動子,啟動子與基因可操縱性地相連,而不論這些基因是在染色體上和/或是包含在質(zhì)粒中。
根據(jù)本發(fā)明這一實(shí)施方案的一個(gè)特定優(yōu)選方式,L-蘇氨酸是通過如上述在合成或天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一種疏螺旋體素抗性細(xì)菌菌株而得到的,該培養(yǎng)基含有至少一種碳源、至少一種氮源以及合適的無機(jī)鹽、生長因子等。積累的蘇氨酸可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何方法加以回收。
下面的例子僅僅是示范性的,并不意在限制由附加權(quán)利要求書規(guī)定的本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會很清楚,在不背離本發(fā)明的精神和范圍的條件下,本發(fā)明的方法中可以進(jìn)行不同的修飾和變化。因此,這意味著本發(fā)明涵蓋了這些修飾和變化,只要它們是在附加權(quán)利要求書和與其相等的文件的范圍之內(nèi)。
此處提及的所有專利和出版物都明確地引入作為參考。實(shí)施例1大腸桿菌菌株kat-13的制備A、將大腸桿菌菌株ATCC21277的蘇氨酸操縱子轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株472T23的染色體中大腸桿菌菌株ATCC21277(美國專利第3,580,810號)可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,12301parklalon Drive,Rockville,Maryland 20852,美國)得到,它是氨基-β-羥戊酸(AHV)抗性株,但在最低培養(yǎng)基中生長時(shí)需要脯氨酸、硫胺素、異亮氨酸和甲硫氨酸。據(jù)報(bào)道ATCC21277在發(fā)酵過程中積累6.20g/L蘇氨酸。ATCC21277的蘇氨酸操縱子包括一種編碼抗反饋酶的天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ基因(thrA),一種高絲氨酸激酶基因(thrB)和一種蘇氨酸合酶基因(thrC)。
大腸桿菌菌株472T23保藏于USSR抗生素研究所(USSR AntibioticsResearch Institute)的USSR商業(yè)微生物保藏中心(USSR Collection ofCommercial Microorganisms),保藏號為BKIIMB-2307,據(jù)報(bào)道它在含葡萄糖、氨、維生素B1和礦物鹽的最低培養(yǎng)基中生長時(shí)需要蘇氨酸和異亮氨酸。該菌株不能產(chǎn)生蘇氨酸,因?yàn)樗鼛в腥毕莸膖hrC基因,而該基因是蘇氨酸生物合成的必需基因。菌株472T23還帶有缺陷的蘇氨酸脫氨酶基因ilvA,它編碼異亮氨酸生物合成的第一個(gè)酶。
將噬菌體培養(yǎng)在ATCC21277上制備噬菌體P1的裂解產(chǎn)物。然后用該P(yáng)1裂解產(chǎn)物感染菌株472T23,其中少量的噬菌體顆粒攜帶ATCC21277的蘇氨酸操縱子。感染后,通過將細(xì)菌涂布在補(bǔ)充0.25g/L異亮氨酸的最低培養(yǎng)基E(葡萄糖0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,檸檬酸·H2O 2.0g/L,K2HPO410.0g/L,NaHNH4PO4·4H2O 3.5g/L,瓊脂15.0g/L)的瓊脂平板上,篩選合成蘇氨酸的細(xì)菌。數(shù)株帶有ATCC21277蘇氨酸操縱子的蘇氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)導(dǎo)子如今能夠在僅添加異亮氨酸的最低培養(yǎng)基平板上生長。
這些轉(zhuǎn)導(dǎo)子是按照下面實(shí)施例2的描述,通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生蘇氨酸篩選到的。其中一個(gè)產(chǎn)蘇氨酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)子G9被選作進(jìn)行進(jìn)一步菌株培育。
