專利名稱：一種測定腺苷脫氨酶的試劑及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定腺苷脫氨酶的試劑及其制法。
腺苷脫氨酶的活性測定方法主要包括放射核素法、電泳法和生化法。放射核素法靈敏度高，但需使用放射性核素，操作復(fù)雜，費用高，限制了該方法的臨床應(yīng)用，電泳法多用于腺苷脫氨酶同工酶的活性測定，由于電泳法測定時間較長，操作繁瑣，不宜自動化，難以對大量樣本進行測定，因此，臨床上大多采用生化法。在生化法中，主要包括氨偶聯(lián)酶測定法和次黃苷生成率測定法。次黃苷生成率測定法是于250nm波長處直接測定腺苷脫氨酶分解腺苷產(chǎn)生的次黃嘌呤核苷，由于其吸收峰與腺苷吸收峰部分重合，故靈敏度低，準(zhǔn)確度差。氨偶聯(lián)酶測定法是通過偶聯(lián)的谷氨酸脫氫酶測定腺苷脫氨酶分解腺苷產(chǎn)生的氨。在傳統(tǒng)的試劑配制過程中，需要加入氫氧化鈉并煮沸去氨，以提高測定的準(zhǔn)確度。在保存過程中，試劑容易發(fā)生生環(huán)境中氨污染，降低試劑的測定性能。本發(fā)明采用內(nèi)源性慢反應(yīng)酶循環(huán)機制不斷排除試劑中污染的氨，從而無需煮沸去氨，并在試劑保存過程中，該機制能不間斷地排除氨污染，穩(wěn)定和提高了試劑的測定性能。
在腺苷脫氨酶及其同工酶活力的氨偶聯(lián)酶測定法中，采用還原型煙酰胺輔酶或其類似物(如NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH)測定體液樣本中的腺苷脫氨酶及其同工酶是一個較為常用的方法，試劑中還原型煙酰胺輔酶或其類似物的氧化程度，與樣本中被測物的濃度成正比。根據(jù)樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶的活力，采用相應(yīng)的酶反應(yīng)機制，經(jīng)過酶與底物反應(yīng)，試劑中還原型煙酰胺輔酶或其類似物被氧化，反應(yīng)系統(tǒng)的吸光度發(fā)生變化，通過測定反應(yīng)系統(tǒng)的吸光度變化值，就可計算出樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶的濃度。
血清、血漿或體液樣本中總腺苷脫氨酶活力的測定樣本中總腺苷脫氨酶分解腺苷產(chǎn)生的次黃嘌呤核苷和氨，氨在谷氨酸脫氨酶作用下與a-酮戊二酸反應(yīng)生成谷氨酸鹽，同時NADH或NADPH被氧化為NAD+或NADP+，反應(yīng)系統(tǒng)在340nm處吸光度的下降值，就可以計算出樣本中總腺苷氨酶的活力。
血清、血漿或體液樣本中腺苷脫氨酶同工酶活力的測定原理與測定總腺苷脫氨酶活力的方法相同，在測定腺苷脫氨酶同工酶活力時，通過在試劑中加入腺苷脫氨酶同工酶1和腺苷脫氨酶同工酶1+cp的強抑制劑，如紅-9-(2-羥基-3-壬烷)烷腺嘌呤(EHNA)，再測定腺苷脫氨酶同工酶2的活力。總腺苷脫氨酶的活性減去腺苷脫氨酶同工酶2的活性即為腺苷脫氨酶同工酶1和腺苷脫氨酶同工酶同工酶1+cp的活性。
但是由于試劑制造過程和環(huán)境中大量的氨污染，以及還原型煙酰胺輔酶或其類似物，特別是NADH和NADPH在這類酶試劑中不穩(wěn)定，實際應(yīng)用中只能采用干粉或凍干試劑。干粉或凍干試劑通過保持試劑的干燥狀態(tài)，試劑的水分含量一般低于20％，以保持NADH或NADPH的穩(wěn)定，試劑在復(fù)溶時采用煮沸去氨的復(fù)溶水，復(fù)溶后需立刻測定。
還原型煙酰胺輔酶在液體試劑的應(yīng)用中，Joseph De Giorgio等(參見美國專利5804402和5705356)發(fā)明了在測定試劑中加入NADH或NADPH的穩(wěn)定酶系統(tǒng)，如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及其非專一性底物葡萄糖，將試劑保存過程中NADH或NADPH被氧化生成的NAD或NADP再緩慢還原為NADH或NADPH，從而達到排除氨污染，保持測定試劑中有效還原型煙酰胺輔酶濃度的目的。在他們的發(fā)明中，測定試劑生產(chǎn)或配制時不加入反應(yīng)產(chǎn)物NAD或NADP，仍然按照傳統(tǒng)的試劑生產(chǎn)或配制方法，加入NADH或NADPH，嵌入的再生酶系統(tǒng)僅僅用于NADH或NADPH氧化后的單向再生，并不生成新的NADH或NADPH。此外，這一發(fā)明中，Joseph De Giorgio等也未提出利用反應(yīng)產(chǎn)物生產(chǎn)測定試劑的方法；也未提出測定腺苷脫氨酶的試劑。
