專利名稱：靈長類胚胎干細胞的培養(yǎng)的制作方法
關于聯(lián)邦政府資助研究的聲明待定。
背景技術：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞培養(yǎng)物的方法以及與其一起使用的培養(yǎng)基。
已經(jīng)從著床前胚胎獲得了靈長類(例如，猴和人)多能胚胎干細胞。參見，例如，美國專利5,843,780和J.Thomson等，282 Science 1145-1147(1998)。這些公開的內(nèi)容以及這里提及的所有其它公開通過引入納入本文，這就如同已經(jīng)在文中全文列出。盡管延長了培養(yǎng)時間，但這些細胞穩(wěn)定保持形成所有三個胚層的高級衍生物的發(fā)育潛能。
靈長類(尤其是人類)ES細胞系被廣泛用于人類發(fā)育生物學、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物測試和移植藥物。例如，目前對著床后人胚胎的了解主要是基于數(shù)量有限的靜態(tài)組織切片。由于倫理原因，實質上還未研究控制早期人胚胎發(fā)育決定的根本機制。
盡管實驗哺乳動物發(fā)育生物學主要依賴于小鼠，且盡管有許多控制發(fā)育的基本機制在小鼠和人之間是保守的，但小鼠和人的早期發(fā)育之間有顯著區(qū)別。因此需要靈長類/人ES細胞以深入了解它們的分化和功能。
靈長類ES細胞的分化衍生物可用來鑒定新藥的基因靶點、用來測試新化合物的毒性或致畸性、以及用于移植以替代疾病部位的細胞群。通過移植ES細胞衍生細胞有可能治療的疾病包括帕金森病、心臟梗塞、青少年糖尿病和白血病。參見，例如，J.Rossant等，17 Nature Biotechnology 23-4(1999)和J.Gearhart，282 Science 1061-2(1998)。
長期增殖能力、長期培養(yǎng)后的發(fā)育潛能以及核型穩(wěn)定性是利用靈長類胚胎干細胞培養(yǎng)物的關鍵特征。這種細胞的培養(yǎng)物(尤其是在成纖維細胞飼養(yǎng)層上的)通常補充有動物血清(尤其是胎牛血清)以在這種培養(yǎng)期間進行所需的增殖。
例如，在美國專利5,453,357、5,670,372和5,690,296中公開了各種培養(yǎng)條件，其中包括使用一類堿性成纖維細胞生長因子和動物血清的一些條件。不幸的是，各批次血清的特性都有所不同，因此會影響培養(yǎng)物的特征。
WO 98/30679討論了用無血清補充物來代替動物血清支持培養(yǎng)物中的某些胚胎干細胞生長。該血清替代品中含有白蛋白或白蛋白替代物、一種或多種氨基酸、一種或多種維生素、一種或多種運鐵蛋白或運鐵蛋白替代物、一種或多種抗氧化劑、一種或多種胰島素或胰島素替代物、一種或多種膠原前體以及一種或多種痕量元素。注意，這種替代品中還可補充白血病抑制因子、青灰因子或睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子。不幸的是，對于靈長類胚胎干細胞培養(yǎng)物(尤其是生長在成纖維細胞飼養(yǎng)層上的那些細胞)，這些培養(yǎng)基不令人滿意。
對于營養(yǎng)血清培養(yǎng)基(例如，胎牛血清)，WO 99/20741討論了在培養(yǎng)靈長類干細胞時使用各種生長因子(如bFGF)的益處。然而其中未描述不含營養(yǎng)血清的培養(yǎng)基。
美國專利5,405,772描述了造血細胞和骨髓基質細胞的生長培養(yǎng)基。其中提到，在缺乏血清的培養(yǎng)基中使用成纖維細胞生長因子以用于該目的。然而其中未描述靈長類胚胎干細胞的生長條件。
首先用成纖維細胞飼養(yǎng)細胞層培養(yǎng)人胚胎干細胞培養(yǎng)物，這種飼養(yǎng)細胞層能夠使人胚胎干細胞增殖同時保持未分化狀態(tài)。然后發(fā)現(xiàn)，使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細胞足以形成所謂的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(conditioned medium)，這種培養(yǎng)基具有與直接使用飼養(yǎng)細胞相同的特性。不使用飼養(yǎng)細胞或調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，培養(yǎng)的人胚胎干細胞就不能保持未分化狀態(tài)。由于使用了飼養(yǎng)細胞，或者即便是使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)物都有被不需要的物質污染的風險，因此最好避免使用飼養(yǎng)細胞和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。未曾接觸過飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基在這里被稱為非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(unconditioned medium)。
