專利名稱：肝臟f蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法和該表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法和該表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類肝臟F抗原是一種新型的處于研究階段的直接反映肝損傷程度的血清學(xué)標(biāo)志。
80年代中期，美國、英國和日本從事肝病和肝腫瘤研究的實(shí)驗(yàn)室，開始研究血清F抗原含量與肝臟疾病如急、慢性肝炎、肝癌和肝中毒所致肝損傷程度的關(guān)系，結(jié)果表明二者呈正相關(guān)。
研究表明，當(dāng)某些病人肝臟已經(jīng)損傷或已經(jīng)出現(xiàn)肝臟腫瘤時(shí)血清F抗原增高，而其血清AST和ALT還處于正常水平，說明血清F抗原是某些肝損傷的標(biāo)志，而這些肝損傷有些是血清酶檢查不出來的。
《Chin Chim Acta》1989；18485，報(bào)道Foster發(fā)現(xiàn)F抗原對(duì)肝病診斷符合率達(dá)96％以上，并且發(fā)現(xiàn)臨床上能夠明確診斷肝癌前三個(gè)月到一年期間，血清F抗原水平持續(xù)升高，此時(shí)甲胎蛋白(AFP)的陽性率只有70％，F(xiàn)抗原和甲胎蛋白之間無關(guān)聯(lián)，從肝細(xì)胞瘤提取物中測(cè)定F抗原發(fā)現(xiàn)眾多肝細(xì)胞瘤含有人特異F抗原決定簇。而在胃癌和其他消化道腫瘤病人中，AFP陽性率增高，而血清F抗原水平正常，表明在腫瘤的特異性與早期診斷方面，F(xiàn)抗原無疑是更好的選擇。
肝臟F蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物是一種水溶性單鏈蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為44000。
Sambrook J.et.al，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，1996，介紹的F抗原制備方法是首先提取人和大鼠肝臟組織總mRNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出F蛋白基因的cDNA，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR獲取F抗原基因；然后，F(xiàn)抗原基因在克隆載體pUCm-T的多克隆位點(diǎn)上進(jìn)行DNA連接，進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，在藍(lán)白斑篩選平板挑選白色菌落轉(zhuǎn)板，液培過夜，獲得pUCm-T-F質(zhì)粒；再對(duì)pUCm-T-F質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切后的小片斷與同樣雙酶切的pET-15b載體連接，16℃過夜，將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliB21 DE3 plysS中，在含氨芐青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子；在含有氨芐青霉素(Amp+)和氯霉素(Cm+)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)含質(zhì)粒pET15b-F的表達(dá)菌BL21(DC3)plysS至OD600在0.4-0.6之間，加入IPTG繼續(xù)培養(yǎng)37℃3-7小時(shí)，全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，完成蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；最后，將100ml表達(dá)菌液離心沉淀，加入溶菌酶IX Binding buffer10mg/ml振蕩搖勻，30℃水浴，超生粉碎，離心、棄上清，用IX Bindingbuffer和尿素分別洗滌、溶解沉淀，室溫離心取上清，即為初步純化的F蛋白；將初步純化的F蛋白加到13柱床體積的IX Binding buffer逐步加到His-taq柱上逐步洗掉雜蛋白，收集流出液即為純化的F蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決大規(guī)模獲取人肝F抗原，并為快速準(zhǔn)確診斷各種肝病所致的肝細(xì)胞損傷程度，而提供一種肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法和該表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
人肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物，該表達(dá)產(chǎn)物能夠特異地靈敏準(zhǔn)確的反映肝細(xì)胞損傷程度，人類肝臟F抗原原核表達(dá)產(chǎn)物cDNA序列如圖7所示；鼠肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物，該表達(dá)產(chǎn)物能夠特異地靈敏準(zhǔn)確的反映肝細(xì)胞損傷程度，鼠肝臟F抗原原核表達(dá)產(chǎn)物的cDNA序列如圖8所示。