Richard A.Kaufman等(參見美國專利5589348)利用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及其專一性底物葡萄糖-6-磷酸，在試劑測定過程中原位同時或先于測定樣本快速生成還原型輔酶，用于被測物的測定。在他們的發(fā)明中，還原型煙酰胺輔酶的生成速率必需大于被測物酶系統(tǒng)再氧化的速率。被測物測定是在生成還原型輔酶的同時或以后進行的，試劑中葡萄糖-6-磷酸的摩爾濃度必須低于用于生成還原型輔酶的氧化型輔酶的摩爾濃度，因此這類測定試劑配制成反應(yīng)試劑后，生成的NADH或NADPH與普通測定試劑中一樣不穩(wěn)定，試劑保存過程中同樣不能排除氨污染。在他們的發(fā)明中，相對于被測物酶系統(tǒng)將還原后的輔酶再氧化的速率，生成還原型輔酶的速率不可能以絕對快的速率完成，因此，測定樣本中被測物含量時需要測定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本進行對照計算，從而求出樣本中被測物的含量。采用這一方法在實際應(yīng)用中很難對體液樣本中的酶含量進行測定。
本發(fā)明是在測定試劑生產(chǎn)或配制時加入輔酶或其類似物的反應(yīng)產(chǎn)物，如NAD、NADP、thioNAD或thioNADP，及其慢反應(yīng)酶和底物，形成慢反應(yīng)酶-底物-NAD、酶-底物-thioNAD、酶-底物-NADP或酶-底物-thioNADP等系統(tǒng)。測定試劑中有效的NADH、thio-NADH、NADPH或thio-NADPH含量是由該系統(tǒng)生成的同時該系統(tǒng)由于不斷生成測定所需的還原型輔酶或其類似物，從而大大提高了試劑的穩(wěn)定性，測定試劑配制完成后及保存過程中，內(nèi)部嵌入的慢反應(yīng)酶系統(tǒng)能不斷排除試劑內(nèi)和環(huán)境中的氨污染，提高試劑測定的準(zhǔn)確度。
本發(fā)明同時首次提出了一種利用反應(yīng)產(chǎn)物逆向生成原反應(yīng)物的測定腺苷脫氨酶及其同工酶的試劑生產(chǎn)方法。
本發(fā)明同時公開了一種節(jié)約和改良的測定腺苷脫氨酶及其同工酶試劑的配制和生產(chǎn)方法，由于試劑生產(chǎn)配制時不使用NADH、NADPH、thio-NADPH或其類似物，從而大降低了試劑的原料成本。
本發(fā)明同時公開了一種改良的測定腺苷脫氨酶及其同工酶的試劑，該試劑能不斷地排除試劑內(nèi)和環(huán)境中發(fā)生的氨污染。
根據(jù)本發(fā)明的原理，試劑測定中可以采用的還原型輔酶或其類似物的生成系統(tǒng)很多，包括葡萄糖脫氫酶-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶-丙酮酸-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶-甘油-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、以及(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)等。為了有效地降低還原型煙酰胺輔酶或其類似物的生成速率，不影響試劑的測定性能，可以對上述生成系統(tǒng)中的酶和底物及其濃度進行高速使其生成還原型煙酰胺輔酶或其類仿物的速率在測定被測物時不影響還原型煙酰胺輔酶或其類似物的氧化速率。例如，葡萄糖脫氫酶-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶-甘油-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)可調(diào)整為甘油脫氫酶-乙二醇-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、以及(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)可調(diào)整為(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)等?？紤]到測定樣本時樣本中可能含有的底物物質(zhì)影響到還原型煙酰胺輔酶或其類似物的生成速率，進而影響被測物的測定反應(yīng)，上述各系統(tǒng)中優(yōu)先選用的系統(tǒng)為甘油脫氫酶-乙二醇-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)和(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)，最為優(yōu)先選用的系統(tǒng)為(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)。以下以(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)為例，進一步闡述本發(fā)明試劑的原理和制法。
