專利名稱：前列腺癌相關(guān)基因和多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及癌癥研究領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及與前列腺癌相關(guān)的新基因A5736(MICAL2-PV)和D4493(PCOTH)所編碼的新的多肽。另外，本發(fā)明涉及新基因A5736(MICAL2-PV)。本發(fā)明的基因和多肽可用于，例如診斷前列腺癌、作為研發(fā)抗該疾病藥物的靶分子以及減弱前列腺癌的細(xì)胞生長。
背景技術(shù)：
前列腺癌是西方國家男性中最常見的癌癥之一(Gronberg，Lancet 361859-64(2003))。發(fā)達(dá)國家的前列腺癌發(fā)生率穩(wěn)步增加，這是由于西式飲食的流行以及老年人數(shù)目的增加。通過檢測血清中前列腺特異性抗原(PSA)進(jìn)行的早期診斷提供了外科治療的機(jī)會，并且顯著改善了前列腺癌的預(yù)后。然而，經(jīng)根治性前列腺切除術(shù)(radical prostatectomy)治療的患者中，有30％的患者復(fù)發(fā)了癌癥(Han等，J Urol 166416-9(2001))。多數(shù)復(fù)發(fā)的或晚期癌癥對雄性激素削減療法(androgen ablation therapy)有反應(yīng)，因?yàn)榍傲邢侔┰诔跏茧A段的生長是雄性激素依賴性的。但是，多數(shù)用該療法治療的患者最終發(fā)展為雄性激素非依賴性疾病，因此對該療法不再有反應(yīng)。前列腺癌最嚴(yán)重的臨床問題是雄性激素非依賴性的前列腺癌對任何其它療法都沒有反應(yīng)(Gronberg，Lancet 361859-64(2003))。因此，建立一種不同于雄性激素削減療法的新前列腺癌療法是治療前列腺癌的迫切問題。
cDNA微陣列技術(shù)使得能獲得正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞中基因表達(dá)的分布圖，并能比較惡性細(xì)胞和相應(yīng)正常細(xì)胞中的基因表達(dá)(Okabe等，Cancer Res612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 627012-7(2002))。這種方法能揭示癌細(xì)胞的復(fù)雜性質(zhì)，有助于理解致癌機(jī)制。鑒別出腫瘤中不受調(diào)節(jié)的基因能對受試者癌癥進(jìn)行更精密和更準(zhǔn)確的診斷，能發(fā)展新的治療靶位(Bienz and Clevers，Cell 103311-20(2000))。為了從基因組水平揭示腫瘤的機(jī)理，以及發(fā)現(xiàn)用于診斷和研發(fā)新治療藥物的靶分子，本發(fā)明人利用含23040個基因的cDNA微陣列分析了腫瘤細(xì)胞的表達(dá)分布圖(Okabe等，Cancer Res 612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 627012-7(2002))。
設(shè)計用來揭示致癌機(jī)制的研究已經(jīng)促進(jìn)了抗腫瘤試劑分子靶的鑒定。例如，法尼酰轉(zhuǎn)移酶(famexyltransferase)(FTI)抑制劑用于在動物模型中有效治療Ras依賴性腫瘤，而它最初是被研制用于抑制Ras相關(guān)的生長信號通路，Ras的激活依賴于翻譯后的法尼基化(posttranslational farnesylation)(He等，Cell 99335-45(1999))。已對人體進(jìn)行臨床試驗(yàn)用抗腫瘤藥物和抗HER2單克隆抗體曲妥單抗的組合物來拮抗原癌基因受體HER2/neu，并明顯改善了臨床反應(yīng)和乳腺癌患者的總存活率(Lin等，Cancer Res 616345-9(2001))。選擇性滅活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-157，被研制用來治療慢性髓細(xì)胞性白血病，該疾病中bcr-abl酪氨酸激酶的組成型活化對白細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起決定性作用。這些類型的試劑被設(shè)計用來抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，在癌性細(xì)胞中通常上調(diào)的基因產(chǎn)物可作為研發(fā)新的抗癌試劑的潛在靶點(diǎn)。事實(shí)上，已證實(shí)針對異常表達(dá)的、導(dǎo)致癌癥生長和發(fā)展的分子的新藥物對某些類型的癌癥有效。這種藥物包括治療乳腺癌的赫賽汀(Herceptin)，治療CML的Glivec(STI571)和治療非小細(xì)胞型肺癌的Iressa(ZD1839)。
已知一些分子在前列腺癌中過量表達(dá)并被確定為前列腺癌的治療靶點(diǎn)或標(biāo)志物(Xu等，Cancer Res 606568-72(2000)；Luo等，Cancer Res 622220-6(2002))。然而，它們中的大多數(shù)在其它主要器官中同樣高表達(dá)。因此，靶向這些分子的試劑對癌細(xì)胞有毒，但對其它器官的正常生長細(xì)胞同樣有不利的影響。
已證明CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)識別來自MHC I類分子呈遞的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽，并溶解腫瘤細(xì)胞。自從發(fā)現(xiàn)MAGE家族作為TAA的第一個實(shí)例，用免疫學(xué)方法已發(fā)現(xiàn)了許多其它的TAA(Boon，Int JCancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J ExpMed 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))。一些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TAA目前正處于作為免疫治療靶點(diǎn)的臨床開發(fā)階段。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad SciUSA 941914-8(1997))。另一方面，已證實(shí)的在腫瘤細(xì)胞中尤其過表達(dá)的基因產(chǎn)物可作為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的靶點(diǎn)而被識別。這種基因產(chǎn)物包括p53(Umano等，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，Brit JCancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int J Cancer 8092-7(1999))等等。
盡管在關(guān)于TAA的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了重要的進(jìn)展(Rosenbeg等，Nature Med 4321-7(1998)；Mukherji等，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 562479-83(1996))，只有有限數(shù)量的候選TAA能治療腺癌，包括結(jié)腸直腸癌。在癌細(xì)胞中大量的表達(dá)，同時其表達(dá)限制在癌細(xì)胞內(nèi)的TAA是有希望的免疫治療靶點(diǎn)的候選物(candidate)。此外，對誘導(dǎo)有效且特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的新型TAA的鑒定被預(yù)期能夠促進(jìn)肽接種策略在多種類型癌中的臨床使用(Boon and can der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，JExp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998)；Chen等，Proc Natl Acad Sci USA941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield等，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers等，Cancer Res 595554-9(1999)；vander Burg等，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka等，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie等，Int J Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi等，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso等，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已有報道重復(fù)指出，來自具體健康供體的肽刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)對該肽產(chǎn)生響應(yīng)而產(chǎn)生顯著水平的IFN-γ，但在鉻-51釋放試驗(yàn)中幾乎不以HLA-A24或-A0201限制性圖譜發(fā)揮針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(Kawano等，Cance Res 603550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均為一種在日本人以及高加索人中常見的HLA等位基因(Date等，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo等，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen 49129(1997))。因此，由這些HLA所呈遞的癌抗原肽特別適用于治療日本人和高加索人中的癌癥。此外，已知在體外誘導(dǎo)低親和力CTL通常是使用高濃度肽的結(jié)果，所述高濃度肽的使用在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上生成高水平特異性肽/MHC復(fù)合物，所述復(fù)合物將有效激活這些CTL(Alexander-Miller等，Proc Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
發(fā)明概述為揭示前列腺癌的機(jī)理、鑒定新的診斷標(biāo)志物和/或藥物靶點(diǎn)以治療這些腫瘤，本發(fā)明人聯(lián)合利用全基因組cDNA微陣列以及激光微束顯微解剖技術(shù)分析了前列腺癌中的基因表達(dá)分布圖。從藥理學(xué)角度來說，實(shí)踐中抑制致癌信號以激活腫瘤抑制效應(yīng)物更容易。因此，本發(fā)明人搜索在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的基因。
結(jié)果，鑒定了2種在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的具體基因PCOTH和MICAL2-PV。而且，通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)降低PCOTH(前列腺膠原三螺旋(prostate collagen triple helix)或MICAL2-PV(MICAL2(與CasL相互作用的分子2(Molecule Interacting with CasL 2))前列腺癌變體)的表達(dá)抑制了前列腺癌細(xì)胞的生長。
PCOTH編碼一個100個氨基酸的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含一個膠原三螺旋重復(fù)，且其外源性產(chǎn)物位于細(xì)胞膜上。Northern印跡分析顯示，PCOTH的表達(dá)局限在睪丸和前列腺中。
另外，MICAL2-PV的表達(dá)也局限于睪丸中。MICAL2-PV編碼的蛋白包含與calponin結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域，calponin是肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它重復(fù)(in duplicate)存在于包括抗肌萎縮蛋白(dystrophin)和α-輔肌動蛋白(actinin)在內(nèi)的血影蛋白樣蛋白(spectrin-like protein)的N末端。因此，預(yù)計MICAL2-PV編碼的蛋白與肌動蛋白或其它微管相互作用。這些結(jié)構(gòu)域使肌動蛋白絲交聯(lián)成束或網(wǎng)。有報道另一家族成員MICAL1與波形蛋白(vimentin)(Suzuki等，J Biol Chem 27714933-41(2002))和rabl(Weide等，Biochem Biophys Res Commun 30679-86(2003))結(jié)合，后兩者是作為支架蛋白連接細(xì)胞內(nèi)不同成分的中間絲(intermediated filament)及細(xì)胞骨架(cytoskelton)的主要成分。預(yù)期MICAL2-PV與前列腺癌細(xì)胞中細(xì)胞骨架構(gòu)建以及細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。
許多抗癌藥物不僅對癌細(xì)胞有毒性，對正常生長的細(xì)胞也有毒性。然而抑制MICAL2-PV或PCOTH表達(dá)的試劑可能不會對其它器官有不良的影響，這是由于正常MICAL2-PV的表達(dá)局限于睪丸，PCOTH局限于睪丸和前列腺，因此對于治療或預(yù)防前列腺癌有重要意義。
因此，本發(fā)明提供了分離的基因MICAL2-PV和PCOTH作為前列腺癌的候選診斷標(biāo)志物以及有希望的潛在靶點(diǎn)，來研發(fā)診斷新策略及有效抗癌試劑。此外，本發(fā)明還提供了這些基因編碼的多肽，所述多肽的制備方法及其應(yīng)用。更具體，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容本申請?zhí)峁┝诵碌娜祟惗嚯腗ICAL2-PV和PCOTH，或其功能等價物，所述多肽或其功能等價物的表達(dá)在前列腺癌細(xì)胞中提高。
一個優(yōu)選實(shí)施方案中，MICAL2-PV多肽包括由SEQ ID NO3的開放閱讀框編碼的推定的976個氨基酸，或由SEQ ID NO5的開放閱讀框編碼的推定的955個氨基酸。MICAL2-PV多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO4或6所示的氨基酸序列。本申請還提供了分離的蛋白，它由至少一部分MICAL2-P多核苷酸序列編碼，或由與SEQ ID NO3或5所示序列至少15％更優(yōu)選至少25％互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼。
另一方面，一個優(yōu)選實(shí)施例中，PCOTH多肽含SEQ ID NO2(GenBank登錄號AB113650)所示的推定的100個氨基酸。PCOTH由SEQ ID NO1的開放閱讀框編碼并包含膠原三螺旋重復(fù)(

圖1(C))。本申請還提供了分離的蛋白，由至少一部分PCOTH多核苷酸序列編碼，或由與SEQ ID NO1(LOC221179(XP_167955))所示序列至少30％更優(yōu)選至少40％互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼。
本發(fā)明還提供了新的人類基因MICAL2-PV，其在大多數(shù)前列腺癌中的表達(dá)相對于其在相應(yīng)非癌性前列腺導(dǎo)管上皮(duct epithelium)細(xì)胞中的表達(dá)顯著提高。分離的MICAL2-PV基因包括SEQ ID NO3或5所示的多核苷酸序列。具體地，MICAL2-PVcDNA包括含有2928個核苷酸的開放鬩讀框的6805個核苷酸(SEQ ID NO3)，或含有2865個核苷酸的開放閱讀框的6742個核苷酸(SEQ ID NO5)。本發(fā)明還包括與SEQ ID NO3或5所示的多核苷酸序列雜交、并與所述序列的至少30％、更優(yōu)選至少40％互補(bǔ)的多核苷酸，使得它們編碼MICAL2-PV蛋白或其功能等價物。這種多核苷酸的實(shí)例為SEQ ID NO3或5所示序列編碼的MICAL2-PV的簡并變體和等位基因突變體。
此外，本發(fā)明提供了分離的、編碼新的人類蛋白PCOTH的多核苷酸，它在大多數(shù)前列腺癌中的表達(dá)相對于其在相應(yīng)的非癌性前列腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中的表達(dá)也顯著提高。該分離的多核苷酸編碼由SEQ ID NO2所示的100個氨基酸組成的多肽。更具體地，該分離的多核苷酸包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的332-631核苷酸。本發(fā)明還包括與SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列雜交并與所述序列的至少30％、更優(yōu)選至少40％互補(bǔ)的多核苷酸，使得它們編碼PCTOH蛋白或其功能等價物。這種多核苷酸的實(shí)例為SEQ ID NO1所示序列的簡并變體和等位基因突變體。
本文中，分離的基因指多核苷酸，其結(jié)構(gòu)與任何天然存在的多核苷酸不相同，或與任何天然存在基因組多核苷酸的跨3個或3個以上分隔基因的片段不相同。因此，該術(shù)語包括，例如(a)DNA，它具有生物體基因組中天然存在的天然基因組DNA分子的部分序列，其中所述DNA天然存在于所述生物體中；(b)插入載體或插入原核或真核生物基因組DNA中的多核苷酸，該插入方式使獲得的分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不相同；(c)分離的分子，如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段或限制性酶切片段；和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因(即編碼融合蛋白的基因)的一部分。
因此，一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述多肽或其片段的分離的多核苷酸。優(yōu)選，該分離的多核苷酸包括與SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更優(yōu)選，該分離的核酸分子與SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列的同一性為至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。當(dāng)分離的多核苷酸比參照序列(例如SEQ ID NO1，3或5)的長度更長或者相同時，所述比較是以參照序列的全長進(jìn)行的。當(dāng)分離的多核苷酸比參照序列(例如SEQ ID NO1，3或5)短，所述比較是以參照序列的相同長度的片段進(jìn)行的(排除同源性計算所需的任何環(huán)(loop))。
本發(fā)明還提供了制備蛋白質(zhì)的方法，其通過用編碼MICAL2-PV或PCOTH蛋白的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并表達(dá)該多核苷酸序列來進(jìn)行。另外，本發(fā)明還提供了含有編碼MICAL2-PV或PCOTH蛋白的核苷酸序列的載體，以及含有編碼MICAL2-PV或PCOTH蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞。這種載體和宿主細(xì)胞可用于制備MICAL2-PV或PCOTH蛋白。
本申請還提供了識別MICAL2-PV蛋白的抗體。還部分地提供了MICL2-PV或PCOTH基因的反義多核苷酸(例如反義DNA)，核酶，和siRNA(小干擾RNA)。
本發(fā)明還提供了診斷前列腺癌的方法，包括以下步驟確定受試者生物樣品中的基因表達(dá)水平，并將MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平與正常樣品中的比較，以及確定樣品中MICAL2-PV或PCOTH的高表達(dá)水平指示該受試者患有或?qū)⒖赡芑加星傲邢侔?br> 此外，本發(fā)明提供了篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法。該方法包括將MICAL2-PV或PCOTH多肽與受試化合物接觸，篩選與MICAL2-PV或PCOTH多肽結(jié)合或改變其生物活性的受試分子。