人或大鼠肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，首先提取肝臟組織總mRNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出F蛋白基因的cDNA，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲取F抗原基因；然后，F(xiàn)抗原基因在克隆載體pUCm-T的多克隆位點(diǎn)上進(jìn)行DNA連接，進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，在藍(lán)白斑篩選平板挑選、轉(zhuǎn)板，獲得pUCm-T-F質(zhì)粒；再對(duì)測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-F質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，篩選轉(zhuǎn)化子，完成蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；最后將初步純化的F蛋白經(jīng)Ni-chargedIDA His-bind column進(jìn)行親和層析；其特征在于a.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的人上游引物序列5’-GTA CTG GGA CAA AGG ACC AAA GCC-3’下游引物序列5’GAT CTG GGA AGG CAT CTT TAC TCG-3’；鼠上游引物序列5′P-CGG CAT ATG TAC TGG GAC TGG GAC AAA GGACCA AAG CCT-3′下游引物序列5′P-TCC AGA CCT CAC ACC GTT-3′；b.蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件是在含有氨卞青霉素(Amp+)和氯霉素(Cm+)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)含質(zhì)粒pET15b-F的表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS至OD600在0.4-0.6之間，此時(shí)加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)37℃培養(yǎng)3-7h；
所述的制備方法，其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的鼠上游引物序列5’-CGG CAT ATG TAC TGG GAC AAA GGA CCA AAGCCT GAG AGA-3’下游引物序列5’-TCC AGA CCT CAC ACC GTT GGT CTC CAG-3’。
所述的制備方法，其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的鼠上游引物序列5’-CTG GAT CCG GAG GTT TGA CTA AGA TCA ATCA-3’下游引物序列5’-GCG AAT TCT GGA TCT GGG ACT TCT TCTTG-3’。
所述的制備方法，其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的鼠上游引物序列5’-CTG GAT CCG GTG CAC ACG GAA TAT AGCTC-3’下游引物序列5’-GCC AAT TCT TTA ATC GGG AGG GCT GGA-3’。
所述的培養(yǎng)方法，其大腸桿菌(E.coli)過夜培養(yǎng)，分別在E.coliOD值在0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0時(shí)加入1.0mM IPTG。
所述的培養(yǎng)方法，其大腸桿菌(E.coli)過夜培養(yǎng)，當(dāng)其OD值在0.4～0.6之間，即當(dāng)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，分別向其中加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0mM的IPTG。
所述的培養(yǎng)方法，其大腸桿菌(E.coli)過夜培養(yǎng)，當(dāng)其OD值在0.4～0.6之間，即當(dāng)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，向其中加入1.0mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并且分別在誘導(dǎo)后1h，2h，3h，4h，5h，6h取樣；表達(dá)人類肝臟F蛋白時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間增加至7h。
人或大鼠肝臟F蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用，該表達(dá)產(chǎn)物可制備F抗原抗體，標(biāo)記抗體；制備診斷試劑盒，用于檢測(cè)人類血清中的F抗原，從而判斷人類肝臟細(xì)胞損傷的程度。
這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明可為大規(guī)模獲取F抗原及快速準(zhǔn)確診斷各種肝病所致肝細(xì)胞損傷程度，并為建立一套全新的方法奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為進(jìn)一步闡明F抗原的未知的生物學(xué)功能做好理論與物質(zhì)準(zhǔn)備，具有相當(dāng)?shù)膶W(xué)術(shù)意義和潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明制備的人和大鼠肝臟F蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物，其特異性、靈敏性、可靠性均優(yōu)于現(xiàn)在的肝功能指標(biāo)。