本發(fā)明中的還原型輔酶或其類似物生成系統(tǒng)生成的還原型輔酶在達到一定的濃度后，即可與試劑其它測定成分一起進行被測物的濃度測定，此時還原型輔酶或其類似物生成系統(tǒng)可以已經(jīng)完全完成了還原型輔酶或其類似物的生成反應(yīng)，也可以仍在繼續(xù)生成還原型輔酶或其類似物。這一特點保證了采用本發(fā)明可以配制或生產(chǎn)出單一穩(wěn)定的液體試劑。本發(fā)明中的還原型輔酶或其類似物生成系統(tǒng)生成還原型輔酶或其類似物的速率可以是任何不干擾測定反應(yīng)的速率，可以采用的生成有效還原型煙酰胺輔酶或其類似物的濃度的速率在0.001-365天內(nèi)之間，生成的還原型輔酶或其類似物的吸光度在0.5-5.0范圍之內(nèi)(340nm或405nm波長，光徑10mm)；生成速率小于0.001天，生成系統(tǒng)會影響測定系統(tǒng)的測定性能，生成速率大于365天，測定試劑的配制非常困難。更為合適的生成速率是在1-30天之內(nèi)，生成的還原型輔酶或其類似物的吸光度為0.8-3.0(波長340nm或405nm，光徑10nm)；優(yōu)先采用的生成速率是在1-7天內(nèi)，生成的還原型輔酶的吸光度為1.1-2.8，波長340nm或405nm，光徑10mm。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的濃度范圍在100-100000U/L之間，更為合適的范圍在1000-10000U/L之間，優(yōu)先選用的范圍在2000-8000U/L范圍之間。葡萄糖濃度的選擇范圍較大，較為合適的范圍在1-500nM之間，優(yōu)先選用的范圍在10-200mM之間。氧化型輔酶或其類似物較為合適的濃度范圍在0.05-0.85mM之間，優(yōu)先選用的范圍在0.20-0.50mM之間。
a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，二磷酸腺甘鉀鹽2mM(0.2-20mM)谷氨酸脫氫酶(牛肝來源)3500U/L(500-10000U/L)NAD0.6mM(0.15-1.2mM)D-葡萄糖40mM(10-200mM)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(明串珠菌屬)3700U/L(500-10000U/L)磷酸二氫鉀5mM(2-100mM)EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.2-20mM)疊氮鈉7.0mM(1-10mM)根據(jù)上述配制試劑溶液的方法，以上試劑配制完成后，置2-8℃1-7天，試劑空白吸光度≥1.20，340m，10mm光徑。
試劑2Tris緩沖液100mM，(50-200mM)，最終反應(yīng)試劑PH7.4，37℃，a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，腺苷2mM(0.2-20mM)谷氨酸脫氫酶(牛肝來源)3500U/L(500-10000U/L)EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.2-20mM)甘露糖醇55mM(10-100mM)疊氮鈉7.0mM(1-10mM)根據(jù)上述配制試劑溶液的方法，配置試劑2，置2-8℃保存。測定樣本時，采有兩點法，試劑1樣本試劑2的比例為200∶20∶100，溫度37℃，試劑1加樣本或校準(zhǔn)品后在測定溫度孵育300秒，除去樣本中的氨，加入試劑2開始測定，延遲時間0秒，測定時間300秒，讀數(shù)在測定時間內(nèi)選擇2個有效點。實施例2總腺苷脫氨酶液體單試劑Tris緩沖液100mM，(50-200mM)，PH7.4，37℃，a-酮戊二酸7.5mM，(1-20mM)牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，二磷酸腺苷鉀鹽2.5mM(0.5-20mM)腺苷2mM(0.2-20mM)谷氨酸脫氫酶(牛肝來源)4500U/L(500-10000U/L)NADP0.45mM(0.15-1.2mM)D-葡萄糖40mM(010-200mM)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(明串珠菌屬)3700U/L(500-10000U/L)磷酸二氫鉀5mM(2-100mM)EDTA.Na2.2H2O1.5mM(0.2-20mM)疊氮鈉7.0mM(1-10mM)