因此可以看出，仍舊需要在不使用動物血清時穩(wěn)定培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的技術。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個方面提供了培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法。一種方法是在基本不含哺乳動物胎兒血清(也優(yōu)選基本不含任何動物血清)并在含有不止是成纖維細胞飼養(yǎng)層來源的成纖維細胞生長因子的培養(yǎng)物中培養(yǎng)干細胞。在優(yōu)選的形式中，通過加入足量成纖維細胞生長因子就不再需要之前維持干細胞培養(yǎng)物所必需的成纖維細胞飼養(yǎng)層。
成纖維細胞生長因子是哺乳動物發(fā)育所必需的分子。目前有20多種已知的成纖維細胞生長因子配體和5種上述配體的成纖維細胞生長因子信號轉導受體(以及它們的剪接變體)。通常可參見D.Ornitz等，25 J.Biol.Chem.15292-7(1996)；美國專利5,453,357。預計這些因子在物種之間有微小變化，因此術語成纖維細胞生長因子不受物種限制。然而，我們優(yōu)選使用人成纖維細胞生長因子，更優(yōu)選由重組基因產(chǎn)生的人堿性成纖維細胞生長因子。這種化合物不難從Gibco BRL-Life Technologies以及其它公司大量購得。
注意，出于本發(fā)明的目的，盡管已經(jīng)從血清分離出單獨的組分(例如，牛血清白蛋白)且隨后外源性提供這些組分，所述培養(yǎng)物仍可基本不含特定的血清。關鍵是，加入血清本身就增加了變數(shù)。然而，當加入這種血清中的一種或多種良好定義的純化組分時則不會這樣。
優(yōu)選的，用這種方法培養(yǎng)的靈長類胚胎干細胞是真ES細胞系的人胚胎干細胞，它們(i)能夠在體外以未分化狀態(tài)無限增殖；(ii)即便在長期培養(yǎng)后也能夠分化成所有三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物；和(iii)在長期培養(yǎng)中維持正常核型(整倍體)。因此這些細胞被稱為多能細胞。
這種培養(yǎng)能夠使胚胎干細胞在培養(yǎng)物中穩(wěn)定增殖1個月以上(優(yōu)選6個月以上；更優(yōu)選12個月以上)同時維持干細胞分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，同時維持干細胞的核型。
在本發(fā)明的另一方面，提供了另一種培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法。一種方法是在基本不含哺乳動物胎兒血清(也優(yōu)選基本不含任何動物血清)并在含有能夠激活成纖維細胞生長因子信號轉導受體的生長因子的培養(yǎng)物中培養(yǎng)干細胞，其中所述生長因子的來源不止是成纖維細胞飼養(yǎng)層。雖然生長因子優(yōu)選是成纖維細胞生長因子，但也可以是其它物質，如設計用來激活成纖維細胞生長因子受體的某些合成的小肽(例如，由重組DNA變體或突變體產(chǎn)生的)。通?？蓞⒁奣.Yamaguchi等，152 Dev.Biol.75-88(1992)(信號轉導受體)。
在本發(fā)明的又一方面，提供了培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。其中具有不止是成纖維細胞飼養(yǎng)層來源的人堿性成纖維細胞生長因子。該培養(yǎng)系統(tǒng)基本不含動物血清。
本發(fā)明的再一方面提供了用上述方法衍生的細胞系(優(yōu)選克隆細胞系)?！把苌摹币云鋸V義含義使用，包括直接和間接衍生的細胞系。
因此可以避免由于各批次動物血清之間的差異而導致的變化。此外，還發(fā)現(xiàn)，在使用成纖維細胞生長因子時避免使用動物血清能夠提高克隆率。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)點是提供靈長類胚胎干細胞系的培養(yǎng)條件，該條件的可變性較低并能夠更加有效地克隆。通過研究說明書和權利要求書將了解本發(fā)明的其它優(yōu)點。
優(yōu)選實施方案的詳細描述在以下一些實驗中，發(fā)明人之一在這里使用本發(fā)明的方法和培養(yǎng)系統(tǒng)來培養(yǎng)人ES細胞系，而未在培養(yǎng)基中加入血清。在不含血清成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，兩個克隆衍生的人ES細胞系在克隆衍生后增殖8個月以上，并且維持了分化成所有三個胚層的高級衍生物的能力。