B、將帶有插入的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因的缺陷型蘇氨酸脫氫酶(tdh-)基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株G9的染色體中菌株CGSC6945帶有缺陷型蘇氨酸脫氫酶基因(tdh-),獲自美國耶魯大學(xué)的大腸桿菌基因儲存中心(E.coli Genetic Stock Center,335Osborne Memorial Laboratory,生物系,耶魯大學(xué),New Haven,Connecticut 06520-8104,美國)),該蘇氨酸脫氫酶是缺陷的,因?yàn)槠渲胁迦肓寺让顾匾阴^D(zhuǎn)移酶(cat)基因。為了將這個(gè)缺陷基因轉(zhuǎn)入G9,在CSCG6945上培養(yǎng)P1噬菌體,裂解產(chǎn)物用來感染G9。根據(jù)下面實(shí)施例2的描述,利用搖瓶發(fā)酵篩選到幾株產(chǎn)生蘇氨酸的氯霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子。其中一株G909的蘇氨酸產(chǎn)量比G9高,被選作進(jìn)行進(jìn)一步培育。
C、將一個(gè)非自身的啟動子插入到大腸桿菌菌株G909的染色體中為了將tac啟動子轉(zhuǎn)至G909染色體中,采用了線性DNA片段與一株外切核酸酶Ⅴ陰性的菌株(recD)的染色體之間的同源重組。
線性DNA片段含有1.5kb的蘇氨酸操縱子上游序列(5'端),一個(gè)卡那霉素抗性標(biāo)記,tac啟動子序列和大約480bp的thrA基因。這個(gè)提供5'端同源區(qū)、一個(gè)選擇性標(biāo)記(卡那霉素抗性)、一個(gè)對蘇氨酸操縱子(tac)的強(qiáng)且可控制的啟動子和3'端同源區(qū)的片段分別是按下述方法產(chǎn)生的。
利用λ克隆676的DNA,將野生型大腸桿菌W3110的蘇氨酸操縱子克隆到質(zhì)粒pUC19上的限制酶SphⅠ位點(diǎn)上。λ克隆676來自日本的Yuji Kohar博士,分子生物學(xué)系,科學(xué)院,Nagoya大學(xué),Chikusa-ku,Nagoya,日本)。然后用SphⅠ消化λ克隆676的DNA和pUC19。pUC19片段隨后用蝦堿性磷酸酶(SAP)去磷酸化并用瓊脂糖凝膠純化。來自λ克隆的6.9kb蘇氨酸操縱子片段也被純化。這兩個(gè)片段隨后用T4 DNA連接酶連接成為質(zhì)粒pAD103。
然后構(gòu)建了用于同源重組的上游側(cè)翼區(qū)和卡那霉素抗性標(biāo)記。將pAD103用限制性酶BstEⅡ、XbaⅠ消化并用Klenow片段處理形成平端。將只含有蘇氨酸操縱子5'端(上游)的1.5kb片段(而不是thr操縱子本身或它的控制區(qū))分離并連接到來自pUC4K(Pharmacia)的卡那霉素抗性基因片段上,pUC4K用限制性酶SalⅠ消化并用Klenow片段處理填補(bǔ)3'端冗余而形成中間質(zhì)粒pAD106。
pAD103也用限制性酶TaqⅠ消化并用Klenow片段處理形成平端,分離含有自身核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及約480bp的thrA基因編碼序列的片段,然后連接到pKK233-3片段上(Pharmacia)(pKK233-3事先經(jīng)限制性酶SmaⅠ消化并用SAP去磷酸化)得到質(zhì)粒pAD115,它含有tac啟動子的DNA序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和thr基因的數(shù)百堿基。
隨后pAD115用限制性酶BamHⅠ消化,將含有所需DNA序列的0.75kb DNA片段分離出來。pAD106也用BamHⅠ消化并用SAP去磷酸化。然后將這兩個(gè)片段連接起來形成質(zhì)粒pAD123,它含有蘇氨酸操縱子的上游DNA序列、卡那霉素抗性標(biāo)記基因、tac啟動子和thrA基因起始處大約480bp。
pAD123再用SpeⅠ和BglⅠ消化,將含有所需DNA序列的片段分離出來。
外切核酸酶Ⅴ陰性的菌株(recD)是將P1噬菌體培養(yǎng)在大腸桿菌菌株KW251(相關(guān)基因型argA81::Tn10,recD1014;來自Pharmacia)上制備的,該菌株含有recD基因,在argA上插入有一個(gè)可共轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子Tn10。來自噬菌體的裂解物再用于感染菌株G9,并將四環(huán)素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)子G9T7分離出來。
將來自質(zhì)粒pAD123的DNA片段用電穿孔法轉(zhuǎn)入大腸桿菌G9T7。分離到一株G9T7的抗卡那霉素菌株,將P1噬菌體在該菌株上生長獲得裂解物。P1噬菌體裂解物隨后用于轉(zhuǎn)導(dǎo)G909。分離到G909的一株卡那霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子tac3,其在搖瓶研究中存在IPTG時(shí)tac3的蘇氨酸產(chǎn)量更高。
隨后再用菌株tac3制備P1噬菌體裂解物并用于感染菌株6-8(如下所述)。篩選出卡那霉素抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)子,并從中分離出一株在搖瓶中比tac3的蘇氨酸產(chǎn)量更高的菌株6-8tac3。