根據(jù)上述配制試劑溶液的方法，配置試劑2，置2-8℃1-7天。試劑空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光徑。測定樣本時，采有兩點法，試劑1∶15，溫度37℃，延遲時間0秒，除去樣本中的氨，測定時間300秒，讀數(shù)在測定時間內(nèi)選擇2個有效點。實施例3腺苷脫氨酶同工酶同工酶2液體雙試劑試劑1Tris緩沖液100mM，(50-200mM)，PH8.2，37℃，a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，二磷酸腺苷鉀鹽2mM(0.2-20mM)谷氨酸脫氫酶(牛肝來源)3500U/L(500-10000U/L)NADP0.45mM(0.15-1.2mM)EHNA0.15mM(0.05-0.5mM)D-葡萄糖40mM(10-200mM)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(明串珠菌屬)3700U/L(500-10000U/L)磷酸二氫鉀5mM(2-100mM)EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.2-20mM)疊氮鈉7.0mM(1-10mM)根據(jù)上述配制試劑溶液的方法，以上試劑配制完成后，置2-8℃ 1-7天。試劑空白吸光度≥1.20，340m，10mm光徑。
試劑2Tris緩沖液100mM，(50-200mM)，最終反應(yīng)試劑PH7.4，37℃，a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，腺苷2mM(0.2-25mM)谷氨酸脫氫酶(牛肝來源)3500U/L(500-10000U/L)EDTA.Na2.2H2O1.5mM(0.2-20mM)甘露糖醇55mM(10-100mM)疊氮鈉7.0mM(1-10mM)根據(jù)上述配制試劑溶液的方法，配置試劑2，置2-8℃保存。測定樣本時，采有兩點法，試劑1樣本試劑2的比例為200∶20∶100，溫度37℃，試劑1加樣本或校準(zhǔn)品后在測定溫度孵育300秒，除去樣本中的氨，加入試劑2開始測定，延遲時間0秒，測定時間300秒，讀數(shù)在測定時間內(nèi)選擇2個有效點。
實施例4腺苷脫氨酶同工酶2液體單試劑Tris緩沖液100mM，(50-200mM)，PH7.4，37℃，a-酮戊二酸7.5mM，(1-20mM)牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，二磷酸腺苷鉀鹽2.5mM(0.5-20mM)
腺苷12.5mM(1-25mM)谷氨酸脫氫酶(牛肝來源)4500U/L(500-10000U/L)NADP0.45mM(0.15-1.2mM)EHNA0.1mM(0.05-0.5mM)D-葡萄糖4 0mM(0.05-200mM)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(明串珠菌屬)3700U/L(500-10000U/L)磷酸二氫鉀5mM(2-100mM)EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.5-20mM)疊氮鈉7.0mM(1-10mM)根據(jù)上述配制試劑溶液的方法，配置試劑2，置2-8℃1-7天。試劑空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光徑。測定樣本或校準(zhǔn)品時，采有兩點法，樣本試劑比為1∶15，溫度37℃，延遲時間300秒，除去樣本中的氨并抑制腺苷脫氨酶1和腺苷脫氨酶1+cp，測定時間300秒，讀數(shù)在測定時間內(nèi)選擇2個有效點。
上述舉例1-舉例4試劑配制完成后，其應(yīng)用方法與相關(guān)領(lǐng)域中的普通試劑應(yīng)用方法相同，在此不再贅述。
上述舉例1-舉例4試劑的配制方法僅用于說明本發(fā)明的原理及其應(yīng)用，本發(fā)明絕不局限于上述舉例的應(yīng)用范圍；此外，在發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的專業(yè)技術(shù)人員，可以根據(jù)本發(fā)明的原理和方法配制出與之類似的各種測定試劑，但并不脫離出本發(fā)明的原理和應(yīng)用范圍。
權(quán)利要求
1.一種測定腺苷脫氨酶的試劑，其特征在于采用氨偶聯(lián)酶法，應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制測定試劑，包含其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)慢反應(yīng)系統(tǒng)。如葡萄糖脫氫酶-木糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶-a-酮戊二酸-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶-乙二醇-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物系統(tǒng)、(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶。如NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH等，對體液樣本中腺甘脫氨酶及其同工酶活力進行測定的酶法測定試劑。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物酶反應(yīng)系統(tǒng)生成有效的NADH或其類似物濃度的速率在0.001-365天之內(nèi)，最好在1-7天之內(nèi)。