在下述另一實驗中，現(xiàn)在已經(jīng)證實，即便在不含血清和飼養(yǎng)細胞時，加入相對大量的人成纖維細胞生長因子(FGF)也有助于人胚胎干細胞的培養(yǎng)和生長。這使得可以培養(yǎng)從未接觸過動物細胞或接觸過已經(jīng)培養(yǎng)過動物細胞的培養(yǎng)基的干細胞。這些干細胞培養(yǎng)條件(即，無飼養(yǎng)細胞、無調(diào)節(jié)培養(yǎng)基)在這里被稱為不依賴于飼養(yǎng)細胞的。已經(jīng)描述過的基于使用經(jīng)飼養(yǎng)細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的現(xiàn)有培養(yǎng)條件被稱為不含飼養(yǎng)細胞的。然而，使用調(diào)節(jié)培養(yǎng)基未解決對使用飼養(yǎng)細胞的依賴性，仍舊必需用飼養(yǎng)細胞來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。這里描述的技術能夠無限地且不依賴于飼養(yǎng)細胞地培養(yǎng)具有正常核型并維持未分化的人胚胎干細胞。
最初的衍生、培養(yǎng)和表征人ES細胞系H9的技術描述于J.Thomson等，282 Science1145-1147(1998)。可用這種和其它細胞系進行下述實驗，但實驗過程和結果與特定ES細胞系無關。
這里描述到加入成纖維細胞生長因子(FGF)有助于培養(yǎng)和克隆人ES細胞。加入FGF在兩個方面具有重要意義。首先，加入中等水平(例如，4ng/ml)的FGF能夠在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化的人ES細胞。與較低水平的FGF相比，在該水平上干細胞的分化速率降低，但細胞最終將分化。其次，加入較高水平的FGF使得培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件變得不依賴于飼養(yǎng)細胞，因為無限維持培養(yǎng)物中的整倍體未分化人ES細胞的多能性根本不需要飼養(yǎng)細胞。
第一個現(xiàn)象被認為是FGF與人ES細胞的FGF受體相互作用造成的。為避免使用血清，在培養(yǎng)時使用何種已知FGF變體并不非常重要。通常使用堿性FGF(或稱bFGF，也叫做FGF2)，但這只是因為bFGF是FGF因子家族中容易購得的成員之一。已經(jīng)鑒定了20多種不同的FGF家族成員，它們被稱為FGF-1到FGF-27。雖然在這里用bFGF的量表示FGF濃度，但應該理解這旨在量化FGF受體的刺激量，且對于FGF家族的其它成員可上調(diào)或下調(diào)FGF濃度。對bFGF而言，ES細胞培養(yǎng)基中的優(yōu)選FGF濃度約為0.1-1000ng/ml，超過約4ng/ml的濃度可有效避免在培養(yǎng)基中使用血清。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)對于FGF在人ES細胞培養(yǎng)基中的第二個作用，對FGF變體的選擇很關鍵。出于該目的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)bFGF的濃度約為100ng/ml時，該條件足以避免對血清和飼養(yǎng)細胞的需要，使得培養(yǎng)不依賴于飼養(yǎng)細胞。出于該目的，發(fā)現(xiàn)FGF家族成員FGF2(bFGF)、FGF4、FGF9、FGF17和FGF18在每毫升培養(yǎng)物100納克時都足以使得人ES細胞的培養(yǎng)不依賴于飼養(yǎng)細胞。相反，發(fā)現(xiàn)FGF家族成員FGF1(酸性FGF)、FGF1β、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19和FGF20在100ng/ml時不足以支持不依賴于飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)。我們認為，使用這些形式的FGF得到的結果不是濃度造成的，且更高濃度的特定FGF也不能成功支持不依賴于飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)，但目前還沒有數(shù)據(jù)證明。對FGF9而言，我們的數(shù)據(jù)說明，在該水平(100ng/ml)上FGF9支持人ES細胞的培養(yǎng)，但該數(shù)據(jù)略微可疑。
此時不能準確知道足以支持人ES細胞不依賴于飼養(yǎng)細胞的FGF有效變體的準確最小量，但可根據(jù)經(jīng)驗試驗測得。已知對于FGF2，單獨在培養(yǎng)基中加入4ng/ml不足以無限維持整倍體未分化人ES細胞的培養(yǎng)，而單獨在培養(yǎng)基中加入100ng/mlFGF2就足夠了。盡管使ES細胞在含有少至4ng/ml的非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中生長將在一段時間內(nèi)維持未分化，并可能傳代一次或兩次，但細胞最終將分化。在我們看來，當細胞被培養(yǎng)至少6代并維持增殖、未分化、整倍體且同時維持人ES細胞特征性形態(tài)時，便可證明該培養(yǎng)基能夠以無限維持未分化和整倍體的狀態(tài)培養(yǎng)ES細胞。文中，F(xiàn)GF的維持濃度(maintenance concentration)是支持維持人ES細胞未分化、整倍體和增殖狀態(tài)至少6代所必需的FGF濃度。對FGF2而言，最低維持濃度在4ng/ml和100ng/ml之間，可采用以下方法內(nèi)插那些量來確定精確的最低維持濃度。對于其它各有效FGF，如FGF4、FGF9、FGF17和FGF18，可用類似的測試確定各FGF相應的最低維持濃度。