圖1是人PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖；圖2是人重組克隆載體pUCm-T酶切電泳圖；圖3是人pET15b-F全菌蛋白SDS-PAGE及Western-blot雜交結(jié)果；圖4是鼠PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖；
圖5是鼠重組克隆載體pUCm-T酶切電泳圖；圖6是鼠Western-blot雜交結(jié)果；圖7是人肝臟F抗原的cDNA序列；圖8是鼠肝臟F抗原的cDNA序列。
圖1中1 DNA maker；2 RT-PCR產(chǎn)物；3陰性對(duì)照。
圖2中1 MarkerλDNA/EcoR I+Hind III；2人肝臟總mRNA的RT-PCR產(chǎn)物；3單酶切處理的空載質(zhì)粒pUCm-T；4重組質(zhì)粒pUCm-T-F/BamH I+Nde I雙酶切；5重組質(zhì)粒pUCm-T-F/BamHI單酶切。
圖3中1蛋白質(zhì)低分子量Marker；2 IPTG誘導(dǎo)含外源基因表達(dá)載體pET15b-F表達(dá)后的全菌蛋白；3誘導(dǎo)含外源基因表達(dá)菌表達(dá)后裂解離心所得包涵體沉淀；4誘導(dǎo)含外源基因表達(dá)菌表達(dá)后離心上清；5 IPTG誘導(dǎo)無外源基因F表達(dá)菌的表達(dá)蛋白；6 IPTG誘導(dǎo)無外源基因F表達(dá)菌的離心上清；7過His-tag柱純化后的F蛋白；8純化后的F蛋白的Western-blot檢測(cè)結(jié)果。
圖4中Lane 1 DL-2000 Marker；Lane 2 PCR反應(yīng)產(chǎn)物；Lane 3空白對(duì)照(未加模板)圖5中Lane1 MarkerλDNA/EcoR I+Hind III；Lane2重組質(zhì)粒pUCm-T-F/BamH I單酶切；Lane3重組質(zhì)粒pUCm-T-F/BamH I+EcoR I雙酶切；Lane4單酶切處理的空載質(zhì)粒pUCm-T；Lane5大鼠肝臟總mRNA的RT-PCR產(chǎn)物；Lane6重組質(zhì)粒pUCm-T-F的PCR產(chǎn)物；Lane7空載質(zhì)粒pUCm-T的PCR產(chǎn)物。
圖6中Lane1蛋白質(zhì)低分子量Marker；Lane2表達(dá)菌誘導(dǎo)后裂解離心所得包涵體沉淀；Lane3尿素溶解后的包涵體；Lane4表達(dá)菌誘導(dǎo)后裂解離心所得上清液；Lane5未經(jīng)誘導(dǎo)的表達(dá)菌；Lane6含空載體(pET-15b，不含外源基因F)的表達(dá)菌誘導(dǎo)后總蛋白；Lane7不含表達(dá)載體的空表達(dá)菌株誘導(dǎo)后的總蛋白；Lane8過His-tag柱純化后的F蛋白；Lane9純化后的F蛋白的Western-blot檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
人肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物，該表達(dá)產(chǎn)物能夠特異地靈敏準(zhǔn)確的反映肝細(xì)胞損傷程度，人類肝臟F抗原原核表達(dá)產(chǎn)物cDNA序列如圖7所示；鼠肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物，該表達(dá)產(chǎn)物能夠特異地靈敏準(zhǔn)確的反映肝細(xì)胞損傷程度，鼠肝臟F抗原原核表達(dá)產(chǎn)物的cDNA序列如圖8所示。
1.F抗原基因的獲得RT-PCR擴(kuò)增出F蛋白基因的cDNA
根據(jù)Gene-Bank上提供的鼠F蛋白的cDNA序列，設(shè)計(jì)出上下游引物(在上游引物中加入Nde I的酶切位點(diǎn))，使用RT-PCR的方法擴(kuò)增出F蛋白的cDNA。
(1)反轉(zhuǎn)錄出cDNA的第一鏈?zhǔn)笙掠我镄蛄?’P-TCC AGA CCT CAC ACC GTT-3’人下游引物序列5’-GATCTGGGAAGGCATCTTTACTCG-3’具體步驟如下模板RNA 2μl下游引物 5μl于65℃，5min預(yù)處理，然后迅速置于冰中；再加入5 x Rerverse Buffer4μldNTP mixture 2μlRNase Inhibitor1μlAMV Reverse Transcipta se 2μlDEPC-H2O 4μl于42℃，60min；94℃，5min。
(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)具體反應(yīng)所用試劑如下滅菌雙蒸水20μlEx Taq Premix 25μl模板cDNA 1μl上游引物 2μl下游引物 2μl總體積 50μl以30μl石蠟油覆蓋反應(yīng)液，在PCR儀上擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，條件如下鼠上游引物序列5’-CGGCATATGTACTGGGACAAAGGACCAAAGCCT-3’下游引物序列5’-TCC AGA CCT CAC ACC GTT-3’人上游引物序列5’-GTACTGGGACAAAGGACCAAAGCC-3’下游引物序列5’-GATCTGGGAAGGCATCTTTACTCG-3’所述的制備方法，也可以是其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的鼠上游引物序列5’-CGG CAT ATG TAC TGG GAC AAA GGA CCA AAGCCT GAG AGA-3’下游引物序列5’-TCC AGA CCT CAC ACC GTT GGT CTC CAG-3’所述的制備方法，也可以是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的鼠上游引物序列5’-CTG GAT CCG GAG GTT TGA CTA AGA TCA ATC