本發(fā)明還提供了篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，其中該方法包括將受試化合物與表達(dá)MICAL2-PV或PCOTH多肽的細(xì)胞接觸，或?qū)⑹茉嚮衔锱c導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含位于報道基因上游的MICAL2-PV或PCOTH的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，并且篩選抑制MICAL2-PV或PCOTH多肽表達(dá)水平的受試化合物。
另外，本發(fā)明提供了篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，其中該方法包括在受試化合物存在的情況下，將MICAL2-PV與肌動蛋白接觸，篩選抑制MICAL2-PV與肌動蛋白結(jié)合的受試化合物。
本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防前列腺癌的藥物組合物。該藥物組合物可以是，例如抗癌劑。該藥物組合物可描述為分別針對MICAL2-PV或PCOTH多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸，siRNA或核酶的至少一部分，其分別在SEQ ID NO3和5或1中顯示并描述。適合的siRNA靶向選自SEQ ID NO23和27的序列。MICAL2-PVsiRNA的靶序列包含SEQ ID NO27的核苷酸序列，PCOTH siRNA的靶序列包含SEQ ID NO23的核苷酸序列。它們都優(yōu)選作為本發(fā)明治療或預(yù)防前列腺癌的靶點(diǎn)。藥物組合物還可以是包含化合物的組合物，所述化合物用本發(fā)明篩選治療或預(yù)防細(xì)胞增生性疾病如前列腺癌的化合物的方法選出。
需要藥物組合物的起效過程來抑制癌性細(xì)胞如前列腺癌細(xì)胞的生長。該藥物組合物可施用于包括人和家養(yǎng)哺乳動物的哺乳動物。
本發(fā)明還提供了一種用本發(fā)明提供的藥物組合物治療或預(yù)防前列腺癌的方法。
另外，本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防前列腺癌的方法，包括給予MICAL2-PV或PCOTH多肽的步驟。預(yù)期通過給予MICAL2-PV或PCOTH多肽誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性。因此，本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的方法，包括給予MICAL2-PV或PCOTH多肽，以及含有MICAL2-PV或PCOTH多肽的、用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的步驟。
應(yīng)當(dāng)理解上述發(fā)明概述以及下述發(fā)明的詳細(xì)描述都是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并不限制本發(fā)明及其它替代實(shí)方案。
附圖簡要說明圖1(A)是照片，顯示通過RT-PCR得到的D4493(PCOTH)在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的結(jié)果。來自同一受試者的正常前列腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(N)和前列腺癌細(xì)胞(T)的顯微切片通過半定量RT-PCR進(jìn)行比較。用ACTB使結(jié)果規(guī)范化。(B)是照片，顯示正常人多種組織的Northern印跡分析結(jié)果。檢測出在睪丸和前列腺中的表達(dá)較高且局限化，在心臟和骨髓中表達(dá)較少。(C)是D4493(PCOTH)產(chǎn)物的氨基酸序列。該產(chǎn)物由100個氨基酸組成并具有以G-X-X基序重復(fù)為特征的膠原三螺旋重復(fù)結(jié)構(gòu)。G是甘氨酸，X優(yōu)選脯氨酸。
圖2(A)是照片，顯示通過RT-PCR得到的A5736(MICAL2-PV)在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的結(jié)果。來自同一受試者的正常前列腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(N)和前列腺癌細(xì)胞(T)的顯微切片通過半定量RT-PCR進(jìn)行比較。用ACTB使結(jié)果規(guī)范化。(B)是照片，顯示正常人多種組織和前列腺癌細(xì)胞系的Northern印跡分析的結(jié)果。對應(yīng)MICAL2-PV的約7kb的轉(zhuǎn)錄物在睪丸和前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP，PC3和DU145)中高表達(dá)，而對應(yīng)原始MICAL2的約4kb的轉(zhuǎn)錄物在心臟，腦，肝中表達(dá)，但不在前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)。(C)說明了MICAL2(KIAA0750)和MICAL2-PV外顯子的比對。MICAL2(KIAA0750)是3.8kb的轉(zhuǎn)錄物，含有28個外顯子；MICAL2-PV是6.8kb的轉(zhuǎn)錄物，它的數(shù)個外顯子被刪除，并含有長期保持(longlast)的外顯子。MICAL2-PV有2個同種型長型(登錄號AB110785)和短型(登錄號AB110785)，其中長型中一個外顯子被刪除。預(yù)計該長型將產(chǎn)生976個氨基酸的蛋白質(zhì)，其COOH區(qū)域與MICAL2(KIAA0750)蛋白不同。
圖3是照片，顯示外源性PCOTH蛋白(A)和MICAL2-PV蛋白(B)在COS7細(xì)胞中的亞定位。外源性PCOTH蛋白位于COS7細(xì)胞的細(xì)胞膜，而外源性MICAL2-PV蛋白位于COS7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
圖4(A)是照片，顯示用siRNA在前列腺癌細(xì)胞系中敲除PCOTH的效果。用數(shù)個U6-啟動子-siRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染PC3(si1-4靶向PCOTH，一個靶向EGFP)。RT-PCR結(jié)果說明用si3轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中敲除PCOTH能獲得明顯(drastic)的效果。(B)是照片，顯示用U6-啟動子-siRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染PC3之后的集落形成試驗(yàn)(colony formation assay)的結(jié)果。集落數(shù)目與si3對PCOTH的敲除效果相一致。(C)是用siRNA敲除PCOTH后，三種前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP，DU145和PC3)的MTT試驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞生長同樣與si3對PCOTH的敲除效果相一致。(D)是照片，顯示用siRNA在前列腺癌細(xì)胞系中敲除MICAL2-PV的效果。用數(shù)個U6-啟動子-siRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染PC3(si1-3靶向MICAL2-PV，一個靶向EGFP)。RT-PCR結(jié)果說明用si2轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞來敲除PCOTH能獲得明顯的效果。(E)是照片，顯示用U6-啟動子-siRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染PC3之后的集落形成試驗(yàn)的結(jié)果。集落數(shù)目與si2對MICAL2-PV的敲除效果相一致。
發(fā)明詳述本文中“一個”、“一種”、“該”和“所述”指“至少一種”，除非另有特別說明。
為揭示前列腺癌的機(jī)理、鑒定新的診斷標(biāo)志物和/或藥物靶點(diǎn)以治療這些腫瘤，本發(fā)明人利用全基因組cDNA微陣列聯(lián)合激光微束顯微解剖術(shù)分析了前列腺癌的基因表達(dá)分布圖。結(jié)果，鑒定了2個在前列腺癌細(xì)胞中尤其過表達(dá)的基因PCOTH和MICAL2-PV。另外，用小干擾RNA(siRNA)抑制PCOTH或MICAL2-PV基因的表達(dá)導(dǎo)致了明顯的癌性細(xì)胞生長抑制。這些發(fā)現(xiàn)暗示PCOTH和MICAL2-PV導(dǎo)致癌細(xì)胞的致癌活性，抑制這些蛋白的活性可能是治療和預(yù)防增生性疾病如前列腺癌的有希望的策略。
MICAL2-PV如本發(fā)明所述，鑒定了兩個具有相似序列的基因，它們編碼由1124個氨基酸殘基組成的MICAL2變體。這兩個基因在前列腺癌中的表達(dá)相對于它們在相應(yīng)的非癌性組織中的表達(dá)而言顯著提高。鑒定的變體的3’末端編碼區(qū)與MICAL2的編碼區(qū)不同。因此，這兩個新的人類基因都被稱作“MICAL2前列腺癌變體(MICAL2-PV)”。6805個核苷酸組成的較長變體的eDNA包含2928個核苷酸的開放閱讀框(SEQ ID NO3)，6742個核苷酸組成的較短變體包含2865個核苷酸的開放閱讀框(SEQ ID NO5)。這些開放閱讀框分別編碼推定的976個氨基酸的蛋白和推定的955個氨基酸的蛋白。MICAL2-PV編碼的蛋白包含與calponin結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域，肌動蛋白-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述肌動蛋白-結(jié)合結(jié)構(gòu)域以相同的兩個(in duplicate)存在于包括抗肌萎縮蛋白和α-輔肌動蛋白的血影蛋白樣蛋白(spectrin-like proteins)的N末端。因此，預(yù)計MICAL2-PV編碼的蛋白與肌動蛋白或其它微管相互作用。這些結(jié)構(gòu)域使肌動蛋白絲交聯(lián)成束或網(wǎng)。
因此，本發(fā)明提供了由這些基因編碼的基本純的多肽，包括含SEQ IDNO4或6所示氨基酸序列的多肽及其功能等價物，使得所述多肽及其功能等價物編碼MICAL2-PV蛋白。MICAL2-PV功能等價多肽的例子包括，例如對應(yīng)于人MICAL2-PV蛋白的其它生物體的同源蛋白，以及人MICAL2-PV蛋白的突變體。
本發(fā)明中，術(shù)語“功能等價(functionally equivalent)”指受試多肽與MICAL2-PV蛋白一樣，具有促進(jìn)細(xì)胞增生的活性以及賦予癌細(xì)胞致癌活性的活性。受試多肽是否具有細(xì)胞增生活性可如下所述進(jìn)行判斷將編碼受試多肽的DNA導(dǎo)入表達(dá)各個多肽的宿主細(xì)胞，檢測對細(xì)胞增生的促進(jìn)作用或集落形成活性的增加。這種細(xì)胞包括，例如，LNCaP，PC3和DU145?；蛘撸茉嚩嚯氖欠袷荕ICAL2-PV的功能等價物也可通過檢測其與肌動蛋白的結(jié)合能力來判斷。
制備指定蛋白的功能等價多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括在蛋白中導(dǎo)入突變的已知方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過定點(diǎn)誘變在這些蛋白質(zhì)之一的氨基酸序列中導(dǎo)入合適的突變，來制備人類MICAL2-PV蛋白的功能等價多肽(Hashimoto-Gotoh等，Gene 152271-5(1995)；Zoller andSmith，Methods Enzymol 100468-500(1983)；Kramer等，Nucleic Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol852763-6(1988))。氨基酸突變也會自然發(fā)生。本發(fā)明的多肽包括具有人類MICAL2-PV蛋白氨基酸序列的蛋白，其中一或多個氨基酸發(fā)生突變，產(chǎn)生的突變多肽與人類MICAL2-PV蛋白功能等價。這種突變體中突變氨基酸的數(shù)量通常是10個或更少，優(yōu)選6個或更少，最優(yōu)選3個或更少。
已知突變或修飾的蛋白保持原來的生物活性，所述蛋白為具有通過對具體氨基酸序列的一或多個氨基酸殘基進(jìn)行取代，缺失，插入和/或添加修飾而成的氨基酸序列的蛋白(Mark等，Proc Natl Acad Sci USA 815662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 106487-500(1982)；Dalbadie-McFarland等，Proc Natl Acad Sci USA 796409-13(1982))。
被突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴煌陌被?，其氨基酸?cè)鏈的性質(zhì)是保守的(即保守氨基酸取代過程)。氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)，親水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，以及側(cè)鏈帶有下述功能基團(tuán)或具有共有性質(zhì)脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含有羥基的側(cè)鏈(S，T，Y)；含有硫原子的側(cè)鏈(C，M)；含有羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿基的側(cè)鏈(R，K，H)；含芳香基的側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。注意，括號中的字母是指氨基酸的單字母密碼。
在人MICAL2-PV蛋白的氨基酸序列中添加了一或多個氨基酸殘基的多肽的例子是包含人MICAL2-PV蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人MICAL2-PV蛋白與其它肽或蛋白的融合體，并且包括在本發(fā)明的范圍。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備融合蛋白，如將編碼本發(fā)明人MICAL2-PV蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA連接，使編碼框匹配，將該融合DNA插入表達(dá)載體并在宿主細(xì)胞中表達(dá)。對于與本發(fā)明蛋白融合的肽或蛋白沒有限制。
可用作與本發(fā)明蛋白進(jìn)行融合的已知的肽包括，例如FLAG (Hopp等，Biotechnology 61204-10(1988))，含6個His(組氨酸)殘基的6×His，10×His，流感血凝素(Influenza agglutinin)(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-標(biāo)記，HSV-標(biāo)記，E-標(biāo)記，SV40抗原片段，lck標(biāo)記，α-微管蛋白片段，B-標(biāo)記，蛋白C片段及類似物?？膳c本發(fā)明蛋白融合的蛋白包括例如GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)，流感血凝素(HA)，免疫球蛋白恒定區(qū)，β-半乳糖苷酶，MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)等。
融合蛋白可如下制備將編碼上述融合肽或蛋白的可購得DNA，與編碼本發(fā)明多肽的DNA融合，并表達(dá)制備的融合DNA。
本領(lǐng)域中已知另一分離功能等價多肽的方法是例如，使用雜交技術(shù)的方法(Sambrook等，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press(1989))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地分離與編碼人MICAL2-PV蛋白的全部或部分DNA序列(即SEQ ID NO3或5)高度同源的DNA，并從分離的DNA中分離人MICAL2-PV蛋白的功能等價多肽。本發(fā)明的多肽包括由這樣的DNA所編碼的多肽，所述NDA與編碼人MICAL2-PV蛋白的DNA序列的全部或部分雜交，并且本發(fā)明多肽與人MICAL2-PV蛋白的功能等價。這些多肽包括與衍生自人的蛋白對應(yīng)的哺乳動物同源物(例如，猴，鼠，兔和?；蚓幋a的多肽)。當(dāng)從動物分離與編碼人MICAL2-PV蛋白DNA高度同源的cDNA時，具體優(yōu)選使用來自睪丸的組織。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇用來分離編碼人MICAL2-PV蛋白功能等價多肽的DNA的雜交條件。例如，雜交如下進(jìn)行用“Rapid-hyb緩沖液”在68℃預(yù)雜交30min或更長，加入標(biāo)記探針，68℃保溫1h或更長。隨后的洗滌步驟可在例如低嚴(yán)謹(jǐn)條件進(jìn)行。低嚴(yán)謹(jǐn)條件是，例如42℃，2×SSC，0.1％SDS，或優(yōu)選50℃，2×SSC，0.1％SDS。更優(yōu)選，采用高嚴(yán)謹(jǐn)條件。高嚴(yán)謹(jǐn)條件是，例如室溫、于2×SSC，0.01％SDS中洗滌3次每次20min，隨后37℃，于1×SSC，0.1％SDS中洗滌3次每次20min，然后50℃，于1×SSC，0.1％SDS洗滌2次每次20min。雖然一些因素如溫度和鹽濃度會影響雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)倪x擇這些因素以獲得必要的嚴(yán)謹(jǐn)度。
可利用基因擴(kuò)增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)代替雜交，來分離編碼人MICAL2-PV蛋白功能等價多肽的DNA，使用根據(jù)編碼該蛋白的DNA的序列信息(SEQ ID NO3或5)合成的引物。
通過上述雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)分離的DNA編碼的人MICAL2-PV蛋白的功能等價多肽通常與人MICAL2-PV蛋白的氨基酸序列高度同源?！案叨韧础蓖ǔＶ?0％同源性或更高，優(yōu)選60％或更高，更優(yōu)選80％或更高，甚至優(yōu)選95％或更高。多肽的同源性可用“Wilbur and Lipman，ProcNatl Acad Sci USA 80726-30(1983)”的算法確定。
本發(fā)明多肽的氨基酸序列，分子量，等電點(diǎn)，糖鏈的存在或缺失，或形態(tài)可能發(fā)生變異，這取決于制備該多肽所使用的細(xì)胞或宿主或使用的純化方法。不過，只要它的功能等同于本發(fā)明的人MICAL2-PV蛋白，它就屬于本發(fā)明的范圍。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法以重組蛋白或天然蛋白的形式制備本發(fā)明的多肽。重組蛋白如下制備將編碼本發(fā)明多肽的DNA(例如，含SEQID NO3或5的核苷酸序列的DNA)插入合適的表達(dá)載體，將該載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，獲得提取物，使用其上固定有抗本發(fā)明蛋白抗體的柱或聯(lián)合使用多個上述柱，對該提取物進(jìn)行層析從而純化所述多肽，所述層析如離子交換層析，反相層析，凝膠過濾或親和層析。
當(dāng)本發(fā)明多肽在宿主細(xì)胞(例如動物細(xì)胞和大腸桿菌)中被表達(dá)為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白融合的融合蛋白或附加了多個組氨酸的重組蛋白時，該表達(dá)的重組蛋白可用谷胱甘肽柱或鎳柱純化?；蛘撸?dāng)本發(fā)明的多肽被表達(dá)為c-myc、多組氨酸或FLAG標(biāo)記的蛋白時，其可分別使用抗c-myc、His或FLAG抗體檢測和純化。
純化該融合蛋白后，還可能通過按需切除凝血酶或因子Xa除去與受試多肽不同的區(qū)域。
分離天然蛋白可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如與親和柱接觸，其中與下述MICAL2-PV蛋白結(jié)合的抗體與表達(dá)本發(fā)明多肽的組織或細(xì)胞的提取物相結(jié)合。所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明還包括本發(fā)明多肽的部分肽。該部分肽含有本發(fā)明多肽的特異性氨基酸序列，并由至少7個氨基酸，優(yōu)選8個或更多氨基酸，更優(yōu)選9個或更多氨基酸組成。所述部分肽可用于，例如制備抗本發(fā)明多肽的抗體，篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物，篩選本發(fā)明多肽的促進(jìn)劑(accelerator)或抑制劑。