培養(yǎng)在下面實施例中所述確定的人ES細胞培養(yǎng)基中的人ES細胞可在完全不含成纖維細胞飼養(yǎng)細胞且沒有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基時無限培養(yǎng)并維持整倍體。因此該ES細胞的確是不依賴于飼養(yǎng)細胞的。該人ES細胞保留了人ES細胞的所有特征，包括特征形態(tài)(小且致密，細胞膜不清晰)、增殖以及分化成人體內(nèi)的許多(如果不是全部)細胞類型的能力。該人ES細胞還將保留當注射入免疫削弱小鼠時能夠形成所有三個原生細胞層的特征。具體地說，該ES細胞保留了分化成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的能力。該ES細胞仍顯示出指示ES細胞狀態(tài)的標記，如表達與多能性相關的核轉錄因子Oct4。該人ES細胞在此過程中及結束時保持正常核型。
實施例在這里描述的第一個實驗中，將人ES細胞接種到經(jīng)過照射(35戈瑞γ射線照射)的小鼠胚胎成纖維細胞上。該實驗的培養(yǎng)基由80％“KnockOut”Dulbeco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco BRX，Rockville，MD)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巰基乙醇和1％非必需氨基酸原液(Gibco BRL，Rockville，MD)構成，補充有20％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)或20％KnockOut SR(一種最初為小鼠ES細胞優(yōu)化的無血清替代品)(Gibco BRL，Rockville，MD)。KnockOut SR的組成見WO 98/30679中對血清替代品的描述。
在另一個實驗中，在培養(yǎng)基中補充血清或上述血清替代品KnockOut SR，并補充或不補充人重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，4ng/ml)。培養(yǎng)物中bFGF的優(yōu)選濃度范圍在1ng/ml至500ng/ml之間。
為確定不同培養(yǎng)條件下的克隆率，用0.05％胰蛋白酶/0.25％EDTA處理H-9培養(yǎng)物7分鐘以使其分散成單細胞，離心洗滌，并接種到有絲分裂失活(mitoticallyinactivated)的小鼠胚胎成纖維細胞上(6孔板的每個孔中105個ES細胞)。為證實單細胞生長形成了克隆ES細胞系，在立體顯微鏡下直接觀察以選擇各個細胞，并用微量移液器轉移到96孔板的各孔中，各孔中含有小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)細胞和含有20％血清替代品和4ng/ml bFGF的培養(yǎng)基。
每5-7天用1mg/ml IV型膠原酶(Gibco BRL，Rockville，MD)通過常規(guī)傳代擴展克隆。衍生6個月后，通過標準G顯帶技術證實H9細胞具有正常XX核型(分析20條染色體展開物(chromosomal spread))。然而，衍生7個月后，在單核型制品中，16/20的染色體展開物顯示出正常的XX核型，但4/20的展開物顯示出隨機異常(randomabnormality)，其中包括一個13號染色體短臂易位、一個20號染色體反向、一個4號染色體短臂易位、還有一個為多片段化。隨后，在衍生8、10和12.75個月后，在檢測的所有20個染色體展開物中H9細胞顯示出正常核型。
我們觀察到，在上述含有動物血清的培養(yǎng)條件下人ES細胞的克隆率低下(無論存在或不存在bFGF)。我們還觀察到，在不存在動物血清時克隆率升高，且在含有bFGF時進一步升高。現(xiàn)在已證實，加入FGF通常有助于培養(yǎng)人ES細胞且特別有助于克隆人ES培養(yǎng)物。
下面的數(shù)據(jù)表示為接種105各種ES細胞后得到的集落總數(shù)+/-平均值的標準誤差(集落克隆率百分比)。20％胎兒血清和無bFGF的結果為240+/-28。20％血清和bFGF(4ng/ml)的結果大致相同，為260+/-12。無血清(含有20％血清替代品)且無bFGF的結果為633+/-43，而無血清、有bFGF的結果為826+/-61。因此，血清對克隆率有不利影響，而在不含血清時存在bFGF對克隆率有協(xié)同作用。
在存在血清時長期培養(yǎng)人ES細胞不需要添加外源提供的bFGF，并且(如上所述)，在含有血清的培養(yǎng)基中加入bFGF不會顯著提高人ES細胞的克隆率。然而，在無血清培養(yǎng)基中，bFGF提高了人ES細胞的初始克隆率。