A-3’下游引物序列5’-GCG AAT TCT GGA TCT GGG ACT TCT TCT TG-3’所述的制備方法，也可以是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的鼠上游引物序列5’-CTG GAT CCG GTG CAC ACG GAA TAT AGCTC-3’下游引物序列5’-GCG AAT TCT TTA ATC GGG AGG GCT GGA-3’94℃，5min，1 cycle；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1.5min，35 cycles；72℃，10min，1cycle；反應(yīng)結(jié)束后，取4μl產(chǎn)物電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果。
2.F抗原的表達(dá)、純化及檢測(cè)2.1表達(dá)載體的構(gòu)建2.1.1將測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(Nde I/BamH I)，并將酶切后的小片斷(1.3kb)與經(jīng)同樣雙酶切的pET-15b載體進(jìn)行連接，16℃過夜后，將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)plysS中，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。
2.1.2酶切鑒定分別提取各轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定。對(duì)酶切鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET15b-F。
2.2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)在含有氨卞青霉素(Amp+)和氯霉素(Cm+)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)含質(zhì)粒pET15b-F的表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS至OD600在0.4-0.6之間，此時(shí)加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)37℃培養(yǎng)3-7h。全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)其表達(dá)情況，以不含pET15b-F表達(dá)質(zhì)粒的空菌株BL21(DE3)pLysS和含空載體pET15b但不含外源基因F的菌株作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
2.3表達(dá)蛋白的純化2.3.1初步純化(1)將100ml表達(dá)菌液置于12000rpm離心10min，控干沉淀后混勻。
(2)加入1X Binding buffer 15ml，TritonX-100 10μl，10mg/ml溶菌酶100μl，振蕩搖勻。
(3)30℃水浴15min。
(4)超聲波破碎細(xì)胞，至菌液不粘稠。
(5)12000rpm離心15min，棄上清。
(6)所得沉淀用20ml 1Xbinding buffer洗滌幾次，再用2mol/L和4mol/l尿素各洗滌一次。
(7)用含8mol/l尿素的1Xbinding buffer 6ml溶解最終沉淀物。
(8)室溫12,000rpm離心20min后收集上清，即為初步純化的F蛋白。
2.3.2 Ni-charged IDA His-bind column進(jìn)行親和層析(1)配制13柱床體積的1Xbinding buffer逐步加到His-taq柱上。
(2)將初步純化的F蛋白逐步加到His-taq柱上。
(3)用8ml Washingbuffer逐步洗掉雜蛋白，并收集流出液，0.5ml/管，待電泳。
(4)最后用10ml Elute buffer逐步洗脫，并將洗脫液分管0.5ml/管保存好以待電泳檢測(cè)。
2.4表達(dá)蛋白的檢測(cè)2.4.1聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將表達(dá)的全菌蛋白及純化后的蛋白分別進(jìn)行檢測(cè)。
采用變性不連續(xù)垂直板電泳，上層濃縮膠濃度為5％，下層分離膠濃度為15％。
(1)凝膠的制備按表中所列數(shù)據(jù)(來自《分子克隆》手冊(cè))分別配制分離膠和濃縮膠溶液SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配制比例單位ml

(2)樣品的處理分別向標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測(cè)樣品中加入等體積的蛋白質(zhì)樣品處理液，在100℃水浴中處理2-3min，冷卻至室溫后備用。
(3)上樣和電泳上樣量樣品均為20μl
電壓濃縮膠為8V/cm；分離膠為15V/cm2.4.2 Western-blot檢測(cè)分析(1)轉(zhuǎn)膜將SDS-PAGE的膠中蛋白在轉(zhuǎn)移緩沖液中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)移條件25V，2小時(shí)。