D利用NTG誘變且從大腸桿菌菌株G909和6-8中分離疏螺旋體素抗性突變株按傳統(tǒng)的方法將菌株G909細(xì)胞用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理進(jìn)行誘變(50mg/L,30分鐘,36℃)。將所得細(xì)胞涂布在含0.25g/L異亮氨酸和0.1%(v/v)疏螺旋體素的最低培養(yǎng)基E瓊脂平板上。在36℃培養(yǎng)3-5天后,挑選平板上形成的包括菌株6-8的大菌落進(jìn)行疏螺旋體素抗性和L-蘇氨酸產(chǎn)生試驗(yàn)。
為試驗(yàn)疏螺旋體素抗性,每個(gè)菌株培養(yǎng)在20mL的種子培養(yǎng)基SM中(含32.5g/L葡萄糖;1g/L MgSO4·7H2O,24.36g/L K2HPO4,9.52g/LKH2PO4,5g/L(NFH4)2SO4,15g/L酵母提取物;pH7.2)36℃振蕩培養(yǎng)17小時(shí)。收獲細(xì)胞并用最低培養(yǎng)基E洗滌。細(xì)胞懸液再接種到含3mL最低培養(yǎng)基E的無菌試管中,管中分別含0、0.1、0.5或1mM疏螺旋體素。36℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后,在660nm測量光密度值以檢測細(xì)胞的生長。結(jié)果以相對于不含疏螺旋體素的生長量示于下表。
E、去除異亮氨酸需求和乳糖阻遏基因(lacI)通過引入非自身的tac啟動子和抗反饋thrA基因,thr操縱子(thrA、thrB、thrC)的表達(dá)不再受到弱化機(jī)理的控制。結(jié)果,蘇氨酸生產(chǎn)不再需要異亮氨酸饑餓和/或ilvA-營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的存在。
因此,野生型ilvA標(biāo)記由轉(zhuǎn)導(dǎo)引入6-8tac3以補(bǔ)償菌株對異亮氨酸的需求,即消除細(xì)胞生長對補(bǔ)加異亮氨酸培養(yǎng)基的需求。來自CGSC7334(相關(guān)基因型lacI42::Tn10,lacZU118;來自E.coli Genetic StockCenter,355 Osborne Memorial Laboratory,生物系,耶魯大學(xué),NewHaven,Connecticut 06520-8104,美國)的P1噬菌體裂解物用于感染6-8tac3,篩選出異亮氨酸生物合成陽性的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。在搖瓶試驗(yàn)中,這些轉(zhuǎn)導(dǎo)子產(chǎn)生和菌株6-8tac3大約相同數(shù)量的L-蘇氨酸。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)子中的一株,即6-8tac3ile+被選作進(jìn)一步培育。
因?yàn)?-8tac3ile的蘇氨酸操縱子處于tac啟動子的控制之下,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)對于誘導(dǎo)細(xì)胞完全表達(dá)thr操縱子是必需的。然而根據(jù)本發(fā)明的方法利用IPTG誘導(dǎo)thr操縱子的表達(dá)不是優(yōu)選的。
因此,為了消除這個(gè)不必要的調(diào)節(jié)障礙,通過來自CGSC7334的P1噬菌體感染6-8tac3ile+引入了缺陷型lac阻遏基因(lacI)。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)導(dǎo)子(6-8tac3lacI-)進(jìn)行了四環(huán)素抗性試驗(yàn),并篩選出四環(huán)素抗性克隆。實(shí)施例2蘇氨酸產(chǎn)生的搖瓶發(fā)酵研究根據(jù)不同的大腸桿菌菌株在搖瓶發(fā)酵時(shí)的表現(xiàn),測定了它們在蘇氨酸產(chǎn)生上的差異。供試菌株生長在LB瓊脂培養(yǎng)基上(10g/L胰蛋白胨、5g/L提取物、15g/L瓊脂)。生長1-2天后,將細(xì)胞懸浮在5mL種子培養(yǎng)基中(葡萄糖32.5g/L、K2HPO424.35g/L、KH2PO49.5g/L、酵母提取物15g/L、(NH4)2SO425g/L、MgSO4·7H2O 1g/L),pH7.2。種子以250轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度,37℃培養(yǎng)24小時(shí)。將15mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含葡萄糖40g/L、酵母提取物2g/L、檸檬酸2g/L、(NH4)2SO425g/L、MgSO4·7H2O 2.8g/L、CaCO320g/L、微量金屬溶液2mL)加到種子中,37℃、攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘繼續(xù)發(fā)酵。培養(yǎng)后,積累在培養(yǎng)液中的L-蘇氨酸的量用HPLC分析(ISCO和2353型泵,Rainin RI-1型分光指數(shù)檢測儀,和aminex HP87-CA柱)。