此外還發(fā)現(xiàn)，添加外源bFGF對于在不含動物血清時靈長類胚胎干細胞的持續(xù)未分化增殖非常重要。在缺乏外源bFGF的無血清培養(yǎng)基中，人ES細胞通常在培養(yǎng)兩周后一致地分化。加入其它因子如LIF(不含bFGF)不能防止這種分化。
所得結果特別適用于克隆系。在這個方面，通過直接顯微鏡觀察將單個細胞置入96孔板的孔中，從而選擇要擴展的克隆。在接種到96孔板孔中的192個H-9細胞中，成功擴展了2個克隆(H-9.1和H-9.2)。然后在補充有血清替代品和bFGF的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)這兩個克隆。
克隆后，H9.1和H9.2細胞即便在連續(xù)培養(yǎng)8個多月之后都維持正常的XX核型。H-9.1和H-9.2克隆即便在無血清培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)之后還維持形成所有三個胚層衍生物的潛能。培養(yǎng)6個月之后，H9.1和H9.2克隆被證實具有正常核型，然后被注射入SCID-beige小鼠。
H9.1和H9.2細胞都形成含有所有三個胚層衍生物的畸胎瘤，這些衍生物包括腸道上皮(內(nèi)胚層)；胚腎、橫紋肌、平滑肌、骨骼、軟骨(中胚層)以及神經(jīng)組織(外胚層)。將多次傳代H9.1和H9.2細胞的畸胎瘤內(nèi)觀察到的分化程度與低傳代親本H9細胞形成的畸胎瘤中觀察到的分化程度相當。
從上面的描述可知，盡管動物血清可支持生長，但它是一種復雜的混合物，其中可含有對于人ES細胞培養(yǎng)有益和有害的化合物。此外，不同批次血清支持人ES細胞有力(vigorous)未分化增殖的能力差別巨大。用明確成分代替血清能降低與這種血清批次變化有關的結果可變性，因此應該能夠進行更加明確的分化研究。
此外，含血清培養(yǎng)基的克隆率較低說明，通常使用的血清中存在對干細胞(尤其是當細胞分散成單個細胞時)存活有害的化合物。因此迫切需要避免使用這些化合物。
不依賴于飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)后面的補充研究涉及在含有較高濃度FGF但不存在血清和飼養(yǎng)細胞時培養(yǎng)ES細胞系。該工作中采用三種不同的培養(yǎng)基配方，這些培養(yǎng)基配方在這里被稱為UM100、BM+和DHEM。UM100指添加有100ng/ml bFGF的非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。UM100培養(yǎng)基含有Gibco Knockout血清替代品產(chǎn)品，但不含或不需要使用任何類型的成纖維細胞飼養(yǎng)細胞。BM+培養(yǎng)基是基礎培養(yǎng)基(DMEM/F12)加下述添加物，它也能在不含飼養(yǎng)細胞時培養(yǎng)細胞，但該培養(yǎng)基省略了血清替代品產(chǎn)品。最后，DHEM指確定的人胚胎干細胞培養(yǎng)基。下面也將描述的這種培養(yǎng)基足以培養(yǎng)、克隆和無限增殖人ES細胞，它完全由無機成分和人類蛋白質構成，與含有牛白蛋白的BM+培養(yǎng)基相反。
在UM100/BM+/DHEM中培養(yǎng)人ES細胞系H1和H9UM100培養(yǎng)基制備如下在由80％(v/v)DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)和20％(v/v)Knockout-血清替代品(Gibco/Invitrogen)構成的非調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(UM)中補充1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma-St.Louis，MO)和1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)。加入100ng/ml bFGF并通過0.22μM尼龍濾器(Nalgene)過濾培養(yǎng)基以完成該培養(yǎng)基。
BM+培養(yǎng)基制備如下將16.5mg/ml BSA(Sigma)、196μg/ml胰島素(Sigma)、108μg/ml運鐵蛋白(Sigma)、100ng/ml bFGF、1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mMβ-巰基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)混合在DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)中，并用5M NaCl將重量克分子滲透壓濃度調(diào)制340mOsm。然后通過0.22μM尼龍濾器(Nalgene)過濾該培養(yǎng)基。