(2)Western-blot反應(yīng)將轉(zhuǎn)移好的膜用TBS漂洗5次，5min/次；加入封閉液(TBST+4％脫脂奶粉)室溫封閉1h，TBST洗膜3次，加入適當(dāng)稀釋的第一抗體(豚鼠抗大鼠F蛋白多克隆抗體、豚鼠抗人F蛋白多克隆抗體)，室溫?fù)u動(dòng)2h使一抗與抗原結(jié)合；TBST洗三次，加入酶標(biāo)第二抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG抗體)，室溫?fù)u動(dòng)2h；TBST洗三次，雙蒸水洗一次。加入DAB顯色5min，水洗滌終止反應(yīng)。
3.蛋白表達(dá)量與外部因素的關(guān)系3.1F蛋白表達(dá)量與誘導(dǎo)前大腸桿菌濃度的關(guān)系大腸桿菌(E.coli)過夜培養(yǎng)，分別在E.coliOD值在0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0時(shí)加入1.0mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-7h，然后將菌液12,000rpm離心15min，棄上清，將菌體打散，對(duì)全菌進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。
3.2F蛋白表達(dá)量與誘導(dǎo)劑(IPTG)濃度的關(guān)系大腸桿菌(E.coli)過夜培養(yǎng)，當(dāng)其OD值在0.4～0.6之間，即當(dāng)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，分別向其中加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)3h，然后將菌液12,000rpm離心15min，棄上清，將菌體打散，對(duì)全菌進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。
3.3F蛋白表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系大腸桿菌(E.coli)過夜培養(yǎng)，當(dāng)其OD值在0.4～0.6之間，即當(dāng)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，向其中加入1.0mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并且分別在誘導(dǎo)后1h，2h，3h，4h，5h，6h取樣(表達(dá)人類肝臟F蛋白時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間增加至7h)置于1.5ml離心管中，將菌液12,000rpm離心15min，棄上清，將菌體打散，對(duì)各管全菌進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。
Untitled41.ST25-1SEQUENCE LISTING<110>天津市第三中心醫(yī)院<120>肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法和該表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用<130>人<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1134<212>DNA<213>人<220>
<221>DNA<222>(1)..(1134)<223>
<400>1atggtactgg gacaaaggac caaagcctga gagaggccgg ttcctccatt tccactctgt 60gaccttctgg gttggcaacg ccaagcaggc tgcctccttc tattgcaaca agatgggctt120cgaaccgctg gcctacaagg gcctggagac gggctcccgg gaggtggtca gtcatgtcgt180caagcaaggg aaaattgtgt ttgttctctg ctctgctctc aatccctgga acaaagagat240gggtgaccac ctggtgaagc atggtgatgg cgtaaaggac atcgcattcg aggtggaaga300ctgtgaacac attgtgcaga aagcccgaga acggggcgct aaaat tgtac gggagccatg 360ggtggaggaa gacaaattcg ggaaggtgaa gttcgctgtg ctgcagacgt atggagatac420cacgcacacc ctggtggaga agatcaacta caccggtcgt ttcttacctg gattcgaggc480cccaacatac aaggacaccc tacttccaaa actacccagc tgtaacctgg agatcatcga540ccatattgta ggcaaccagc ccgaccagga aatggagtct gcctcagaat ggtacctgaa600aaacctgcag ttccaccggt tctggtctgt agacgacaca caggtgcaca cggagtatag660ctctctgcgc tccatcgtgg tggccaacta tgaggagtcc atcaaaatgc ccattaatga720accggccccg ggcaggaaga agtctcagat ccaggaatat gtggactata atgggggtgc780tggggtccag cacatcgctc tcaggaccga agacatcatc acaacgatct gccacttgag840ggaacgaggc atggagttct tggctgtccc gtcttcttac tacagactgc ttcgggagaa900tctcaagacc tccaagatcc aagtgaagga gaacatggat gtcttggagg agctaaaaat960