2，一種測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于嵌入慢反應(yīng)酶-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物，緩慢生成還原性煙酰胺輔酶或其類似物的酶反應(yīng)系統(tǒng)，和利用生成的還原性煙酰胺輔酶或其類似物，如NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH等，對體液樣本中腺甘脫氨酶及其同工酶活力進行測定的酶法測定試劑。
3，如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物酶反應(yīng)系統(tǒng)生成有效的NADH或其類似物濃度的速率在0.001-365天之內(nèi)，最好在1-7天之內(nèi)。
4.如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的有效NADH濃度的吸光度在0.5-5.0之間，波長340nm，光徑10mm。最好在1.0-2.5之間，波長340nm，光徑10mm。11、如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物酶反應(yīng)系統(tǒng)生成有效NADPH濃度的速率在0.001-365天之內(nèi)，最好在1-7天之內(nèi)。
5.如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的有效NADPH濃度的吸光度在0.5-5.0之間，波長340nm，光徑10mm。最好在1.0-2.5之間，濾長340nm，光徑10mm。
6.如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-葡萄糖-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物酶反應(yīng)系統(tǒng)生成有效thio-NADH濃度的速率在0.001-365天之內(nèi)，最好在1-7天之內(nèi)。
7.如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的有效thio-NADH的濃度吸光度在0.5-5.0之間，波長405nm，光徑10mm。最好在1.0-2.5之間，波長405nm，光徑10mm。
8.如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)-氧化型煙酰胺輔酶或其類似物酶反應(yīng)系統(tǒng)生成有效thio-NADPH濃度的速率在0.001-365天之內(nèi)，最好在1-7天之內(nèi)。
9.如權(quán)利要求2所述測定腺苷脫氨酶的試劑的制法，其特征在于所指的有效thio-NADPH濃度的吸光度在0.5-5.0之間，波長405nm，光徑10mm。最好在1.0-2.5之間，波長405nm，光徑10mm。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于采用氨偶聯(lián)酶法，應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制測定試劑，用于測定體液樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的酶法測定試劑。本發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶－底物－NAD或酶－底物－NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，本發(fā)明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。
文檔編號C12Q1/32GK1456679SQ0312809
公開日2003年11月19日 申請日期2003年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者顏簫 申請人:江西特康科技有限公司