可通過基因工程方法，已知的肽合成方法，或用合適的肽酶消化本發(fā)明多肽來制備本發(fā)明的部分肽。對于肽合成，可使用例如固相肽合成或液相肽合成。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼上述MICAL2-PV多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可用于在體內(nèi)或體外制備上述本發(fā)明的多肽，或者應(yīng)用于疾病的基因治療，所述疾病歸因于編碼本發(fā)明多肽的基因的遺傳異常?？衫帽景l(fā)明多核苷酸的任意一種形式，只要它編碼本發(fā)明的多肽，所述多核苷酸的形式包括mRNA，RNA，cDNA，基因組DNA，化學(xué)合成的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序列的DNA及其簡并序列，只要形成的DNA編碼本發(fā)明的多肽。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備本發(fā)明的多核苷酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可如下制備從表達(dá)本法明多肽的細(xì)胞中制備cDNA文庫，用本發(fā)明DNA的部分序列(如SEQ ID NO3或5)作為探針進(jìn)行雜交。cDNA文庫可依照Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)描述的方法制備；或者也可以使用可購得的cDNA文庫。cDNA文庫還可如下制備從表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞中提取RNA，根據(jù)本發(fā)明DNA序列(如SEQ ID NO3或5)合成寡DNA，以該寡DNA為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增編碼本發(fā)明蛋白的cDNA。
另外，通過測序獲得的cDNA的核苷酸序列，可以常規(guī)的確定cDNA編碼的翻譯區(qū)，也就可以容易地獲得本發(fā)明多肽的氨基酸序列。而且，用獲得的cDNA或其部分作為探針篩選基因組DNA文庫，可以分離基因組DNA。
更具體地，可以首先從表達(dá)本發(fā)明目的多肽的細(xì)胞，組織或器官(例如睪丸)中制備mRNA。用已知的方法分離mRNA；例如用胍超速離心(guanidine ultracentrifugation)(Chirgwin等，Biochemistry 185294-9(1979))或AGPC方法(Chomczynski and Sacchi，Anal Biochem 162156-9(1987))制備總RNA。另外，用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)從總RNA中純化mRNA?；蛘?，用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化mRNA。
利用逆轉(zhuǎn)錄酶從獲得的mRNA合成cDNA。cDNA的合成可使用可購得的試劑盒，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)?；蛘?，用5’-RACE方法合成并擴(kuò)增cDNA(Frohman等，Proc Natl Acad SciUSA 858998-9002(1988)；Belyavsky等，Nucleic Acids Res 172919-32(1989))，其中使用本文所述的引物，5’-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
從PCR產(chǎn)物制備所需的DNA片段并與載體DNA連接。重組載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，并從選出的集落中制備所需的重組載體。通過常規(guī)方法驗(yàn)證所需的DNA的核苷酸序列，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法(dideoxynucleotide chain termination)。
考慮到用于表達(dá)的宿主細(xì)胞中的密碼子利用頻率，設(shè)計本發(fā)明多核苷酸的核苷酸序列，使其更有效地表達(dá)(Grantham等，Nucleic Acids Res 943-74(1981))?？捎蒙唐坊噭┖谢虺Ｒ?guī)方法改變本發(fā)明多核苷酸的序列。例如，可用限制酶消化，插入合成的寡核苷酸或合適的多核苷酸片段，增加接頭，或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA，TGA或標(biāo)記)來改變所述序列。
具體地，本發(fā)明的多核苷酸包括含有SEQ ID NO3或5的核苷酸序列的DNA。
另外，本發(fā)明提供了多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有SEQ ID NO3或5所示核苷酸序列的多核苷酸雜交，并編碼上述與本發(fā)明MICAL2-PV蛋白功能等價的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇嚴(yán)謹(jǐn)條件。例如，可采用低嚴(yán)謹(jǐn)條件。更優(yōu)選，可采用高嚴(yán)謹(jǐn)條件。這些條件與前文所述條件相同。上述用于雜交的DNA優(yōu)選cDNA或染色體DNA。
本發(fā)明還提供了與編碼人MICAL2-PV蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO3或5)或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)的多核苷酸，其包括至少15個核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選與編碼本發(fā)明MICAL2-PV蛋白的DNA特異性雜交。本文術(shù)語“特異性雜交”指在通常的雜交條件、優(yōu)選嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，與編碼其它蛋白的DNA不發(fā)生明顯的交叉雜交。這種多核苷酸包括探針，引物，核苷酸及核苷酸衍生物(例如，反義寡核苷酸和核酶)，它們與編碼本發(fā)明多肽的DNA或其互補(bǔ)鏈特異性雜交。而且，這種多核苷酸可用于制備DNA芯片。
PCOTH如本發(fā)明所述，還鑒定了另一基因PCOTH，其在前列腺癌細(xì)胞中相對于相應(yīng)的非癌性組織中尤其過表達(dá)。該鑒定的基因與LOC221179(XP_167955)同源。然而，發(fā)現(xiàn)PCOTH基因編碼SEQ ID NO2(GenBank登錄號AB113650)所示的100個氨基酸的蛋白，其由SEQ ID NO1所示的300個核苷酸組成的開放閱讀框編碼，所述開放閱讀框與LOC221179(XP_167955)已知的閱讀框不同。顯示PCOTH含有膠原三螺旋重復(fù)，且其外源性產(chǎn)物位于細(xì)胞膜(圖1)。因此，該基因稱為“前列腺膠原三螺旋”。
因此，本發(fā)明提供了該基因編碼的基本純的多肽，包括含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽及其功能等價體，使得它們編碼PCOTH蛋白，并預(yù)計這種功能等價體比已知的LOC221179(XP_167955)編碼的全長氨基酸序列短。PCOTH的功能等價多肽包括，例如對應(yīng)于人PCOTH蛋白的其它生物體的同源蛋白以及人PCOTH蛋白的突變體。優(yōu)選的PCOTH蛋白突變體包括含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白，其中一或多個氨基酸被取代和/或缺失。
本發(fā)明中，術(shù)語“功能等價”指受試多肽與PCOTH蛋白一樣具有促進(jìn)細(xì)胞增生的活性，并賦予癌細(xì)胞致癌活性的活性。受試多肽是否具有細(xì)胞增生活性可如下所述進(jìn)行判斷將編碼受試多肽的DNA導(dǎo)入表達(dá)各個多肽的細(xì)胞，檢測所述細(xì)胞的促進(jìn)作用或集落形成活性的增加。這種細(xì)胞包括，例如，LNCaP，PC3和DU145。
在上述“MICAL2-PV”項(xiàng)中描述的相同的方法也可用于制備PCOTH蛋白及其功能等價體，其中使用SEQ ID NO1和2所述的序列信息。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼上述PCOTH多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可用于在體內(nèi)或體外制備上述本發(fā)明的多肽，或者應(yīng)用于疾病的基因治療，所述疾病歸因于編碼本發(fā)明多肽的基因的遺傳異常。可利用本發(fā)明多核苷酸的任意一種形式，只要它編碼本發(fā)明的多肽，所述多核苷酸的形式包括mRNA，RNA，cDNA，基因組DNA，化學(xué)合成的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序列的DNA及其簡并序列，只要形成的DNA編碼本發(fā)明的多肽。這種多核苷酸也可以用“MICAL2-PV”項(xiàng)中描述的相似的方法制備，其中使用SEQ ID NO1和2所述的序列信息。
與MICAL2-PV相比，在睪丸和前列腺中檢測到正常的PCOTH表達(dá)。因此，為制備PCOTH或其功能等價體、或PCOTH的mRNA，除了使用睪丸組織，還可以利用來自前列腺的組織。
載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供了其中導(dǎo)入了本發(fā)明多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體用于在宿主細(xì)胞中保留本發(fā)明的多核苷酸具體是DNA、用于表達(dá)本發(fā)明的多肽，或用于給予本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行基因治療。
當(dāng)以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞并在大腸桿菌中(例如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue)大量的擴(kuò)增和生產(chǎn)載體時，該載體應(yīng)當(dāng)具有在大腸桿菌中擴(kuò)增的“復(fù)制起始點(diǎn)ori”，以及用于篩選轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)記基因(例如，通過例如氨卡青霉素，四環(huán)素，卡那霉素，氯霉素等藥物進(jìn)行篩選的抗藥基因)。例如，可使用M13系列載體，pUC系列載體，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。另外，也可使用pGEM-T，pDIRECT和pT7來進(jìn)行亞克隆及提取cDNA和上述載體。當(dāng)利用載體制備本發(fā)明的蛋白時，表達(dá)載體特別有用。例如，在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)具備上述性質(zhì)以便在大腸桿菌中擴(kuò)增。當(dāng)以大腸桿菌如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue作為宿主細(xì)胞時，載體應(yīng)當(dāng)具有啟動子，如lacZ啟動子(Ward等，Nature 341544-6(1989)；FASEB J 62422-7(1992))，arab啟動子(Better等，Science 2401041-3(1988))，T7啟動子等，它們能在大腸桿菌中有效的表達(dá)所需的基因。在這方面，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress system”(Qiagen)，pEGFP和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選表達(dá)T7 RNA聚合酶的BL21)代替上述載體。另外，該載體還可包含多肽分泌的信號肽序列。指導(dǎo)多肽分泌到大腸桿菌周質(zhì)的信號肽序列的實(shí)例是pelB信號序列(Lei等，JBacteriol 1694379(1987))。將所述載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞的方法包括，例如氯化鈣法和電穿孔法。
除了大腸桿菌，還可利用例如哺乳動物表達(dá)載體(如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)5322(1990))，pEF，pCDM8)，昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體(如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，植物表達(dá)載體(如pMH1，pMH2)，動物病毒表達(dá)載體(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(如pZIpneo)，酵母表達(dá)載體(畢赤酵母(如“Pichia)表達(dá)試劑盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)，枯草桿菌(Bacillus subtilis)表達(dá)載體(如pPL608，pKTH50)制備本發(fā)明的多肽。
為了在動物細(xì)胞如CHO，COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)所述載體，該載體應(yīng)當(dāng)具有在這些細(xì)胞中表達(dá)所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等，Nature 277108(1979))，MMLV-LTR啟動子，EF1α啟動子(Mizushima等，NucleicAcids Res 185322(1990))，CMV啟動子等，并優(yōu)選具有用于篩選轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因(如，經(jīng)藥物(例如新霉素，G418)選出的抗藥基因)。已知具備這些性質(zhì)的載體包括，例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
制備多肽本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明多肽的方法?？赏ㄟ^培養(yǎng)宿主細(xì)胞來制備所述多肽，所述宿主細(xì)胞含有包含編碼所述多肽的基因的表達(dá)載體。根據(jù)需要采用方法使所述基因穩(wěn)定表達(dá)，同時增加細(xì)胞中該基因的拷貝數(shù)。例如，將含有互補(bǔ)DHFR基因的載體(如pCHO I)導(dǎo)入核酸合成途徑被缺失的CHO細(xì)胞，然后由甲氨蝶呤(MTX)進(jìn)行擴(kuò)增。另外，當(dāng)瞬時表達(dá)基因時，可采用下述方法將含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)的載體(pcD等)轉(zhuǎn)化入COS細(xì)胞，該細(xì)胞染色體包含SV40T抗原表達(dá)基因。
如上所述獲得的本發(fā)明多肽可以從宿主細(xì)胞內(nèi)或外(如培養(yǎng)基)分離，并純化為基本純的均質(zhì)的多肽。本文給定多肽所用的術(shù)語“基本純”是指該多肽基本上與其它生物大分子分離?；炯兊亩嚯闹父芍刂辽?5％(如至少80，85，95，或99％)是純的。用合適的標(biāo)準(zhǔn)方法測定純度，所述方法例如柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。多肽分離純化的方法并不限于任何具體方法；事實(shí)上，可采用任何標(biāo)準(zhǔn)方法。
例如，可以適當(dāng)選擇并聯(lián)合使用柱層析，過濾，超濾，鹽沉淀，溶劑沉淀，溶劑提取，蒸餾，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電點(diǎn)電泳，透析和重結(jié)晶以分離純化所述多肽。
層析的實(shí)例包括，例如親和層析，離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反相層析，吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。這些層析法可以液相層析如HPLC和FPLC進(jìn)行。因此，本發(fā)明提供了上述方法制備的高純度的多肽。
在純化之前或之后用合適的蛋白修飾酶處理本發(fā)明的多肽，可任選修飾或部分缺失所述多肽。有用的蛋白修飾酶包括、但不限于胰蛋白酶，糜蛋白酶，賴氨酰內(nèi)肽酶，蛋白激酶，糖苷酶等等。
抗體本發(fā)明提供了與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以任意形式如單克隆抗體或多克隆抗體進(jìn)行使用，并且包括用本發(fā)明多肽免疫動物如兔獲得的抗血清，所有類型的多克隆和單克隆抗體，人抗體以及通過基因重組制備的人源化抗體。
以本發(fā)明多肽作為抗原可以從任何動物種系獲得抗體，但優(yōu)選從哺乳動物諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選從人獲得抗體。來自人的多肽可從本文所述的核苷酸或氨基酸序列獲得。如本發(fā)明所述，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白或蛋白的部分肽。部分肽包括，例如本發(fā)明多肽的氨基端(N)或羧基端(C)片段。
本文中，抗體定義為與本發(fā)明多肽的全長或其片段反應(yīng)的蛋白。
將編碼本發(fā)明多肽或其片段的基因插入到已知的表達(dá)載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化本文所述的宿主細(xì)胞。用任意標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞內(nèi)或外回收所需多肽或其片段，并隨后將所述多肽或其片段用作抗原?；蛘?，以表達(dá)該多肽的整個細(xì)胞或其裂解物或化學(xué)合成多肽作為抗原。
用所述抗原免疫任意哺乳動物，但優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。通常使用嚙齒目(Rodentia)，兔類(Lagomorpha)或靈長類(Primates)的動物。嚙齒目動物包括，如小鼠，大鼠和倉鼠。兔類動物包括兔。靈長類動物包括，例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))如Macaca fascicularis，恒河猴(rhesus monkey)，狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫動物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體地，可以用適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，生理鹽水等稀釋和懸浮抗原。如果需要，將抗原懸液與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑如福氏(Freund’s)完全佐劑混合，形成乳液，然后給予哺乳動物。優(yōu)選，將與適量福氏完全佐劑混合的抗原每4至21天給藥數(shù)次。也可使用合適的載體進(jìn)行免疫。上所述免疫后，用標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)血清中所需的抗體數(shù)量的增加。
本發(fā)明多肽的多克隆抗體可如下制備從經(jīng)免疫的動物(該動物經(jīng)檢測其血清中所需的抗體增加)收集血液，用任意常規(guī)的方法從所述血液中分離血清。多克隆抗體包括含多克隆抗體的血清且可從所述血清中分離含有該多克隆抗體的級分。利用例如與本發(fā)明多肽偶聯(lián)的親和層析柱，從僅識別本發(fā)明多肽的級分制備免疫球蛋白G或M，隨后進(jìn)一步用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。
為制備單克隆抗體，從用所述抗原免疫、并且如上述經(jīng)檢測血清中所需抗體水平增高的動物中收集免疫細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞優(yōu)選獲自脾。其它待與上述免疫細(xì)胞融合的優(yōu)選親本細(xì)胞包括，例如哺乳動物骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選具備獲得的特性以便用藥物篩選融合細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞。