Untitled41.ST25-1cctggtagac tacgatgaga aaggctacct cctacagatc ttcaccaagc ccatgcagga 1020ccggcccacg ctcttcttgg aagtcatcca acgccacaac caccagggct ttggagcagg 1080taacttcaac tctctgttca aagctttcga agaggagcaa gccctacggg gtaa1134SEQUENCE LISTING<110>天津市第三中心醫(yī)院<120>肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法和該表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用<130>鼠<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1333<212>DNA<213>鼠<220>
<221>DNA<222>(1)..(1134)<223>
<400>1gtactgggac aaaggaccaa agcctgagag aggccggttc ctccatttcc actctgtgac 60cttctgggtt ggcaacgcca agcaggctgc ctccttcta ttgcaacaaga tgggcttcga120accgctggcc tacaagggcc tggagacggg ctcccgggag gtggtcagtc atgtcatcaa180gcaagggaaa attgtgtttg ttctctgctc tgctctcaat ccctggaaca aagagatggg240tgaccacctg gtgaagcatg gtgatggcgt aaaggacatc gcattcgagg tggaagactg300tgaacacatt gtgcagaaag cccgagaacg gggcgctaaa attgtacggg agccatgggt360ggaggaagac aaattcggga aggtgaagtt cgctgtgctg cagacgtatg gagataccac420gcacaccctg gtggagaaga tcaactacac cggtcgtttc ttacctggat tcgaggcccc480aacatacaag gacaccctac ttccaaaact acccagctgt aacctggaga tcatcgacca540tattgtaggc aaccagcccg accaggaaat ggagtctgcc tcagaatggt acctgaaaaa600cctgcagttc caccggttct ggtctgtaga cgacacacag gtgcacacgg agtatagctc660tctgcgctcc atcgtggtgg ccaactatga ggagtccatc aaaatgccca ttaatgaacc720ggccccgggc aggaagaagt ctcagatcca ggaatatgtg gactataatg ggggtgctgg780
Untitled41.ST23-1ggtccagcac atcgctctca ggaccgaaga catcatcaca acgatccgcc acttgaggga 840acgaggcatg gagttcttgg ctgtcccgtc ttcttactac agactgcttc gggagaatct 900caagacctcc aagatccaag tgaaggagaa catggatgtc ttggaggagc taaaaatcct 960ggtagactac gatgagaaag gctacctcct acagatcttc accaagccca tgcaggaccg1020gcccacgctc ttcttggaag tcatccaacg ccacaaccac cagggctttg gagcaggtaa1080cttcaactct ctgttcaaag ctttcgaaga ggagcaagcc ctacggggtt aacctcactg1140acctggagac caacggtgtg aggtctggaa tgtaagctcc acccacaccc agaccgcgca1200aggcgctgga caagtcaatc agctccaact ggctgaaagg ctggacctca gggctccacc1260cacaccatgg ccacgccccc tctacggcaa ggcttctcct gatccgtttc gagtaaagat1320gccttcccag atc 133權(quán)利要求
1.一種人肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于該表達(dá)產(chǎn)物能夠特異地靈敏準(zhǔn)確的反映肝細(xì)胞損傷程度，人類肝臟F抗原cDNA序列如圖7所示。
2.一種鼠肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于該表達(dá)產(chǎn)物能夠特異地靈敏準(zhǔn)確的反映肝細(xì)胞損傷程度，鼠肝臟F抗原的cDNA序列如圖8所示。