DHEM培養(yǎng)基制備如下將16.5mg/ml HSA(Sigma)、196μg/ml胰島素(Sigma)、108μg/ml運鐵蛋白(Sigma)、100ng/ml bFGF、1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)、1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)、補充維生素(Sigma)、痕量礦物質(Cell-gro)和0.014-0.07mg/L硒(Sigma)混合在DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)中，并用5M NaCl將重量克分子滲透壓濃度調(diào)制340mOsm。注意，培養(yǎng)基中的補充維生素可包括硫胺素(6.6g/L)、還原型谷胱甘肽(2mg/L)和抗壞血酸PO4。同時，用于培養(yǎng)基的痕量礦物質是痕量元素B(Cell-gro，目錄號MT 99-175-C1)和C(Cell-gro，目錄號MT 99-176-C1)的組合；它們各自以1,000X溶液出售。本領域已知痕量元素B和C的組分分別與Cleveland痕量元素I和II相同。(見Cleveland，W.L，Wood，I.Erlanger，B.F.，J.Imm.Methods 56221-234，1983)。然后通過0.22μM尼龍濾器(Nalgene)過濾該培養(yǎng)基。最后加入無菌的規(guī)定脂類(Gibco/Invitrogen)以完成該培養(yǎng)基。
用分散酶(1mg/ml)機械傳代之前生長在MEF(小鼠胚胎成纖維細胞)飼養(yǎng)細胞上的H1或H9人胚胎干細胞，并將細胞接種到基質膠(Becton Dickinson，Bedford，MA)上。每日更換合適的培養(yǎng)基直到測定的細胞密度足以進行細胞傳代。然后用分散酶傳代細胞并維持在基質膠(Becton Dickinson)上。
生長速率為確定各種培養(yǎng)基中人ES細胞的生長速率，將細胞以約5×105細胞/孔的密度一式三份接種到6孔組織培養(yǎng)皿(Nalgene)中。在第3、5和7天用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)處理三復孔、分成單個細胞(individualized)并對細胞計數(shù)。在第7天，用胰蛋白酶處理其它的孔，計數(shù)，并以約2×105細胞/孔的細胞密度再接種新的平板。通過FACS分析對已經(jīng)用胰蛋白酶處理過的第7天的培養(yǎng)物進行分析以了解ES細胞表面標記Oct4、SSEA4和Tral-60。收集連續(xù)3次傳代的生長速率。生長速率實驗顯示，用UM100-培養(yǎng)的人ES細胞與用CM-培養(yǎng)的人ES細胞生長得同樣迅猛。
貼壁(Attachment)動力學為確定各種培養(yǎng)基中人ES細胞的貼壁速率，將細胞以2×105細胞/孔的密度接種到6孔組織培養(yǎng)皿(Nalgene)中。在30分鐘-48小時的各時間點上洗去未貼壁的細胞，用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)剝離貼壁細胞并計數(shù)。進行這些實驗是為了檢測UM100生長速率數(shù)據(jù)是否由于細胞貼壁較好和生長較慢的組合(與UM100和CM的生長速率相同相反)。我們發(fā)現(xiàn)，在所有測試時間點這兩個培養(yǎng)基的貼壁百分數(shù)都是相等的。因此它們以相同速率生長。
人ES細胞的FACS分析在37℃用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)+2％雞血清(ICN Biomedicals，Inc.，Aurora，OH)處理6孔組織培養(yǎng)平板(Nalgene)10分鐘以除去其上的人ES細胞。將細胞稀釋入等體積FACS緩沖液(PBS+2％FBS+0.1％疊氮化鈉)并通過80μM細胞過濾器(Nalgene)過濾。1000rpm離心5分鐘，收集細胞團并將其重懸于1ml 0.5％低聚甲醛。將人ES細胞在37℃固定10分鐘，然后如上所述收集細胞團。將ES細胞重懸于2ml FACS緩沖液并用血球計數(shù)板計算總細胞數(shù)。如上所述使細胞形成細胞團并在90％甲醇中冰上通透30分鐘。如上所述使人ES細胞形成細胞團，將1×105細胞稀釋入FACS管(Becton Dickinson)中的1ml FACS緩沖液+0.1％Triton X-100(Sigma)。如上所述使hESC形成細胞團并重懸于50μl用FACS緩沖液+0.1％TritonX-100(Sigma)稀釋的第一抗體中。平行處理合適對照抗體的樣品。hESC在4℃孵育過夜。倒出上清，細胞用50μl第二抗體(Molecular Probes/Invitrogen)室溫避光孵育30分鐘。在Facscalibur(Becton Dickinson)細胞分選儀中用CellQuest軟件(BectonDickinson)進行FACS分析。用這種方法進行FACS分析能夠檢測細胞表面標記，因此顯示是否得到了ES細胞。觀察到的結果是，培養(yǎng)在UM100中的人ES細胞有90％為Oct-4陽性群體。該結果與CM-培養(yǎng)的ES細胞相當，證實該細胞為ES細胞群體。在分析SSEA4和Tral-60時采用和Oct-4一樣的方法，但細胞不用低聚甲醛或甲醇處理。細胞染色后，將細胞重懸于FACS緩沖液(無Triton)并如上所述在FACS緩沖液(同樣無Triton)中用合適的抗體分析。未分化的ES細胞培養(yǎng)物平均也有90％對這兩種細胞表面標記呈陽性。這一點已經(jīng)通過上述FACS分析加以證實。