根據(jù)已知的方法。如Milstein等(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 733-46(1981))的方法將上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。
通過在標(biāo)準(zhǔn)選擇性培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)等中進(jìn)行培養(yǎng)來選擇細(xì)胞融合所得的雜交瘤。通常，細(xì)胞培養(yǎng)物在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天至數(shù)周，該時間要足以使除了所需的雜交瘤細(xì)胞之外的所有其它細(xì)胞(非融合的細(xì)胞)死亡。然后，以標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋法篩選并克隆生產(chǎn)所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。
除了上述以抗原免疫非人動物制備雜交瘤的方法外，人淋巴細(xì)胞諸如EB病毒感染的淋巴細(xì)胞也可在體外用多肽，表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物進(jìn)行免疫。然后，被免疫的淋巴細(xì)胞與能模糊分裂的(indefinite dividing)、人來源的骨髓瘤細(xì)胞諸如U266融合，以獲得產(chǎn)生與所述多肽結(jié)合的所需人抗體的雜交瘤細(xì)胞(未審查的日本專利申請(Unexamined Published JapanesePatent Application No.)(JP-A)Sho 63-17688)。
獲得的雜交瘤細(xì)胞隨后移植到小鼠的腹腔，并抽提腹水。獲得的單克隆抗體可通過，例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)了本發(fā)明多肽的親和柱進(jìn)行純化。本發(fā)明的抗體不僅可以用于純化和檢測本發(fā)明的多肽，還可以作為本發(fā)明多肽的候選激動劑和拮抗劑。另外，該抗體可應(yīng)用于本發(fā)明多肽相關(guān)疾病的抗體治療。當(dāng)將獲得的抗體給予人體(抗體治療)時，優(yōu)選人抗體或人源化抗體以降低免疫原性。
例如，用選自多肽，表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物的抗原來免疫具有人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物。然后從該動物收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤，從該雜交瘤制備抗所述多肽的人抗體(參見WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，用癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞如經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞永生化，用于制備單克隆抗體。
如此獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程技術(shù)通過重組方法制備(參見，如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可從免疫細(xì)胞，如產(chǎn)生抗體的雜交瘤或經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞來克隆編碼該抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞制備重組抗體。本發(fā)明還提供了如上所述制備的重組抗體。
另外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要它結(jié)合一或多種本發(fā)明的多肽。例如，所述抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或單鏈Fv(scFv)，其中H鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Huston等，Proc NatlAcad Sci USA 855879-83(1988))。更具體地，抗體片段可用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體而生成。或者可構(gòu)建編碼該抗體片段的基因，將其插入合適的表達(dá)載體，并在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見，如Co等，JImmunol 1522968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol 121663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9132-7(1991))。
抗體可通過與各種分子，如聚乙二醇(PEG)連接進(jìn)行修飾。本發(fā)明提供了這種修飾的抗體。也可通過化學(xué)修飾抗體而獲得修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的。
或者，本發(fā)明的抗體可作為嵌合抗體而獲得，所述嵌合抗體可變區(qū)來自非人抗體而恒定區(qū)來自人抗體；或者作為人源化抗體而獲得，所述人源化抗體包括來自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，來自人抗體的框架區(qū)(FR)以及恒定區(qū)。根據(jù)已知技術(shù)制備這種抗體。
如上所述獲得的抗體可以純化成均質(zhì)的。例如，以用于普通蛋白的分離純化方法進(jìn)行抗體的分離純化。例如，抗體可通過適當(dāng)?shù)剡x擇并聯(lián)合使用柱層析來分離及純化，所述層析諸如親和層析，過濾，超濾，鹽析，透析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及等電聚焦(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))等，但不限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作親和柱?？衫玫氖纠缘鞍譇柱包括，如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了親和層析，層析的實(shí)例還包括，如離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反相層析，吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。層析過程可以通過液相層析諸如HPLC和FPLC等實(shí)施。
例如，通過測定吸光度，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，酶免疫分析(EIA)，放射免疫分析(RIA)和/或免疫熒光來測定本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。ELISA中，本發(fā)明的抗體固定在平板上，本發(fā)明的多肽施加于平板上，然后施加含有所需抗體的樣品(諸如產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)上清或純化的抗體)。接著施加識別第一抗體并用酶諸如堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，溫育所述平板。洗滌后，向平板添加酶底物如磷酸對硝基苯酯，測定吸光度以評價樣品的抗原結(jié)合活性。多肽片段，如C末端或N末端片段也可用作抗原來評價抗體的結(jié)合活性。根據(jù)本發(fā)明，可用BIAcore(Pharmacia)評價抗體的活性。
上述方法可以檢測或測定本發(fā)明的多肽，這是通過將本發(fā)明的抗體暴露于假設(shè)含有本發(fā)明多肽的樣品，檢測或測定抗體和多肽形成的免疫復(fù)合物。
因?yàn)楸景l(fā)明所述的檢測或測量多肽的方法可以特異性的檢測或測量多肽，所以該方法能用于各種使用了多肽的實(shí)驗(yàn)。
反義多核苷酸，小干擾RNA和核酶本發(fā)明包括與SEQ ID NO1，3或5的核苷酸序列的任意位點(diǎn)雜交的反義寡核苷酸。該反義寡核苷酸優(yōu)選針對SEQ ID NO1，3或5的核苷酸序列的至少15個連續(xù)的核苷酸。在上述至少15個連續(xù)的核苷酸中包含起始密碼子的上述反義寡核苷酸是更優(yōu)選的。
反義寡核苷酸的衍生物或修飾的產(chǎn)物也可作為反義寡核苷酸。這種修飾的產(chǎn)物包括低級烷基膦酸鹽/酯修飾，如甲基膦酸鹽型或乙基膦酸鹽型，硫代磷酸酯(phosphorothioate)修飾以及氨基磷酸鹽(phosphoroamidate)修飾。
本文所用的術(shù)語“反義寡核苷酸”不僅指其中對應(yīng)于組成DNA或mRNA具體區(qū)域的核苷酸完全互補(bǔ)的寡核苷酸，還指包含一或多種錯配核苷酸的寡核苷酸，條件是所述DNA或mRNA以及反義寡核苷酸能特異性的與SEQ ID NO1，3或5的核苷酸序列雜交。
這種多核苷酸包括在“至少15個連續(xù)核苷酸序列區(qū)域”中有至少70％同或70％以上、優(yōu)選80％或80％以上、更優(yōu)選90％或90％以上、甚至最優(yōu)選95％或95％以上同源性的多核苷酸。本文所述的運(yùn)算規(guī)則可用于確定同源性。本領(lǐng)域中已知的運(yùn)算規(guī)則也可用于確定同源性。另外，所述反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物也可作為本發(fā)明的反義寡核苷酸。這種修飾產(chǎn)物包括低級烷基膦酸鹽/酯修飾，如甲基膦酸鹽型或乙基膦酸鹽型，硫代磷酸酯修飾以及氨基磷酸鹽修飾。
這種反義多核苷酸可作為探針以分離或檢測編碼本發(fā)明多肽的DNA、或作為引物用于擴(kuò)增。
本發(fā)明反義寡核苷酸的衍生物通過與編碼多肽的DNA或mRNA結(jié)合作用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)所述mRNA的降解，抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，因此抑制所述多肽的功能。
本發(fā)明還包括小干擾RNA(siRNA)，其含有SEQ ID NO1，3或5核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合。更具體地，這種抑制MICAL2-PV表達(dá)的siRNA包括靶向SEQ ID NO27所示核苷酸序列的siRNA?；蛘撸种芇COTH表達(dá)的siRNA包括靶向SEQ ID NO23所示核苷酸序列的siRNA。
術(shù)語“siRNA”意指可阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，包括其中DNA是RNA轉(zhuǎn)錄模板的那些技術(shù)。所述siRNA包含編碼人MICAL2-PV或PCOTH蛋白(SEQ ID NO1，3或5)的多核苷酸的有義核酸序列和反義核酸序列。所述siRNA被構(gòu)建使得單個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(雙鏈RNA)具有靶基因例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的有義序列和互補(bǔ)反義序列。
用Ambion網(wǎng)站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)的siRNA設(shè)計程序設(shè)計siRNA的核苷酸序列。根據(jù)下述方案由計算機(jī)程序選擇si.RNA的核苷酸序列siRNA靶位點(diǎn)的選擇1.從目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼開始，向下游掃描尋找AA雙核苷酸序列。記錄每個AA的出現(xiàn)，臨近3′的19個核苷酸作為可能的siRNA靶位點(diǎn)。Tuschl等反對針對5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設(shè)計siRNA，因?yàn)樯鲜鰠^(qū)域可能較為富含調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白質(zhì)和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾與siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合的。
2.將所述潛在靶位與人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，不考慮與其它編碼序列顯著同源的任何靶序列。利用BLAST進(jìn)行同源搜索，BLAST可在NCBI服務(wù)器找到，網(wǎng)址是www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，優(yōu)選沿該基因選擇數(shù)個靶序列進(jìn)行評估。
本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，因此可用于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。反義寡核苷酸和siRNA的長度是至少10個核苷酸，也可與天然轉(zhuǎn)錄物一樣長。優(yōu)選，反義寡核苷酸和siRNA有19-25個核苷酸。更優(yōu)選，反義寡核苷酸和siRNA的長度少于75，50，25個核苷酸。
同樣，含有本發(fā)明反義寡核苷酸或siRNA的表達(dá)抑制劑在抑制本發(fā)明多肽的生物活性方面是有用的。因此，含有本發(fā)明反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細(xì)胞增生性疾病，如前列腺癌。
另外，本發(fā)明提供了抑制本發(fā)明MICAL2-PV或PCOTH多肽表達(dá)的核酶。
通常，核酶分為大核酶和小核酶。大核酶是裂解核酸磷酸酯鍵的酶。與大核酶反應(yīng)后，反應(yīng)位點(diǎn)由5’-磷酸基團(tuán)和3’-羥基基團(tuán)組成。大核酶進(jìn)一步分為(1)催化鳥苷在5’-剪接位點(diǎn)的酯基轉(zhuǎn)移作用的組I內(nèi)含子RNA；(2)催化經(jīng)由套索樣(lariat-like)結(jié)構(gòu)經(jīng)過兩步反應(yīng)自我剪接的組II內(nèi)含子RNA；和(3)通過水解在5’位點(diǎn)切割tRNA前體的核糖核酸酶P的RNA組件。另一方面，小核酶與大核酶相比較較小(約40bp)，并且小核酶切割RNA產(chǎn)生5’-羥基和2’-3’環(huán)狀磷酸酯。錘頭型核酶(Koizumi等，F(xiàn)EBS LErr 228225(1988))和發(fā)夾型核酶(Buzayan，Nature 323349(1986)；Kikuchi and Sasaki，NucleicAcids Res 196751(1992))都包括在小核酶中。設(shè)計和構(gòu)建核酶的方法是本領(lǐng)域中已知的(參見Koizumi等，F(xiàn)EBS Lett 228225(1988)；Koizumi等，Nucleic Acids Res 177059(1989)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res 196751(1992))。因此，也可以根據(jù)其序列信息(SEQ ID NO1，3或5)和這些常規(guī)方法來構(gòu)建抑制本發(fā)明多肽表達(dá)的核酶。
針對MICAL2-PV或PCOTH基因的核酶抑制MICAL2-PV或PCOTH蛋白的過表達(dá)，因此有利于抑制蛋白的生物活性。所以核酶可用于治療或預(yù)防前列腺癌。
診斷前列腺癌本發(fā)明還提供利用本發(fā)明多肽的表達(dá)水平作為診斷標(biāo)志，診斷細(xì)胞增生性疾病如前列腺癌的方法。
該診斷方法包括下述步驟(a)檢測本發(fā)明MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平；和(b)將所述表達(dá)水平的提高與前列腺癌相聯(lián)系。
生物樣品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平可以通過定量MICAL2-PV或PCOTH基因相應(yīng)的mRNA或MICAL2-PV或PCOTH基因編碼的蛋白來估計。mRNA的定量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，與MICAL2-PV或PCOTH基因相應(yīng)的mRNA的水平可通過Northern印跡或RT-PCR估計。因?yàn)镸ICAL2-PV或PCOTH基因的全長核苷酸序列如SEQ IDNO1，3或5所示，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員都能夠設(shè)計用于定量MICAL2-PV或PCOTH基因的探針或引物的核苷酸序列。
MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平也可以根據(jù)所述基因編碼的蛋白的活性或量來分析。測定MICAL2-PV或PCOTH蛋白的量的方法如下。例如，免疫分析法可用于檢測生物材料中的蛋白質(zhì)。任何生物材料都可以作為生物樣品以測定蛋白或其活性，只要標(biāo)記基因(MICAL2-PV或PCOTH基因)在前列腺癌患者的樣品中表達(dá)。例如，前列腺導(dǎo)管上皮就可作為這種生物樣品。然而，也可以分析體液，如血液和尿液。另一方面，應(yīng)根據(jù)待分析的每種蛋白的活性選擇合適的方法來測定MICAL2-PV或PCOTH基因所編碼蛋白的活性。
估計生物樣品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平，并將其與正常樣品(非患病受試者的樣品)中所述基因的表達(dá)水平比較。當(dāng)這種比較顯示靶基因的表達(dá)水平高于正常樣品中的時，則判斷該受試者患前列腺癌?？梢栽谕粫r間測定正常受試者以及待診斷受試者的生物樣品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平?；蛘咚霰磉_(dá)水平的正常范圍可通過統(tǒng)計方法確定，所述方法基于分析先前從對照組收集的樣品中所述基因的表達(dá)水平所得的結(jié)果。將受試者的樣品與所述正常范圍進(jìn)行比較獲得結(jié)果，當(dāng)該結(jié)果沒有落入正常范圍，則判斷該受試者患有或易患前列腺癌。
本發(fā)明中，也提供了診斷細(xì)胞增生性疾病如前列腺癌的診斷試劑。本發(fā)明的診斷試劑包括與本發(fā)明的多核苷酸或多肽相結(jié)合的化合物。優(yōu)選，將與本發(fā)明多核苷酸雜交的寡核苷酸或與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體用作這樣的化合物。
本發(fā)明診斷前列腺癌的方法也應(yīng)用于評價治療受試者的前列腺癌的有效性。根據(jù)該方法，從接受前列腺癌治療的受試者獲得生物樣品，如受試細(xì)胞。評價方法可根據(jù)傳統(tǒng)的前列腺癌診斷方法進(jìn)行。
如有需要，在治療前，治療過程中或治療后的各個時間點(diǎn)從所述受試者獲取生物樣品。然后，測定生物樣品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平，并與對照水平相比較，該對照水平來自例如包括其前列腺癌狀態(tài)(即癌性細(xì)胞(cancerous cell)或非癌性細(xì)胞)已知的細(xì)胞的參照細(xì)胞群。所述對照水平在從沒有暴露于治療的生物樣品中測定。
如果對照水平來自不含癌性細(xì)胞的生物樣品，受試者生物樣品中的表達(dá)水平與對照水平的相似性表示治療是有效的。受試者生物樣品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平與對照水平有差異，表示較不良好的臨床結(jié)果或預(yù)后。
術(shù)語“有效”指治療導(dǎo)致受試者中病理性上調(diào)的基因(MICAL2-PV或PCOTH基因)的表達(dá)降低，或受試者前列腺癌細(xì)胞的大小，患病率或增生的可能性減小。當(dāng)進(jìn)行預(yù)防性治療時，“有效”指所述治療延緩或阻止前列腺癌的發(fā)生。利用標(biāo)準(zhǔn)臨床方案評估前列腺癌。此外，可聯(lián)合任意已知的診斷或治療前列腺癌的方法確定治療的有效性。