3.肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，首先提取肝臟組織總mRNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出F蛋白基因的cDNA，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲取F抗原基因；然后，F(xiàn)抗原基因在克隆載體pUCm-T的多克隆位點(diǎn)上進(jìn)行DNA連接，進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，在藍(lán)白斑篩選平板挑選、轉(zhuǎn)板，獲得pUCm-T-F質(zhì)粒；再對(duì)測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-F質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，篩選轉(zhuǎn)化子，完成蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；最后將初步純化的F蛋白經(jīng)Ni-charged IDA His-bindcolumn進(jìn)行親和層析；其特征在于a.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的人上游引物序列5’-GTACTGGGACAAAGGACCAAAGCC-3’下游引物序列5’-GATCTGGGAAGGCATCTTTACTCG-3’；鼠上游引物序列5′P-CGG CAT ATG TAC TGG GAC TGG GAC AAA GGACCA AAG CCT-3′下游引物序列5′P-TCC AGA CCT CAC ACC GTT-3′；b.蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件是在含有氨卞青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)含質(zhì)粒pET15b-F的表達(dá)菌BL21DE3pLysS至OD600在0.4-0.6之間，此時(shí)加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)37℃培養(yǎng)3-7h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鼠上游引物序列5’-CGG CAT ATG TAC TGG GAC AAA GGA CCA AAG CCTGAG AGA-3’下游引物序列5’-TCC AGA CCT CAC ACC GTT GGT CTC CAG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鼠上游引物序列5’-CTG GAT CCG GAG GTT TGA CTA AGA TCA ATC A-3’下游引物序列5’-GCG AAT TCT GGA TCT GGG ACT TCT TCT TG-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鼠上游引物序列5’-CTG GAT CCG GTG CAC ACG GAA TAT AGC TC-3’下游引物序列5’-GCG AAT TCT TTA ATC GGG AGG GCT GGA-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于大腸桿菌過夜培養(yǎng)，分別在E.coliOD值在0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0時(shí)加入1.0mM IPTG。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于大腸桿菌過夜培養(yǎng)，當(dāng)其OD值在0.4～0.6之間，即當(dāng)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，分別向其中加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0mM的IPTG。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于大腸桿菌過夜培養(yǎng)，當(dāng)其OD值在0.4～0.6之間，即當(dāng)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，向其中加入1.0mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并且分別在誘導(dǎo)后1h，2h，3h，4h，5h，6h取樣；表達(dá)人類肝臟F蛋白時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間增加至7h。
10.肝臟F蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用，用于判斷人類肝臟細(xì)胞損傷的程度。
全文摘要
本發(fā)明公開了肝臟F蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法和該表達(dá)產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在PCR中采用鼠上游引物序列；5′P－CGG CAT ATG TAC TGG GAC TGG GAC AAA GGA CCA AAGCCT－3′鼠下游引物序列5′P－TCC AGA CCT CAC ACC GTT－3′；人上游引物序列5'－GTACTGGGACAAAGGACCAAAGCC－3'，人下游引物序列5'－GATCTGGGAAGGCATCTTTACTCG－3'。其蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件是在含有氨卞青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)含質(zhì)粒pET15b－F的表達(dá)菌BL21DE3pLysS至OD
文檔編號(hào)C12N1/21GK1978649SQ20051012224
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者劉樹業(yè) 申請(qǐng)人:天津市第三中心醫(yī)院