結果現(xiàn)在已經(jīng)將人ES細胞系H1的細胞在UM100培養(yǎng)基中培養(yǎng)33代以上(164以上的群體倍增)同時保持了人ES細胞的形態(tài)和特征。H1細胞在BM+培養(yǎng)基中培養(yǎng)6代以上(70天)同時保持了人ES細胞的形態(tài)和特征。H9細胞已經(jīng)在DHEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5代以上(67天)。H9和H7人ES細胞也都在UM100培養(yǎng)基中以未分化狀態(tài)分別培養(yǎng)了22代和21代。之后對BM+和UM100-培養(yǎng)的細胞進行測試顯示具有正常核型。
FGF形式的研究H1系的人ES細胞在標準條件下用調(diào)節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)3代，然后換成測試培養(yǎng)基。測試條件為，細胞在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(第0天)，第二天換成測試培養(yǎng)基(第1天)。之后用相應的測試培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。人ES細胞系H9也在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基配制的基質膠上培養(yǎng)5代，然后平行換成測試培養(yǎng)基。
細胞按以下方法傳代。使細胞培養(yǎng)物在6孔組織培養(yǎng)平板中生長至合適密度(需要大約7天)，然后在37℃用1ml分散酶(Dipase)(1mg/ml)(Gibco/Invitrogen)處理培養(yǎng)物5-7分鐘。然后除去分散酶并換成2ml合適的生長培養(yǎng)基。用5ml移液管從組織培養(yǎng)平板上機械除去細胞，然后通過上下吹打分散細胞。然后用醫(yī)用離心機1000rpm離心5分鐘使細胞形成細胞團。然后將細胞團重懸于適當體積的培養(yǎng)基中并以所需稀釋度重新接種。
培養(yǎng)基配方相同，但加入的FGF不同?；A培養(yǎng)基為UM100，根據(jù)所需測試條件改變FGF。測試以下FGF變體，分別以100ng/ml加入培養(yǎng)基FGF1(酸性FGF)、FGF1β(酸性FGF的同種型)、FGF2(堿性FGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20。所有FGF都通過商業(yè)購得或由重組宿主中產(chǎn)生。
每次傳代后判斷特定FGF形式支持人ES細胞培養(yǎng)物的能力。被判定為支持人ES細胞培養(yǎng)物的條件為在培養(yǎng)時支持培養(yǎng)物以未分化狀態(tài)適當增殖，不依賴于飼養(yǎng)細胞，可有效傳代以及連續(xù)表達人ES細胞標記Oct4、SSEA4和Tral-60。被判定為在培養(yǎng)時不支持人ES細胞的條件為通過形態(tài)觀察顯示培養(yǎng)物中有明顯的細胞分化，且細胞在集落傳代時無法增殖。支持人ES細胞培養(yǎng)物的FGF變體為FGF2、FGF4、FGF17和FGF18。不支持將人ES細胞維持于未分化狀態(tài)的FGF變體為FGF1、FGF1β、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19和FGF20。添加FGF9的培養(yǎng)基的結果起初是邊緣值。通過重復該過程發(fā)現(xiàn)，以100ng/ml補充FGF9似乎也能支持培養(yǎng)物中未分化的人ES細胞。
目前，補充有FGF4、FGF17和FGF20的培養(yǎng)基已經(jīng)支持未分化的H1系人ES細胞培養(yǎng)物傳代8次。用FGF4、FGF9、FGF17和FGF18對人ES細胞系H9和H14進行類似重復試驗發(fā)現(xiàn)分別能延長3代和2代。
上面已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明。該概念的其它形式也包含在權利要求書的范圍之內(nèi)。例如，盡管上述試驗采用的是重組制造的人堿性成纖維細胞生長因子，但天然分離的成纖維細胞生長因子也是適用的。此外，這些技術應該也適用于猴或其它靈長類細胞培養(yǎng)物。
因此，權利要求將被視為用來判定本發(fā)明的完整范圍。
工業(yè)應用性本發(fā)明提供了培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法以及用于該方法的培養(yǎng)基。
權利要求