此外，本發(fā)明診斷前列腺癌的方法也應(yīng)用于評價患前列腺癌受試者的預(yù)后，其通過將患者來源的生物樣品諸如受試細(xì)胞群中的MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平與對照水平比較來進(jìn)行的?；蛘撸稍诩膊「麟A段測定患者來源的生物樣品中MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平，來評價患者的預(yù)后。
與正常對照水平相比，MICAL2-PV或PCOTH基因表達(dá)水平的增加表示預(yù)后較不良好。MICAL2-PV或PCOTH基因表達(dá)水平的降低表示患者的預(yù)后較好。
篩選化合物利用MICAL2-PV或PCOTH基因，所述基因或其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)編碼的蛋白，篩選改變該基因表達(dá)或改變該基因所編碼多肽的生物活性的化合物。期望這種化合物能作為治療或預(yù)防前列腺癌的藥物。
因此，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明多肽篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法。這種篩選方法的實(shí)施方案包括以下步驟(a)將受試化合物與本發(fā)明多肽接觸；(b)檢測本發(fā)明多肽與受試化合物的結(jié)合活性；和(c)選擇與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明多肽可以是重組多肽或者天然來源的蛋白質(zhì)或其部分肽。將與受試化合物接觸的本發(fā)明多肽可以是，例如純化的多肽，可溶性蛋白，與載體結(jié)合的形式或與其它多肽相融合的融合蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法都可作為利用本發(fā)明多肽篩選例如與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的方法。這種篩選通過，例如免疫沉淀方法進(jìn)行，具體地以下述方式進(jìn)行。將編碼本發(fā)明多肽的基因插入外源基因表達(dá)載體諸如pSV2neo，pcDNA I，pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8等，在動物細(xì)胞等中表達(dá)所述基因。用于表達(dá)的啟動子是通常使用的任意啟動子，包括，例如SV40早期啟動子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-α啟動子(Kim等，Gene 91217-23(1990))，CAG啟動子(Niwa等，Gene 108193-200(1991))，RSV LTR啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 152684-704(1987))，SRc啟動子(Takebe等，Mol Cell Biol 8466(1988))，CMV立即早期啟動子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 843365-9(1987))，SV40晚期啟動子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1385-94(1982))，腺病毒晚期啟動子(Kaufman等，Mol Cell Biol 9946(1989))，HSV TK啟動子等等。將基因?qū)雱游锛?xì)胞以表達(dá)外源基因可采用任意方法，例如電穿孔法(Chu等，NucleicAcids Res 151311-26(1987))，磷酸鈣法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 72745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata等，Nucleic Acids Res 125707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 41642-3(1985))，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Derijard，B Cell 71025-37(1994)；Lamb等，Nature Genetics 522-30(1993)Rabindran等，Science 259230-4(1993))等等。本發(fā)明多肽也以融合蛋白的形式表達(dá)，所述融合蛋白包含單克隆抗體識別位點(diǎn)(表位)，所述位點(diǎn)通過將特異性已知的單克隆抗體的表位導(dǎo)入本發(fā)明多肽的N-或C-末端獲得。可利用可購得的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 1385-90(1995))。利用其多克隆位點(diǎn)表達(dá)與，例如β-半乳糖苷酶，麥芽糖結(jié)合蛋白，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，綠色熒光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的載體是可購得的。
還報道了通過僅導(dǎo)入小表位而制備的融合蛋白，該小抗原表位包含幾個至十幾個氨基酸因而并不改變本發(fā)明融合多肽的性質(zhì)。表位，如聚組氨酸(His-標(biāo)記)，流感凝集素HA，人c-myc，F(xiàn)LAG，水泡性口膜炎病毒(Vesicularstomatitis virus)糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7-標(biāo)記)，人單純皰疹病毒(simple herpes virus)糖蛋白(HSV-標(biāo)記)，E-標(biāo)記(單克隆噬菌體的表位)等，以及識別它們的單克隆抗體都可以作為表位-抗體系統(tǒng)來篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白(Experimental Medicine 1385-90(1995))。
免疫沉淀法中，通過在用合適的洗滌劑制備的細(xì)胞裂解物中添加這些抗體形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物含有本發(fā)明的多肽，具有與所述多肽結(jié)合的能力的多肽以及抗體。除了使用如上所述制備的、針對上述表位的抗體，免疫沉淀法中還可以使用抗本發(fā)明多肽的抗體實(shí)施。
當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時，可例如用蛋白A瓊脂糖或蛋白G瓊脂糖沉淀免疫復(fù)合物。如果本發(fā)明多肽制備成與表位如GST融合的融合蛋白形式，使用與這些抗原表位特異性結(jié)合的物質(zhì)諸如谷胱甘肽瓊脂糖4B等形成免疫復(fù)合物的方式可與使用抗本發(fā)明多肽的抗體時一樣。
免疫沉淀法可根據(jù)例如文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
SDS-PAGE經(jīng)常用來分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，并且以合適濃度的凝膠根據(jù)蛋白的分子量也可以分析結(jié)合蛋白。因?yàn)榕c本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白很難用普通染色方法如考馬斯染色或銀染來檢測，該蛋白的檢測靈敏度可如下改進(jìn)用含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白并檢測該蛋白。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r，靶蛋白可以經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳直接純化并確定其序列。
例如West-Western印跡分析(Skolnik等，Cell 6583-90(1991))可作為利用多肽篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的方法。具體地，與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白可如下獲得從細(xì)胞，組織，器官(例如，組織諸如睪丸等用于MICAL2-PV，睪丸和前列腺用于PCOTH)，或者培養(yǎng)的細(xì)胞(例如LNCaP，PC3，DU145)制備cDNA文庫，其中預(yù)計利用噬菌體載體(如ZAP)表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白；在LB瓊脂糖中表達(dá)蛋白；將表達(dá)的蛋白固定在濾膜上；經(jīng)純化和標(biāo)記的本發(fā)明多肽與上述濾膜反應(yīng)；根據(jù)標(biāo)記檢測表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的噬斑。本發(fā)明多肽的標(biāo)記可利用生物素和抗生物素蛋白之間的結(jié)合，或利用特異性與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體，或與本發(fā)明多肽融合的肽或多肽(如GST)。也可以采用放射性同位素或熒光法等方法。
或者，本發(fā)明篩選方法的另一個實(shí)施方案中，采用了利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(two-hybrid system)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”，“哺乳動物MATCHMAKER雙雜交試驗(yàn)試劑盒”，“MATCHMAKER單雜交(one-hybrid)系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stra標(biāo)記ene)；參考文獻(xiàn)“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，TrendsGenet 10286-92(1994)”)。
雙雜交系統(tǒng)中，本發(fā)明多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。從預(yù)計表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞中制備cDNA文庫，使得當(dāng)所述文庫表達(dá)時，即與VPl6或GAL4的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后將該cDNA文庫導(dǎo)入上述酵母細(xì)胞，從檢測的陽性克隆中分離來自該文庫的cDNA(當(dāng)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白在酵母細(xì)胞中表達(dá)時，兩者的結(jié)合激活報告基因，使得陽性克隆可以檢測到)。將上述分離的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌并表達(dá)該蛋白從而制備該cDNA編碼的蛋白。
除了HIS3基因，例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，螢光素酶基因等也可用作報告基因。
與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物也可利用親和層析進(jìn)行篩選。例如，將本發(fā)明多肽固定在親和層析柱的載體上，并將含有能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的受試化合物施加于層析柱。本文的受試化合物可以是，例如細(xì)胞提取物，細(xì)胞裂解物等。裝載該受試化合物后，洗滌柱，制備與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。
當(dāng)受試化合物是蛋白質(zhì)時，分析所得蛋白的氨基酸序列，根據(jù)該序列合成寡DNA，用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫獲得編碼該蛋白的DNA。
利用表面胞質(zhì)團(tuán)共振現(xiàn)象的生物傳感器可作為檢測或定量本發(fā)明結(jié)合的化合物的一種方法。當(dāng)使用這種生物傳感器時，本發(fā)明多肽和受試化合物之間的相互作用可作為表面胞質(zhì)團(tuán)共振信號而被實(shí)時觀察，僅僅使用極少量的多肽并且不需要標(biāo)記(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物傳感器如BIAcore評估本發(fā)明多肽和受試分子之間的結(jié)合。
篩選當(dāng)本發(fā)明固定化的多肽暴露于合成化合物、或天然物質(zhì)庫、或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫時發(fā)生結(jié)合的分子的方法，以及根據(jù)組合化學(xué)技術(shù)(Wrighton等，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))利用高通量分離與本發(fā)明蛋白(包括激動劑和拮抗劑)結(jié)合的蛋白以及化合物的篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
另外，本發(fā)明提供了一種利用本發(fā)明多肽篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，包括以下步驟(a)將受試化合物與本發(fā)明多肽接觸；(b)檢測步驟(a)中多肽的生物活性；和(c)選擇抑制所述多肽的生物活性化合物，所述生物活性是與沒有受試化合物時檢測到的多肽生物活性相比。
因?yàn)楸景l(fā)明MICAL2-PV和PCOTH蛋白具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增生的活性，所以用這種活性作為指標(biāo)可以篩選化合物，所述化合物促進(jìn)或抑制本發(fā)明蛋白之一的這種活性。
可用任何多肽進(jìn)行篩選只要它們有MICAL2-PV或PCOTH蛋白的生物活性。這種生物活性包括人MICAL2-PV或PCOTH蛋白的細(xì)胞增生活性，MICAL2-PV與肌動蛋白結(jié)合的活性。例如，也可使用人MICAL2-PV或PCOTH蛋白及其功能等價多肽。這種多肽可由細(xì)胞內(nèi)源性或外源性表達(dá)。
通過這種篩選分離的化合物是本發(fā)明多肽的激動劑或拮抗劑。術(shù)語“激動劑“指通過與其結(jié)合活化本發(fā)明多肽的功能的分子。同樣，“拮抗劑”指通過與其結(jié)合抑制本發(fā)明多肽功能的分子。而且，通過這種篩選分離的化合物是抑制本發(fā)明多肽與分子(包括DNA和蛋白質(zhì))在體內(nèi)的相互作用的候選化合物。
當(dāng)本發(fā)明方法中所檢測的生物活性是細(xì)胞增生時，可例如下述進(jìn)行檢測制備表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞，在存在受試化合物的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞，測定細(xì)胞增生速度，測量細(xì)胞周期等，以及如實(shí)施例所述測量集落形成活性。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法。如前文所詳細(xì)討論的，通過控制MICAL2-PV或PCOTH的表達(dá)水平，我們可以控制前列腺癌的發(fā)病和進(jìn)程。因此，通過以MICAL2-PV或PCOTH表達(dá)水平作為標(biāo)志進(jìn)行篩選可鑒定用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物。在本發(fā)明的上下文中，這種篩選包括，例如下述步驟將受試化合物與表達(dá)MICAL2-PV或PCOTH的細(xì)胞接觸；和篩選與沒有該受試化合物時檢測到的MICAL2-PV或PCOTH表達(dá)水平相比降低MICAL2-PV或PCOTH表達(dá)水平的化合物。
表達(dá)至少一種MICAL2-PV或PCOTH的細(xì)胞包括，例如從前列腺癌建立的細(xì)胞系；這種細(xì)胞可用于本發(fā)明上述的篩選方法(例如LNCaP，PC3，DU145)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法估計所述表達(dá)水平。篩選方法中，選擇降低至少一種MICAL2-PV或PCOTH表達(dá)水平的化合物作為治療或預(yù)防前列腺癌的候選試劑。
或者，本發(fā)明篩選方法包括以下步驟a)使受試化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體含有一或多種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報道基因，其中一或多種標(biāo)記基因是MICAL2-PV和PCOTH，b)測定所述報道基因的活性；和c)選擇與對照相比降低所述報道基因表達(dá)水平的化合物。
適合的報道基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的。篩選所需的報道構(gòu)建體可利用標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來制備。如果標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可利用前面的序列信息制備報道構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是未確定的，可根據(jù)該標(biāo)記基因的核苷酸序列信息從基因組文庫分離含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸片段。
本發(fā)明篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法的另一個實(shí)施方案中，該方法利用了MICAL2-PV與肌動蛋白的結(jié)合能力。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的MICAL2-PV蛋白包括與calponin(肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域)同源的結(jié)構(gòu)域。因此，預(yù)計MICAL2-PV編碼的蛋白與肌動蛋白或其它微管蛋白相互作用。這些結(jié)構(gòu)域使肌動蛋白絲交聯(lián)成束或網(wǎng)。這些發(fā)現(xiàn)暗示本發(fā)明MICAL2-PV蛋白經(jīng)由與分子如肌動蛋白或其它微管蛋白結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞增生的功能。因此，期望抑制MICAL2-PV蛋白和肌動蛋白以及其它微管蛋白之間的結(jié)合能抑制細(xì)胞增生，并且抑制這種結(jié)合的化合物可作為治療或預(yù)防前列腺癌的藥物。
該篩選方法包括以下步驟(a)在受試化合物存在的情況下，將本發(fā)明MICAL-PV多肽與肌動蛋白接觸；(b)檢測所述多肽與肌動蛋白的結(jié)合；和(c)篩選抑制所述多肽與肌動蛋白結(jié)合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明MICAL-PV多肽和肌動蛋白可以是重組多肽或天然來源的蛋白或它們的部分肽，只要它們保持彼此結(jié)合的能力。用于篩選的本發(fā)明MICAL-PV多肽和肌動蛋白可以是，例如純化的多肽，可溶性多肽，與載體結(jié)合的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法都可以作為篩選可抑制MICAL-PV蛋白與肌動蛋白之間結(jié)合的化合物的方法。這種篩選可以在體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，如細(xì)胞體系中進(jìn)行。更具體地，首先，MICAL-PV多肽或肌動蛋白的其中之一結(jié)合在支持物上，再加入另一種蛋白和受試化合物。接著，溫育混合物，洗滌，檢測和/或測定結(jié)合在支持物上的另一種蛋白。
結(jié)合蛋白所用的支持物包括不溶性多糖，如瓊脂糖，纖維素和葡聚糖；以及合成樹脂，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯和硅膠；優(yōu)選使用上述材料制備的商品化珠或板(例如，多孔板，生物傳感器芯片等)。當(dāng)使用珠時，將其裝填在柱中。
蛋白與支持物的結(jié)合可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，如化學(xué)結(jié)合和物理吸收。或者，經(jīng)由特異性識別蛋白的抗體將該蛋白與支持物結(jié)合。另外，也可通過抗生物素蛋白和生物素連接蛋白與支持物。