每個(gè)試驗(yàn)菌株產(chǎn)生的蘇氨酸的量示于下表
例3發(fā)酵研究本發(fā)明的大腸桿菌菌株和它們的前體菌株通過發(fā)酵測定L-蘇氨酸產(chǎn)量。
G909按下述條件測試。2L帶擋板搖瓶中裝0.5L液體培養(yǎng)基,其中含30g/L胰蛋白酶水解大豆液和5g/L酵母提取物,接種1.5mLG909并在搖瓶機(jī)上200轉(zhuǎn)/分鐘,35℃培養(yǎng)8.5小時(shí)。0.9mL(0.03%)成熟的種子加到含3.0L種子培養(yǎng)基的玻璃發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基含10g/L d.s.玉米漿,0.4g/L L-異亮氨酸,2.5g/L KH2PO4,2.0g/L MgSO4·7H2O,0.5g/L(NH4)2SO4,0.192g/L無水檸檬酸,0.03g/L FeSO4·7H2O,0.021MnSO4·H2O和80g/L葡萄糖)。培養(yǎng)按如下條件進(jìn)行前18小時(shí)溫度39℃,然后調(diào)至37℃;pH6.9(通過補(bǔ)加NH4OH維持);空氣流量3.5升/分;開始攪拌速度500轉(zhuǎn)/分鐘,隨后增加攪拌速度維持溶解氧(DO)在20%;反壓1-2psi。以葡萄糖耗盡作為種子罐發(fā)酵完成的指示。315mL(15%)種子罐中的成熟種子加到含相同培養(yǎng)基(主發(fā)酵罐培養(yǎng)基)的玻璃發(fā)酵罐中,培養(yǎng)基與上述相同,除了體積為2.1L并加入0.34g/L L-蘇氨酸。在下列條件下培養(yǎng)48小時(shí)溫度37℃,pH6.9(用NH4OH維持),空氣流量在前20小時(shí)為3.5升/分然后增加至4.0升/分,攪拌速度開始為500轉(zhuǎn)/分鐘,然后增加以維持DO在20%,反壓1-2psi,葡萄糖水平10g/L(通過補(bǔ)加50%w/w葡萄糖溶液維持)。發(fā)酵在48小時(shí)后結(jié)束。G909產(chǎn)生下列結(jié)果蘇氨酸終濃度62.3g/L、總產(chǎn)量為274g,得率為23.2%。
tac3在與上述G909相同的條件下測試,除了在主發(fā)酵罐期的開始加入1mg/L的IPTG。通過添加IPTG,tac3產(chǎn)生終濃度為85.7g/L的蘇氨酸,總產(chǎn)量為355g,得率為28.8%。
6-8在與上述G909相同的條件下測試。6-8產(chǎn)生下列結(jié)果蘇氨酸終濃度為74.1g/L,總產(chǎn)量為290g,得率為28.3%。
6-8tac3在與上述tac3相同的條件下測試,包括添加IPTG。6-8tac3產(chǎn)生下列結(jié)果蘇氨酸終濃度為99.3g/L,總產(chǎn)量為421g,得率為35.1%。
6-8tac3ile+在與上述6-8tac3相同的條件下測試,除了在種子罐期或主發(fā)酵罐期都不需要L-異亮氨酸。由于在22.5小時(shí)時(shí)攪拌失敗,只記錄了在22小時(shí)的濃度(62g/L蘇氨酸)。
Kat-13在與上述6-8tac3相同的條件測試,除了不加IPTG。在這些條件下,kat-13產(chǎn)生終濃度102g/L蘇氨酸,總產(chǎn)量445g,得率33.1%。
所構(gòu)建的菌株的相關(guān)基因型、蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)生所需的添加物和記錄的濃度值示于下表
Bor-R疏螺旋體素抗性ND未進(jìn)行NA失敗ptacthrABC處于tac啟動子控制之下的thrA、thrB和thrC基因。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法,包括下列步驟(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌菌株,以及(b)回收由所述大腸桿菌產(chǎn)生的L-蘇氨酸;其中所述大腸桿菌(ⅰ)在染色體上含有至少一種蘇氨酸(thr)操縱子,它與至少一種非自身啟動子可操縱地相連;以及(ⅱ)不需要任何含有一種或多種編碼一種或多種蘇氨酸生物合成酶基因的重組質(zhì)粒用于產(chǎn)生蘇氨酸。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述大腸桿菌能夠在大約30小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約50g/L的L-蘇氨酸。