1.一種培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，所述方法包括在基本不含哺乳動物胎血清的培養(yǎng)物中和在含有氨基酸、維生素、鹽、礦物質、運鐵蛋白或運鐵蛋白替代物、胰島素或胰島素替代物、白蛋白以及成纖維細胞生長因子的干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，所添加的成纖維細胞生長因子來自除飼養(yǎng)層之外的來源，其濃度至少與維持濃度一樣高，所述培養(yǎng)基能夠支持培養(yǎng)和增殖人未分化的增殖整倍體胚胎干細胞至少6代，不需要飼養(yǎng)細胞或者使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物基本不含任何動物血清。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述FGF選自FGF2、FGF4、FGF9、FGF17或FGF18。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述FGF是FGF2，其在培養(yǎng)基中的濃度是100ng/ml。
5.一種在不含血清且不含飼養(yǎng)細胞的確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，所述方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質、至少一種運鐵蛋白或運鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，所述培養(yǎng)基基本不含哺乳動物胎血清并含有能夠激活成纖維細胞生長因子信號轉導受體的至少約100ng/ml成纖維細胞生長因子，所述生長因子來自除飼養(yǎng)層之外的來源，所述培養(yǎng)基支持干細胞以未分化狀態(tài)增殖而不需要飼養(yǎng)細胞或條件培養(yǎng)基。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)步驟包括在培養(yǎng)物中增殖胚胎干細胞一個月以上，同時維持該干細胞分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，同時維持該干細胞的核型。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述FGF選自FGF2、FGF4、FGF9、FGF17或FGF18。
8.一種人胚胎干細胞培養(yǎng)物，其包含人胚胎干細胞；和含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質、至少一種運鐵蛋白或運鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基基本不含哺乳動物胎血清并含有能夠激活成纖維細胞生長因子信號轉導受體的至少維持濃度的成纖維細胞生長因子，所述培養(yǎng)基能夠在不含血清、不含飼養(yǎng)細胞且無需使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細胞的情況下無限地培養(yǎng)干細胞，其中，所述培養(yǎng)物能夠將干細胞無限地維持于未分化狀態(tài)并具有正常核型。
9.如權利要求8所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述成纖維細胞生長因子是FGF2，其在培養(yǎng)基中的濃度至少約100ng/ml。
10.一種不依賴于飼養(yǎng)細胞的人胚胎干細胞培養(yǎng)物，其包含干細胞培養(yǎng)基中的人胚胎干細胞，所述干細胞培養(yǎng)基含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質、至少一種運鐵蛋白或運鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物，所述培養(yǎng)基基本不含哺乳動物胎血清并含有至少維持濃度的選自FGF2、FGF4、FGF9、FGF17或FGF18的成纖維細胞生長因子，所述培養(yǎng)物不依賴于飼養(yǎng)細胞，且細胞維持整倍體并處于未分化狀態(tài)。
11.如權利要求10所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述成纖維細胞生長因子的濃度至少約100ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，該方法是在基本不含哺乳動物胎兒血清的環(huán)境中和在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，所述干細胞培養(yǎng)基含有氨基酸、維生素、鹽、礦物質、運鐵蛋白、胰島素、白蛋白并添加有不止是飼養(yǎng)層來源的成纖維細胞生長因子。還公開了能夠支持人胚胎干細胞的培養(yǎng)和增殖但不需要飼養(yǎng)細胞或者使培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細胞的組合物。
文檔編號C12N5/0735GK101072868SQ200580032533
公開日2007年11月14日 申請日期2005年9月27日 優(yōu)先權日2004年9月28日
發(fā)明者J·A·托馬森, M·萊文斯坦 申請人:威塞爾研究所股份有限公司