蛋白之間的結(jié)合在緩沖液中進(jìn)行，例如但不限于磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液，只要緩沖液不抑制蛋白之間的結(jié)合。
本發(fā)明中，利用表面胞質(zhì)團(tuán)共振現(xiàn)象的生物傳感器可作為檢測或定量結(jié)合蛋白的一種方法。當(dāng)使用這種生物傳感器時，蛋白之間的相互作用可作為表面胞質(zhì)團(tuán)共振信號而進(jìn)行實(shí)時觀察，僅僅使用極少量的多肽并且不需要標(biāo)記(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物傳感器，如BIAcore評估MICAL2-PV多肽和肌動蛋白之間的結(jié)合。
或者，標(biāo)記MICAL-PV多肽或肌動蛋白之一，結(jié)合的蛋白的標(biāo)記可用于檢測或測定結(jié)合蛋白。具體地，預(yù)先標(biāo)記其中一種蛋白之后，在受試化合物存在的情況下，使標(biāo)記蛋白與另一種蛋白接觸，洗滌，并根據(jù)所述標(biāo)記檢測或測定結(jié)合蛋白。
標(biāo)記物質(zhì)，如放射性同位素(即3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(即堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶)，熒光物質(zhì)(即異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiosyanete)(FITC)，若丹明)和生物素/抗生物素蛋白都可用于本發(fā)明方法中來標(biāo)記蛋白。當(dāng)以放射性同位素標(biāo)記蛋白時，用液體閃爍法進(jìn)行檢測或測定。或者，用酶標(biāo)記的蛋白的檢測或測定可通過添加酶底物，檢測底物的酶學(xué)變化，如用比色劑檢測顏色的產(chǎn)生來進(jìn)行。另外，當(dāng)熒光物質(zhì)用作標(biāo)記的情況，用熒光光度計檢測或測定結(jié)合蛋白。
此外，MICAL2-PV多肽和肌動蛋白的結(jié)合也可以用MICAL2-PV多肽和肌動蛋白的抗體檢測或測定。例如，固定在支持物上的MICAL2-PV多肽與受試化合物和肌動蛋白接觸后，溫育混合物，洗滌，用抗肌動蛋白的抗體進(jìn)行檢測或測定?；蛘撸瑢⒓拥鞍坠潭ㄔ谥С治锷?，以MICAL2-PV抗體作為檢測抗體。
本發(fā)明篩選中使用抗體時，該抗體優(yōu)選用上述標(biāo)記物質(zhì)之一標(biāo)記，并根據(jù)該標(biāo)記物質(zhì)檢測或測定?；蛘撸琈ICAL2-PV多肽或肌動蛋白抗體作為第一抗體，其可用經(jīng)過標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體檢測。另外，本發(fā)明篩選方法中與蛋白結(jié)合的抗體可用蛋白G或蛋白A柱檢測。
另外，本發(fā)明篩選方法的另一個實(shí)施方案中，采用了利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”，“哺乳動物MATCHMAKER雙雜交試驗(yàn)試劑盒”，“MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stratagene)；參考文獻(xiàn)“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10286-92(1994)”)。
雙雜交系統(tǒng)中，本發(fā)明MICAL2-PV多肽與SRF-結(jié)合域或GAL4-結(jié)合域融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。與本發(fā)明MICAL2-PV多肽結(jié)合的肌動蛋白與VP16或GAL4的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合，并且在有受試化合物存在的情況下也在酵母細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)受試化合物不抑制MICAL2-PV多肽和肌動蛋白的之間的結(jié)合時，兩者的結(jié)合激活報告基因，使陽性克隆能被檢測到。
除了HIS3基因，Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，螢光素酶基因等也可作為報告基因。
任何受試化合物，例如，細(xì)胞提取物，細(xì)胞培養(yǎng)上清液，微生物發(fā)酵產(chǎn)物，海洋生物提取物，植物提取物，純化的或粗制的蛋白，肽，非肽化合物，合成的小分子化合物以及天然化合物都可用在本發(fā)明的篩選方法中。本發(fā)明受試化合物可使用本領(lǐng)域已知的組合文庫中的多種方法之一獲得，所述文庫包括(1)生物學(xué)文庫，(2)空間定位平行固相或液相文庫(spatiallyaddressable parallel solid phase or solution phase libraries)(3)需要重疊合法(deconvolution)的合成文庫法，(4)“一珠一化合物(one bead one compound)”文庫法和(5)使用親和層析篩選的合成文庫法。使用親和層析篩選的生物學(xué)文庫法僅限于肽文庫，而其它四種方法適用于肽，非肽寡聚體或化合物小分子文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)。合成分子文庫的方法的舉例見于下述文獻(xiàn)(DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233)?；衔镂膸炜纱嬖谟谌芤?參見Houghten(1992)Bio/Techniques 13412)或珠(Lam(1991)Nature 35482)，芯片(Fodor(1993)Nature 364555)，細(xì)菌(美國專利5,223,409)，孢子(美國專利5,571,698；5,403,484，and 5,223,409)，質(zhì)粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865)或噬菌體(Scott and Smith(1990)Science 249386；Delvin(1990)Science 249404；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301；美國專利申請2002103360)。
由本發(fā)明篩選方法分離的化合物是促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的候選藥物，其用于治療或預(yù)防由于例如細(xì)胞增生而導(dǎo)致的疾病如前列腺癌。由由本發(fā)明篩選方法獲得的化合物還包括這樣的化合物，其中由本發(fā)明篩選方法獲得的化合物的部分結(jié)構(gòu)經(jīng)添加，缺失和/或取代修飾而改變。
治療或預(yù)防前列腺癌的藥物組合物本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防前列腺癌的組合物，包含由本發(fā)明篩選方法選出的任意化合物。
當(dāng)通過本發(fā)明篩選方法分離的化合物作為藥物而施用于人類和其它哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、狒狒以及猩猩來治療細(xì)胞增生性疾病(例如前列腺癌)時，該分離的化合物可被直接施用或可采用已知的藥物制備方法而被制成劑型。例如，根據(jù)需要，該藥物可作為糖衣片劑，膠囊劑，酏劑和微囊劑而口服，或以水或任何其它可藥用的液體的無菌溶液或懸浮液的注射液形式以非口服方式施用。例如，該化合物可與可藥用的載體或介質(zhì)以通?？山邮艿乃幬镏苽浞椒ㄋ璧膯挝粍┬瓦M(jìn)行混合，所述載體或介質(zhì)具體而言為無菌水，生理鹽水，植物油，乳化劑，懸浮劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，調(diào)味劑，賦形劑，載體，防腐劑，粘合劑等。這些制劑中活性成分的量為所述范圍內(nèi)的適宜劑量。
可混合至片劑和膠囊的添加劑的實(shí)例是，粘合劑諸如明膠，玉米淀粉，黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑諸如微晶纖維素；溶脹劑諸如玉米淀粉，明膠和海藻酸；潤滑劑諸如硬脂酸鎂；增甜劑諸如蔗糖，乳糖或糖精；以及調(diào)味劑諸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和櫻桃紅(cherry)。當(dāng)單位劑型是膠囊時，液體載體諸如油，也可進(jìn)一步包括在上述成份中。用于注射的無菌組合物可按照標(biāo)準(zhǔn)的藥物制備方法采用載體諸如用于注射的蒸餾水進(jìn)行制備。
生理鹽水，葡萄糖，以及包含佐劑諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉的其它等張液可被用作注射用含水溶液。其可與適宜的增溶劑，諸如醇，具體地乙醇，多元醇諸如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯(Polysorbate)80(TM)和HCO-50聯(lián)合使用。
麻油或大豆油可用作油性液體，其可與以下物質(zhì)聯(lián)合使用用作增溶劑的苯甲酸芐酯或苯甲醇，可采用緩沖液諸如磷酸鹽緩沖液和醋酸鈉緩沖液進(jìn)行配制；止痛藥，諸如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，諸如苯甲醇和苯酚；和抗氧化劑?？蓪⒅苽涞淖⑸鋭┭b于適宜的安瓿中。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法將本發(fā)明的藥物組合物給藥患者，例如以動脈內(nèi)，靜脈內(nèi)，或經(jīng)皮注射的方式，也可以經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、經(jīng)肌內(nèi)或口服投藥。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡以及施用方法而改變；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地選擇適宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA編碼，可將該DNA插入用于基因治療的載體中，并施用該載體來實(shí)施治療。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重，年齡和癥狀而改變但本領(lǐng)域技術(shù)人員能適當(dāng)?shù)貙ζ溥M(jìn)行選擇。
例如，不同癥狀適宜的劑量不同，但經(jīng)口服施用于正常成年受試者(體重60kg)時，與本發(fā)明多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量為約0.1mg-約100mg/日，優(yōu)選約1.0mg-約50mg/日且更優(yōu)選約1.0mg-約20mg/日。
當(dāng)經(jīng)胃腸外以注射劑方式施用于正常成年受試者(體重60kg)時，雖然根據(jù)患者、靶器官、癥狀和施用方法而存在一些差異，適于靜脈內(nèi)注射的劑量是約0.01mg-約30mg/日，優(yōu)選約0.1-約20mg/日且更優(yōu)選約0.1-約10mg/日。而且，當(dāng)用于其它動物時，可以施用按60kg體重轉(zhuǎn)換的量。
另外，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防前列腺癌的藥物組合物，含有抑制MICAL2-PV或PCOTH基因表達(dá)的活性成分。這種活性成分包括抗MICAL2-PV或PCOTH基因的反義聚核苷酸，siRNA或核酶或其衍生物，如所述反義多核苷酸，siRNA或核酶的表達(dá)載體。
這些活性成分可與合適的，相對于衍生物無活性的基質(zhì)混合制成外用制劑，如涂敷膏藥(liniment)或敷劑(poultice)。同樣，如果需要，通過添加賦形劑，等張劑，助溶劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，止痛藥等，這些活性成分可制成片劑，粉劑，顆粒劑，膠囊，脂質(zhì)體膠囊，注射劑，溶液劑，滴鼻劑以及凍干劑。依照常規(guī)方法制備這些制劑。
給予患者這些活性成分可以通過直接將這些活性成分施用在患病部位或通過將其注射入血管使其到達(dá)患病部位。還可以使用封固劑以增加耐久性和膜通透性。封固劑的實(shí)例包括脂質(zhì)體，聚-L-賴氨酸，脂質(zhì)、膽固醇，脂轉(zhuǎn)染劑或其衍生物。
根據(jù)患者的情況適當(dāng)調(diào)整本發(fā)明組合物的劑量并以所需用量使用。例如，給藥劑量范圍為0.1至100mg/kg，優(yōu)選0.1至50mg/kg。
本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，治療或預(yù)防前列腺癌的組合物包含抗MICAL2-PV或PCOTH基因編碼多肽的抗體或與該多肽結(jié)合的該抗體的片段。
雖然不同癥狀的適宜劑量不同，當(dāng)口服給予普通成年人(體重60kg)時，治療或預(yù)防前列腺癌的抗體或其片段的劑量是約0.1mg至約100mg/天，優(yōu)選約1.0mg至約50mg/天，更優(yōu)選約1.0mg至約20mg/天。
當(dāng)以胃腸外注射形式給予普通成年人(體重60kg)藥物時，雖然根據(jù)患者的情況，疾病的癥狀以及給藥方式存在一些不同，靜脈注射的適宜劑量是約0.01mg至約30mg/天，優(yōu)選約0.1mg至約20mg/天，更優(yōu)選約0.1mg至約10mg/天。對于其它動物，以根據(jù)60kg體重?fù)Q算的劑量給藥。
治療或預(yù)防前列腺癌的方法本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防受試者前列腺癌的方法。對患有或易患(或疑似患有)前列腺癌的受試者預(yù)防性或治療性地給予治療化合物。這種受試者可以用標(biāo)準(zhǔn)臨床方法或通過檢測MICAL2-PV或PCOTH的異常表達(dá)水平或活性進(jìn)行鑒定。在顯現(xiàn)出明顯的疾病臨床癥狀之前可預(yù)防性給藥，從而預(yù)防疾病或病癥或者延緩其進(jìn)展。
治療方法包括降低MICAl2-PV或PCOTH基因的表達(dá)或/和功能。這些方法中，用治療有效量的化合物治療受試者，該化合物減少受試者中過表達(dá)的MICAL2-PV和/或PCOTH基因?？梢匀斫o藥或局部給藥。治療性化合物包括降低內(nèi)源性存在于前列腺癌細(xì)胞的基因的表達(dá)水平的化合物(即，下調(diào)所述過表達(dá)基因的表達(dá)的化合物)。給予這種治療性化合物能抵消目的細(xì)胞中異常過表達(dá)的基因的影響，并預(yù)計能改善受試者的臨床狀況。這種化合物可由上述本發(fā)明篩選方法獲得。
MICAL2-PV或PCOTH的表達(dá)也可以用本領(lǐng)域已知的一些方法中的任意方法來抑制，包括給予受試者抑制或拮抗所述基因表達(dá)的核酸。破壞該基因表達(dá)的反義寡核苷酸，siRNA或核酶都可用于抑制該基因的表達(dá)。
如上所述，對應(yīng)于MICAL2-PV或PCOTH基因的核苷酸序列的反義寡核苷酸可用于降低MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)水平。具體地，本發(fā)明的反義寡核苷酸通過與MICAL2-PV或PCOTH基因或其相應(yīng)mRNA編碼的任意多肽結(jié)合而發(fā)揮作用，因此抑制所述基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)所述mRNA的降解，和/或抑制所述基因所編碼蛋白的表達(dá)，最終抑制MICAL2-PV或PCOTH蛋白的功能。
反義寡核苷酸及其衍生物可通過與合適的、相對于所述衍生物無活性的基質(zhì)混合制成外用制劑，如涂敷膏藥或敷劑，并用在本發(fā)明治療或預(yù)防前列腺癌的方法中。
抑制過表達(dá)基因的一或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括小干擾RNA(siRNA)，它含有MICAL2-PV或PCOTH基因核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合。將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于本發(fā)明所述的治療或預(yù)防，包括其中以用于轉(zhuǎn)錄RNA的DNA為模板的那些技術(shù)。所述siRNA被構(gòu)建成單個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有來自靶基因例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的的有義序列和互補(bǔ)反義序列。
所述方法用于抑制MICAL2-PV或PCOTH基因的表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞的基因表達(dá)。靶細(xì)胞中siRNA與MICAL2-PV或PCOTH基因轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞中產(chǎn)生的MICAL2-PV或PCOTH蛋白減少。
抑制過表達(dá)基因的一或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括抗過表達(dá)基因(MICAL2-PV或PCOTH基因)的核酶。
另外，本發(fā)明提供了一種用抗本發(fā)明多肽的抗體治療或預(yù)防細(xì)胞增生性疾病諸如前列腺癌的方法。根據(jù)該方法，給予藥物有效量的抗本發(fā)明多肽的抗體。因?yàn)榍傲邢侔┘?xì)胞中MICAL2-PV和PCOTH蛋白的表達(dá)上調(diào)，并且抑制這些蛋白的表達(dá)能降低細(xì)胞增生活性，所以預(yù)計將所述抗體與這些蛋白結(jié)合可以治療或預(yù)防細(xì)胞增生性疾病。因此，抗本發(fā)明多肽的抗體以足以降低本發(fā)明蛋白的活性的劑量給藥，該劑量是約0.1至約250mg/天。成年人的劑量范圍通常從約5mg至約17.5g/天，優(yōu)選約5mg至約10g/天，最優(yōu)選100mg至約3g/天。
另外，用與腫瘤細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合的抗體作為藥物遞送工具。例如，以足以殺傷腫瘤細(xì)胞的劑量給予與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)的抗體。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，包括給予MICAL2-PV或PCOTH蛋白或其免疫活性片段，或編碼所述蛋白或其片段的多核苷酸的步驟。MICAL2-PV或PCOTH蛋白或其免疫活性片段可用作抗細(xì)胞增生性疾病諸如前列腺癌等的疫苗。一些情況中，蛋白或其片段以結(jié)合于T細(xì)胞受體(TCR)的形式或由抗原呈遞細(xì)胞(APC)如巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞(DC)或B細(xì)胞呈遞的形式給予。由于DC細(xì)胞的強(qiáng)抗原呈遞活性，APC中最優(yōu)選使用DC細(xì)胞。
本發(fā)明中，抗細(xì)胞增生性疾病的疫苗指具有一經(jīng)接種到動物便具有抗腫瘤免疫的物質(zhì)。通常，抗腫瘤免疫包括下述免疫反應(yīng)-誘導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞，-誘導(dǎo)識別腫瘤的抗體，和-誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
因此，當(dāng)某種蛋白在接種動物中誘導(dǎo)這些免疫反應(yīng)的任意一種時，則確定該蛋白具備抗腫瘤免疫誘導(dǎo)效應(yīng)。通過在體內(nèi)或體外觀察宿主免疫系統(tǒng)對蛋白的反應(yīng)檢測蛋白對抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)。
例如，檢測誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的方法是已知的。進(jìn)入活體的外來物質(zhì)經(jīng)過抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用呈遞到T細(xì)胞和B細(xì)胞。對APC以抗原特異性方式呈遞的抗原有反應(yīng)的T細(xì)胞由于受到該抗原的刺激，分化成細(xì)胞毒T細(xì)胞(或細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，CTL)，隨后進(jìn)行增殖(本文中稱為T細(xì)胞激活)。因此，具體肽對CTL的誘導(dǎo)可通過由APC將肽呈遞到T細(xì)胞來評估，并檢測對CTL的誘導(dǎo)。另外，APC能激活CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞。因?yàn)镃D4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞對抗腫瘤免疫也很重要，所以肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用可利用這些細(xì)胞的活化效應(yīng)作為指示物進(jìn)行評價。