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述非自身啟動子選自tac啟動子、lac啟動子、trp啟動子、lpp啟動子、PL啟動子和PR啟動子。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述的蘇氨酸操縱子含有一種編碼抗反饋的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中所述的大腸桿菌為菌株kat-13。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中所述的非自身啟動子為tac啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中所述的大腸桿菌在染色體上含有一種缺陷型蘇氨酸脫氫酶基因。
8.權(quán)利要求1的方法,其中所述的蘇氨酸操縱子獲自ATCC 21277。
9.權(quán)利要求1的方法,其中所述的大腸桿菌為疏螺旋體素抗性。
10.一種制備大腸桿菌氨基酸產(chǎn)生菌株的方法,該菌株不帶有編碼一種或多種該氨基酸生物合成酶基因的重組質(zhì)粒,該方法包括以下步驟(a)將遺傳物質(zhì)從一種氨基酸產(chǎn)生菌引入到一種大腸桿菌菌株的染色體中;(b)將非自身啟動子在氨基酸生物合成基因的染色體位置之前插入到所述染色體中,并與該生物合成基因可操縱地相連以控制其表達(dá);以及(c)選擇性地從所述染色體上去除氨基酸生物合成的調(diào)控障礙和/或營養(yǎng)需求。
11.一種微生物大腸桿菌的菌株,具有下列特征(ⅰ)它的染色體含有至少一種蘇氨酸(thr)操縱子,其與至少一種非自身啟動子可操縱地相連,以及(ⅱ)不需要任何含有一種或多種編碼一種或多種蘇氨酸生物合成酶基因的重組質(zhì)粒用于產(chǎn)生蘇氨酸。
12.權(quán)利要求11的菌株,其中所述的蘇氨酸操縱子含有一種抗反饋的天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ基因(thrA)、一種高絲氨酸激酶(thrB)基因、一種蘇氨酸合酶基因(thrC)。
13.權(quán)利要求11的菌株,其中所述的大腸桿菌為菌株kat-13。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的菌株,其中所述的非自身啟動子為tac啟動子。
15.權(quán)利要求11的菌株,其中所述的大腸桿菌在染色體上含有一種缺陷型蘇氨酸脫氫酶基因。
16.權(quán)利要求11的菌株,其中所述的蘇氨酸操縱子來自ATCC 21277。
17.權(quán)利要求11的菌株,其中所述的大腸桿菌為疏螺旋體素抗性。
18.權(quán)利要求11的菌株,其中所述的大腸桿菌具有菌株NRRL B-21593的特征。
19.一種產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法,它包括以下步驟(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)疏螺旋體素抗性的大腸桿菌菌株,以及(b)回收由該大腸桿菌產(chǎn)生的L-蘇氨酸。
20.權(quán)利要求19的方法,其中所述的大腸桿菌能夠在大約30小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生至少約50g/L的L-蘇氨酸。
21.權(quán)利要求19的方法,其中所述的大腸桿菌含有至少一種蘇氨酸(thr)操縱子,其與至少一種非自身啟動子可操縱地相連。
22.權(quán)利要求21的方法,其中所述的蘇氨酸操縱子含有一種編碼抗反饋的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶的基因。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的方法,其中所述的大腸桿菌為菌株kat-13。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法,其中所述的非自身啟動子為tac啟動子。
全文摘要
本發(fā)明涉及大腸桿菌的新菌株和利用這些新菌株的發(fā)酵方法。本發(fā)明尤其涉及經(jīng)基因修飾的大腸桿菌菌株和它們在氨基酸特別是天冬氨酸族氨基酸成員,如蘇氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的大腸桿菌菌株的制備方法。
文檔編號C12N1/21GK1226931SQ97196897
公開日1999年8月25日 申請日期1997年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月30日
發(fā)明者M-D·王, J·S·布拉德沙瓦, S·L·斯維舍, H·J·利奧, P·D·哈克, T·P·賓德爾 申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭公司