用樹突細(xì)胞(DC)作為APC評價對CTL的誘導(dǎo)作用的方法是本領(lǐng)域已知的。DC是一種代表性APC，它的CTL誘導(dǎo)活性在APC中最強(qiáng)。在本方法中，受試多肽首先與DC接觸，然后該DC與T細(xì)胞接觸。與DC接觸后若檢測到T細(xì)胞對感興趣的細(xì)胞有細(xì)胞毒效應(yīng)，則說明受試多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性。CTL的抗腫瘤活性可利用例如，51Cr-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的溶解作為指示進(jìn)行檢測?；蛘撸?H-胸苷吸收活性或LDH(乳糖脫氫酶)-釋放作為指示物，評價腫瘤細(xì)胞損傷程度的方法也是本領(lǐng)域已知的。
除了DC，外周血單核細(xì)胞(PBMC)也可作為APC。有報道當(dāng)存在GM-CSF和IL-4時培養(yǎng)PBMC能促進(jìn)CTL的誘導(dǎo)。類似地，當(dāng)存在匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)和IL-7時培養(yǎng)PBMC也能誘導(dǎo)CTL。
經(jīng)這些方法證實(shí)具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽是具備DC活化效應(yīng)以及隨后的CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞CTL的多肽可用作抗腫瘤的疫苗。另外，通過與該多肽接觸而獲得了誘導(dǎo)抗腫瘤CTL能力的APC也可用作抗腫瘤的疫苗。此外，由于APC對多肽抗原的呈遞而獲得了細(xì)胞毒性的CTL也可作為抗腫瘤的疫苗。這種利用由APC和CTL造成的抗腫瘤免疫治療腫瘤的方法稱作細(xì)胞免疫療法。
通常，當(dāng)使用多肽進(jìn)行細(xì)胞免疫療法時，已知聯(lián)合使用具有不同結(jié)構(gòu)的多種多肽并將它們與DC接觸可以增加CTL誘導(dǎo)的效率。因此，當(dāng)用蛋白片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。
或者，多肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用可通過觀察到誘導(dǎo)抗腫瘤抗體的產(chǎn)生而證實(shí)。例如，當(dāng)在用多肽免疫的實(shí)驗(yàn)室動物中誘導(dǎo)了抗多肽的抗體時，以及腫瘤細(xì)胞的生長被這些抗體抑制時，則確定該多肽具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。
通過給予本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，并且抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)使得可以治療和預(yù)防細(xì)胞增生性疾病諸如前列腺癌等。治療癌癥或預(yù)防癌癥發(fā)病包括下述任意步驟，諸如抑制癌性細(xì)胞的生長，癌癥的退化以及抑制癌癥的發(fā)生。降低癌癥患者受試者的死亡率，減少血液中的腫瘤標(biāo)志物，減輕伴隨癌癥的可檢測的癥狀等，都包括在治療或預(yù)防癌癥的效果中。這種治療或預(yù)防效果優(yōu)選是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。例如，在觀察中，顯著性水平是5％或更低時，將抗細(xì)胞增生性疾病的疫苗的治療或預(yù)防效果與不給予疫苗的對照組進(jìn)行比較。如，Student’s t-檢驗(yàn)，曼-惠特尼U-檢驗(yàn)或ANOVA都可用來進(jìn)行統(tǒng)計分析。
上述具有免疫活性的蛋白或編碼該蛋白的載體可與佐劑聯(lián)合。佐劑指當(dāng)與具有免疫活性的蛋白同時給予(或相繼給予)時，能促進(jìn)針對該蛋白的免疫反應(yīng)的化合物。佐劑包括霍亂毒素，沙門氏菌毒素，鋁等，但并不限于這些。此外，本發(fā)明疫苗可與適當(dāng)?shù)目伤幱幂d體聯(lián)合。這種載體例如無菌水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，培養(yǎng)液等。而且，如果必要，疫苗可包含穩(wěn)定劑，混懸劑，防腐劑，表面活性劑等。疫苗全身性或局部給藥。給予疫苗可以是單次給藥或通過多次給藥進(jìn)行強(qiáng)化。
當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗，可例如通過體外方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，收集正接受治療或預(yù)防療法的受試者的PBMC，在離體條件下將該細(xì)胞與所述多肽接觸，誘導(dǎo)APC或CTL之后，再將該細(xì)胞給予受試者。也可通過在離體條件下將編碼所述多肽的載體導(dǎo)入PBMC從而誘導(dǎo)APC?？稍诮o藥之前克隆在體外誘導(dǎo)的APC或CTL。通過克隆對靶細(xì)胞有高損傷活性的細(xì)胞并使其生長，細(xì)胞免疫療法可以更加有效地進(jìn)行。另外，以這種方式分離的APC和CTL可用于細(xì)胞免疫療法，所述療法不僅針對所述細(xì)胞來源的受試者，也針對其它受試者相似類型的腫瘤。
另外，提供了治療和預(yù)防細(xì)胞增生性疾病，諸如前列腺癌等的藥物組合物，其包含治療有效量的MICAL2-PV或PCOTH多肽。該藥物組合物可用于激發(fā)抗腫瘤免疫。正常的MICAL2-PV表達(dá)局限于睪丸，而PCOTH的表達(dá)局限于睪丸和前列腺。因此，抑制這些基因的表達(dá)不會對其它器官造成不利影響。所以，優(yōu)選MICAL2-PV和PCOTH多肽治療細(xì)胞增生性疾病，具體是前列腺癌。此外，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)在癌性細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白的肽片段能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，所以MICAL2-PV或PCOTH的肽片段也可以用在治療或預(yù)防細(xì)胞增生性疾病諸如前列腺癌等的藥物組合物中。本發(fā)明中，以足以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的劑量給藥所述多肽或其片段，該劑量范圍是0.1mg至10mg，優(yōu)選0.3mg至5mg，更優(yōu)選0.8mg至1.5mg。給藥是重復(fù)進(jìn)行的。例如，1mg所述肽或其片段可每2周給予4次以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。
另外，編碼MICAL2-PV或PCOTH，或其片段的多核苷酸也可用來激發(fā)抗腫瘤免疫。這種多核苷酸可摻入表達(dá)載體中，從而在接受治療的受試者中表達(dá)MICAL2-PV或PCOTH或其片段。因此，本發(fā)明包括誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，該方法中將編碼MICAL2-PV或PCOTH或其片段的多核苷酸給予患有或可能患細(xì)胞增生性疾病諸如前列腺癌等的受試者。
下述實(shí)施例用來解釋本發(fā)明，并幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。所述實(shí)施例并不意圖限制本發(fā)明的范圍。
除非另有定義，本文所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然與本文所述的相同或相似的方法和材料也可用來實(shí)現(xiàn)或驗(yàn)證本發(fā)明，但適宜的方法和材料如下所述。本文引用的任何專利，專利申請和出版物都包含在本文中作為參考。
本發(fā)明最佳實(shí)施方式通過下述實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
1.材料和方法(1)細(xì)胞系和臨床材料人前列腺癌細(xì)胞LNCaP，PC3和DU145購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。用RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)培養(yǎng)LNCap，Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)培養(yǎng)DU145，F(xiàn)12營養(yǎng)混合物(Invitrogen，Carlsbad，CA)培養(yǎng)PC3，每種培養(yǎng)基都添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗菌素溶液(Sigma)。
(2)用cDNA微陣列分離兩個新的人類基因已經(jīng)描述了cDNA微陣列載片的構(gòu)建(Ono等，Cancer Res 605007-11(2000))。對于每一次表達(dá)分布圖的分析，本發(fā)明人制備了兩組相同的含23,040cDNA點(diǎn)的cDNA微陣列載片，以減小試驗(yàn)波動。簡言之，從20例前列腺癌組織顯微解剖所得的前列腺癌細(xì)胞以及正常的前列腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞純化總RNA。進(jìn)行基于T7的RNA擴(kuò)增以獲得足夠的RNA進(jìn)行微陣列試驗(yàn)。從前列腺癌細(xì)胞和正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞擴(kuò)增的RNA的等分試樣分別用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP通過反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行標(biāo)記(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)。如上文所述進(jìn)行雜交，洗滌和檢測(Ono等，CancerRes 605007-11(2000))。隨后，在所有上調(diào)的基因中，焦點(diǎn)集中在內(nèi)部標(biāo)識號為D4493和A5736的兩個基因，因?yàn)樵诔^50％的提供信息的(informative)前列腺癌中，這兩個基因的表達(dá)率大于5.0，而根據(jù)發(fā)明人對29例正常人組織的基因表達(dá)所獲得的先前的數(shù)據(jù)(Saito-Hisaminato等，DNARes 935-45(2002))，這兩個基因在正常的主要生命器官中的表達(dá)水平相對較低。
(3)Northern-印跡分析使人多個組織的Northern印跡(Clontech，Palo Alto，CA)與D4493和A5736的[α-32P]dCTP標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。該P(yáng)CR產(chǎn)物是利用下述引物經(jīng)RT-PCR制備的對D4493，5’-CCGACACTCTGGG標(biāo)記GAGA-3’(SEQ.ID.NO.7)和5’-TACGTGAGCTCTGAGGACCA-3’(SEQ.ID.NO.8)；對A5736，5’-TGAAGCAACAAAGAGAGGAGGAG-3_(SEQ.ID.NO.9)和5-CCGTGTGGCACTGTAAATGATTA-3’(SEQ.ID.NO.10)。根據(jù)提供商的推薦進(jìn)行預(yù)雜交，雜交和洗滌。在-80℃，所述印跡用增光屏放射自顯影7天。
(4)半定量RT-PCR分析根據(jù)制造商的方案，用TRIzol試劑(Invitrogen)從培養(yǎng)細(xì)胞和臨床樣品提取總RNA。提取的RNA用DNAe I(Roche)處理，并用寡(dT)16引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。適當(dāng)?shù)南♂屆總€單鏈cDNA以進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增，所述擴(kuò)增是通過監(jiān)測作為定量對照的β-肌動蛋白(ACTB)進(jìn)行的。引物序列是對ACTB，5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ.ID.NO.11)和5’-TCTCCT標(biāo)記AGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ.ID.NO.12)；對D4493，5’-CCGACACTCTGGG標(biāo)記GAGA-3’(SEQ.ID.NO.13)和5’-TACGTGAGCTCTGAGGACCA-3’(SEQ.ID.NO.14)；對A5736，5’-GCAGGGATATCTTTGAGAAA-3’(SEQ.ID.NO.15)和5’-CCAGGATCTGCACAAATACA-3’(SEQ.ID.NO.16)。所有反應(yīng)包括94℃初始變性2min，然后在94℃、30s，58℃、30s，72℃、1min進(jìn)行21個循環(huán)(對ACTB)或35個循環(huán)(對D4493和A5736)，所述反應(yīng)均在GeneAmp PCR系統(tǒng)9700(PE Applied Biosystems)進(jìn)行。
(5)表達(dá)載體的構(gòu)建用下述引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增D4493 cDNA的全長編碼序列5’-CGTGGATCCC AGACCGTGCA TCATGGGCAC ATCTGAAGAAGGAAACTTGC-3’(SEQ.ID.NO.17)(D4493-正向)和5’-AATCTCGAGTCAGGGGCAGA AGGGGAATAA GG-3’(SEQ.ID.NO.18)(D4493-反向)。嚴(yán)物經(jīng)鈍化處理后插入pCAGGS neo載體的EcoRI位點(diǎn)。為檢測D4493蛋白的表達(dá)，將HA標(biāo)記融合到D4493蛋白的NH2或COOH末端。同樣，用下述引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增A5736 cDNA的整個編碼序列5’-CCCAAGCTTATGGGGGAAAA CGAGGATGA-3’(SEQ.ID.NO.19)(A5736-正向)和5’-TTTTCCTTTT GCGGCCGCGC GGAGCTTGACTGGGAAGC-3’(SEQ.ID.NO.20)(D5736-反向)。擴(kuò)增產(chǎn)物被插入pcDNA3.1(+)/myc-His(Invitrogen)的Hind III和Not I位點(diǎn)。通過DNA測序確定這些構(gòu)建體。
(6)免疫細(xì)胞化學(xué)染色根據(jù)制造商的說明，利用FuGENE 6(Roche)用pCAGGS neo-D4493和pcDNA3.1(-)-A5736-myc-His瞬時轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，所述COS7細(xì)胞隨后用4％低聚甲醛固定，并在室溫用含0.2％Triton X-100的PBS通透化3min。接著，室溫用封閉液(含0.2％Triton X-100的3％BSA/PBS)覆蓋所述細(xì)胞30min，并在室溫、封閉液中與大鼠抗HA抗體(Roche)或大鼠抗myc抗體一同溫育60min。用PBS洗滌后，細(xì)胞用FITC-偶聯(lián)的抗大鼠第二抗體(Organonteknika)和若丹明-偶聯(lián)的抗小鼠第二抗體(ICN Biomedicals)在室溫染色60min。用含4’，6’-聯(lián)脒(diamidine)-2’-苯基吲哚二氫氯化物(phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)的VECTASHIELD(VECTORLaboratories，Inc，Burlingame，CA)包埋樣品并用光譜同焦掃描系統(tǒng)(SpectralConfocal Scanning Systems)(Leica)顯像。
(7)siRNA表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)染到前列腺癌細(xì)胞用siRNA表達(dá)載體(psiU6BX)評價RNAi對靶基因的影響。將U6啟動子克隆到基因特異性序列(來自靶轉(zhuǎn)錄物的19nt序列，其通過短間隔序列TTCAAGAGA與相同序列的反向互補(bǔ)序列分離)的上游，以5個胸苷作為終止信號，并且還整合入neo盒以提供對遺傳霉素(Sigma)的抗性。D4493的靶序列分別是5’-TAGGGCCCATGGGGCCCGG-3’(SEQ.ID.NO.21)(si1)，
5’-ACCAGTTGGGCCCAAAGGC-3’(SEQ.ID.NO.22)(si2)，5’-AGGCCCAATGTTGCCCCTT-3’(SEQ.ID.NO.23)(si3)，5’-TGTTGCCCCTTGGCCCCTC-3’(SEQ.ID.NO.24)(si4)，和5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ.ID.NO.25)(EGFP)。A5736的靶序列是5’-GCTGCTGGCCTCCATATCA-3’(SEQ.ID.NO.26)(si1)，5’-TGCTTACAACTACTGCTAC-3’(SEQ.ID.NO.27)(si2)，和5’-CTACTGCTACATGTACGAG-3’(SEQ.ID.NO.28)(si3)。人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP，PC3和DU145鋪在1℃m的皿中(5×105細(xì)胞/皿)，并按照制造商的說明，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將含EGFP靶序列的psiU6BX(psiU6BX-EGFP)以及含有靶序列的psiH1BX(psiU6BX-si1～4(D4493)或si1～3(A5733))轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。用500mg/ml遺傳霉素處理一周篩選細(xì)胞，收獲經(jīng)初步篩選的細(xì)胞(preliminary cell)用于所述靶基因的表達(dá)分析，并用RT-PCR進(jìn)行分析。RT-PCR的引物與上文所述相同。這些細(xì)胞也可用姬姆薩溶液染色和進(jìn)行MTT試驗(yàn)。
2.結(jié)果(1)鑒定PCOTH以及MICAL2的前列腺癌變體(MICAL2-PV)為前列腺癌細(xì)胞中上調(diào)的基因用代表23,040個人基因的cDNA微陣列分析從20例前列腺癌中純化的癌細(xì)胞的基因表達(dá)分布圖。結(jié)果，鑒定出在前列腺癌細(xì)胞中通常上調(diào)的88個基因。在這些被鑒定的基因中，焦點(diǎn)集中在內(nèi)部代碼為D4493的基因，它在超過50％的前列腺癌中顯著上調(diào)，并且經(jīng)RT-PCR證實(shí)了它在前列腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)模式(圖1)。D4493與兩個來自前列腺癌cDNA文庫的EST(BC015452和BG178505)重疊，并發(fā)現(xiàn)它與LOC221179(XP 167955)相同。比較小鼠/大鼠的基因組序列，確定了一個新的LOC221179編碼區(qū)，它編碼100個氨基酸的蛋白質(zhì)。Northern印跡分析顯示LOC221179在前列腺和睪丸中高度且局限化的表達(dá)(圖1B)。這個產(chǎn)物有一個特征結(jié)構(gòu)域即膠原三螺旋重復(fù)(圖1C)，這是膠原超家族的特征。因此，該基因稱作“PCOTH(前列腺膠原三螺旋)”。
關(guān)注另一個基因A5736，它同樣在超過50％的前列腺癌中顯著上調(diào)，并且經(jīng)RT-PCR證實(shí)了它在前列腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)模式(圖2A)。該基因與MICAL2(與CasL相互作用的分子2(Molecule Interacting with CasL 2))重疊。用A5736的序列作為探針進(jìn)行的Northern印跡分析顯示約7.5kb的轉(zhuǎn)錄物在睪丸和前列腺癌細(xì)胞系中大量表達(dá)。然而，已證實(shí)MICAL 2的正常轉(zhuǎn)錄物大小為3.8kb(圖2B)。為了解釋這種大小的差異，周RACE來確定未知的經(jīng)轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。利用睪丸cDNA進(jìn)行RACE，結(jié)果鑒定了7.5kb的新MICAL2變體。該鑒定的變體的3’末端編碼區(qū)不同于MICAL2，并編碼976個氨基酸殘基，而正常MICAL2蛋白有1124個氨基酸殘基(圖2C)。如本發(fā)明所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩種新的MICAL2變體，一種是長型變體(登錄號AB110785)，一種是短型變體(登錄號AB110786)，其中長型變體中刪除了一個外顯子。本文中，變體統(tǒng)稱為“MICAL2-PV(MICAL2前列腺癌變體)”。
(2)亞細(xì)胞定位為進(jìn)一步研究PCOTH和MICAL2-PV蛋白的亞細(xì)胞定位，將這些蛋白與標(biāo)記連接，并在COS7細(xì)胞中瞬時過表達(dá)以進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。如圖3所示，外源性PCOTH-HA蛋白位于細(xì)胞膜或亞膜(圖3A)，外源性MICAL2-PV-Myc蛋白位于COS7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖3B)。
(3)前列腺癌細(xì)胞系中siRNA介導(dǎo)的生長抑制為了研究這些基因的過表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞的生長或存活的影響，用基于哺乳動物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)特異性敲除這些基因的內(nèi)源性表達(dá)。轉(zhuǎn)染產(chǎn)siRNA載體導(dǎo)致內(nèi)源性表達(dá)的降低，所述載體含一些為PCOTH(圖4A)和MICAL2-PV(圖4D)設(shè)計的siRNA。siRNA對PCOTH轉(zhuǎn)錄物的敲除效應(yīng)導(dǎo)致集落形式實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)烈的生長抑制(圖4B和4C)。siRNA對MICAL2-PV轉(zhuǎn)錄物的敲除效應(yīng)同樣導(dǎo)致集落形式實(shí)驗(yàn)中的生長抑制(圖4E)。這些發(fā)現(xiàn)有力證明了前列腺癌細(xì)胞中PCOTH和MICAL2-PV的過表達(dá)與癌細(xì)胞的生長相關(guān)聯(lián)，并且這些基因或其編碼的蛋白是治療前列腺癌的有希望的分子靶，在治療中這些基因被封閉或敲除。
工業(yè)實(shí)用性與非癌性前列腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比，人MICAL2-PV和PCOTH基因在前列腺癌中的表達(dá)顯著提高。因此，這些基因可作為前列腺癌的診斷標(biāo)志，其編碼的蛋白可用于前列腺癌的診斷實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明還指出新蛋白MICAL2-PV或PCOTH的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長，而對應(yīng)于MICAL2-PV或PCOTH基因的小干擾RNA抑制細(xì)胞生長。這些發(fā)現(xiàn)提示MICAL2-PV和PCOTH蛋白都刺激致癌活性。因此，這些新的癌蛋白都是研發(fā)抗癌藥物的有用靶。例如，阻斷MICAL2-PV或PCOTH表達(dá)或抑制其活性的藥劑可用作抗癌藥劑，具體地用作治療前列腺癌的抗癌藥劑。這種藥劑的實(shí)例包括抗MICAL2-PV或PCOTH基因的反義寡核苷酸，小干擾RNA和核酶，以及識別MICAL2-PV或PCOTH的抗體。
已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明并以具體實(shí)施例作為參考，不偏離本發(fā)明精神和范疇進(jìn)行的各種改變和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
序列表<110>腫瘤療法科學(xué)股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO<120>前列腺癌相關(guān)基因和多肽<130>ONC-A0216P2<150>US 60/414,873<151>2002-09-30<160>28<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>826<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(332)..(634)<223>
<400>1aaggggctca tgcagaagca gttcccggac ccgacactct gggtaggaga ccactaaacc 60cggcccctca aagcagaggt gaccttgccc tcatcgagag cgcacacaag acgccactgt120aaaaggatca cagatggaga gacattttgc cacacgatga atcacacacc acatctcatc180cccgagcttc agctgcagga caatgctgec agaggcctgg tcctcagagc tcacgtaagc240atctctggtg tgcagtattt ttactccgtt tttgaccaaa gacacctgaa cattcctgga300gaaaacagtg atgtggatct tatcaaattt a atg ggc aca tct gaa gaa gga 352Met Gly Thr Ser Glu Glu Gly1 5aac ttg ctc agc acc gtg agc ccc aca gtg aaa gca ctt ttt ggc aag 400Asn Leu Leu Ser Thr Val Ser Pro Thr Val Lys Ala Leu Phe Gly Lys10 15 20
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Pro Trp Gly Pro Val Gly Pro Ala Ser Pro Leu Gly Pro Gly Phe Pro50 55 60Ile Gly Pro Met Gly Pro Gly Lys Pro Val Gly Pro Lys Gly Pro Met65 70 75 80Leu Pro Leu Gly Pro Ser Gly Pro Val Gly Pro Thr Ser Pro Leu Phe85 90 95Pro Phe Cys Pro100<210>3<211>6805<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(265)..(3195)<223>
<400>3ccgggccgcc tcgctcgctc ccagetctgt cagtggcccg cggggcccga tcgctgcgcc 60cgcggccagg gccgaggcag gcctgacccg gggccgggca gcccgcgcga ctttcggaac120atggcaaccc gtgtgtgtct catcccagaa agagaagact ttaaccactg tgatgcctga180gaatccagtg tgacgtttct ccagatactt catgctgttc acctgtgtcc tcgccgcacc240actgccgcac acgactcctg aacc atg ggg gaa aac gag gat gag aag cag 291Met Gly Glu Asn Glu Asp Glu Lys Gln1 5gcc cag gcg ggg cag gtt ttt gag aac ttt gtc cag gca tcc acg tgc 339Ala Gln Ala Gly Gln Val Phe Glu Asn Phe Val Gln Ala Ser Thr Cys10 15 20 25aaa ggt acc ctc cag gcc ttc aac att ctc aca cga cac ctg gac cta 387Lys Gly Thr Leu Gln Ala Phe Asn Ile Leu Thr Arg His Leu Asp Leu
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cccaagctta tgggggaaaa cgaggatga29<210>20<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>20ttttcctttt gcggccgcgc ggagcttgac tgggaagc 38<210>21<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>21tagggcccat ggggcccgg 19<210>22<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>22accagttggg cccaaaggc 19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工
<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>23aggcccaatg ttgcccctt19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>24tgttgcccct tggcccctc19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>25gaagcagcac gacttcttc19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>26gctgctggcc tccatatca19<210>27
<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>27tgcttacaac tactgctac19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于SiRNA的人工合成靶序列<400>28ctactgctac atgtacgag19
權(quán)利要求
1.選自以下組的基本純的多肽(a)含有SEQ ID NO4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中的一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ IDNO4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ IDNO4或6所示任一氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
2.選自以下組的基本純的多肽(a)由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的多肽；和(b)由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代和/或缺失，并且該多肽具有與由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性。
3.分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1或2所述多肽。
4.載體，其含有權(quán)利要求3所述多核苷酸。
5.宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述多核苷酸或權(quán)利要求4所述載體。
6.制備權(quán)利要求1或2所述多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞；(b)使該宿主細(xì)胞表達(dá)所述多肽；和(c)收集表達(dá)的多肽。
7.抗體，其與權(quán)利要求1所述多肽結(jié)合。
8.多核苷酸，所述多核苷酸與編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)，并且包含至少15個核苷酸。
9.反義多核苷酸或小干擾RNA，其為編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA。
10.權(quán)利要求9所述的小干擾RNA，其有義鏈?zhǔn)荢EQ ID NO27所示的核苷酸序列。
11.診斷前列腺癌的方法，所述方法包括以下步驟(a)檢測生物樣品中基因的表達(dá)水平，所述基因編碼SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列；和(b)使所述表達(dá)水平的提高與所述疾病相關(guān)聯(lián)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中以選自以下組的任意一種方法檢測所述表達(dá)水平(a)檢測編碼SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的mRNA，(b)檢測含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和(c)檢測含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性。
13.篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使受試化合物與選自以下組的多肽接觸(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測所述多肽和受試化合物之間的結(jié)合活性；和(c)選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。
14.篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使受試化合物與選自以下組的多肽接觸(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)選出抑制所述多肽的生物活性的化合物，所述生物活性是與沒有該受試化合物時檢測到的生物活性相比。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述生物活性是細(xì)胞增生活性。
16.篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使受試化合物與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞表達(dá)一或多種含SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列的多核苷酸；和(b)選出降低一或多種含SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列的多核苷酸的表達(dá)水平的化合物，所述表達(dá)水平是與沒有該受試化合物時檢測到的表達(dá)水平相比。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞是前列腺癌細(xì)胞。
18.篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將受試化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，所述載體包含一或多種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報告基因，其中所述一或多種標(biāo)記基因包含選自SEQ IDNO 1，3或5之一的核苷酸序列，(b)測定所述報告基因的活性；和(c)選擇與對照相比降低所述報告基因的表達(dá)水平的化合物。
19.篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)在存在受試化合物的情況下，使選自以下組的多肽與肌動蛋白接觸(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測所述多肽與肌動蛋白之間的結(jié)合；和(c)選擇抑制所述多肽與肌動蛋白之間結(jié)合的受試化合物。
20.一種用于治療或預(yù)防前列腺癌的組合物，所述組合物包含藥物有效量的活性成分以及可藥用的載體，其中所述活性成分為編碼下組多肽之一的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述小干擾RNA的有義鏈?zhǔn)荢EQ IDNO23或27所示的核苷酸序列。
22.一種用于治療或預(yù)防前列腺癌的組合物，所述組合物包含藥物有效量的的抗多肽抗體作為活性成分并含有可藥用載體，其中所述多肽選自(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
23.一種用于治療或預(yù)防前列腺癌的組合物，所述組合物包含藥物有效量的活性成分以及可藥用的載體，所述活性成分為通過權(quán)利要求13-19任意一種方法選出的化合物。
24.治療或預(yù)防前列腺癌的方法，所述方法包括給予藥物有效量的反義多核苷酸或小干擾RNA的步驟，該反義多核苷酸或小干擾RNA針對編碼選自下組的多肽的多核苷酸(1)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述小干擾RNA的有義鏈?zhǔn)荢EQ IDNO23或27所示的核苷酸序列。
26.治療或預(yù)防前列腺癌的方法，所述方法包括給予藥物有效量的抗多肽抗體的步驟，所述多肽選自(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ IDNO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ IDNO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
27.治療或預(yù)防前列腺癌的方法，所述方法包括給予藥物有效量的化合物的步驟，所述化合物通過權(quán)利要求13-19任意一種方法選出。
28.治療或預(yù)防前列腺癌的方法，所述方法包括給予藥物有效量的多肽或編碼該多肽的多核苷酸的步驟，所述多肽選自(a)-(c)之一(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
29.誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括將選自(a)-(c)之一的多肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸，或?qū)⒕幋a所述多肽的多核苷酸或含有該多核苷酸的載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞的步驟(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
30.權(quán)利要求29的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中該方法進(jìn)一步包括將所述抗原呈遞細(xì)胞給予受試者的步驟。
31.治療或預(yù)防癌的藥物組合物，所述組合物包含藥物有效量的活性成分以及可藥用的載體，其中所述活性成分為選自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸(a)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且該多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO1，3或5所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4或6所示氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中所述多核苷酸摻入到表達(dá)載體中。
33.一種診斷試劑，其包含與編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸雜交的寡核苷酸或與權(quán)利要求1所述多肽結(jié)合的抗體。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝诵碌娜嘶騇ICAL2－PV，它在前列腺癌中的表達(dá)顯著提高。另外，本申請?zhí)峁┝嗽摶蚓幋a的多肽以及PCOTH編碼的多肽，發(fā)現(xiàn)PCOTH編碼的多肽在前列腺癌中的表達(dá)也提高。這些基因及其編碼的多肽可用于，例如，診斷前列腺癌，作為研發(fā)抗病藥物的靶分子，以及減少前列腺癌細(xì)胞的生長。
文檔編號C12Q1/68GK1701078SQ0382534
公開日2005年11月23日 申請日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者中村佑輔, 片桐豐雅, 中川英刀, 中鶴修一 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司, 國立大學(xué)法人東京大學(xué)