專利名稱：花鱸胚胎干細胞及培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞生物技術中的細胞培養(yǎng)技術，是在體外人工培養(yǎng)條件下，以花鱸囊胚期細胞為材料獲得具有發(fā)育多能性和無限增殖能力的細胞--胚胎干細胞的一種技術方法。
背景技術：
魚類胚胎干細胞是從魚類早期囊胚中分離培養(yǎng)出的具有發(fā)育全能性的未分化細胞系。本發(fā)明做出之前，國際上對魚類胚胎干細胞培養(yǎng)的研究主要集中在小型模式魚類斑馬魚和青鳉上1992年美國的Collodi等嘗試培養(yǎng)斑馬魚胚胎干細胞，但未獲成功；1995年美國的Sun等借鑒小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)方法獲得了斑馬魚胚胎干細胞系，培養(yǎng)方法如下以斑馬魚的成纖維細胞系(ZEF)作為滋養(yǎng)層細胞，將斑馬魚囊胚期細胞與其共培養(yǎng)，培養(yǎng)基為LDF基礎培養(yǎng)基，添加0.18mg/ml碳酸氫鈉、15mmol/lHepes(pH7.4)、400μg/ml青霉素、400μg/ml鏈霉素、50μg/ml氨芐青霉素、10μg牛胰島素、0.4％鱒魚血清和5％小牛血清等物質(zhì)，所培養(yǎng)的細胞具有鼠類胚胎干細胞的形態(tài)，并且具有高的堿性磷酸酶活性。1994年日本的Wakamatsu等采用滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)系統(tǒng)建立了青鳉胚胎干細胞系，該細胞系在形態(tài)、堿性磷酸酶活性及分化能力等具有胚胎干細胞的特征。德國Hong和Schartl(1996)以DMEM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.4)、50μg/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml氨芐青霉素、2mmol/l谷氨酸、15％胎牛血清和1％魚血清等物質(zhì)培養(yǎng)青鳉囊胚細胞，獲得了穩(wěn)定傳代的青鳉胚胎干細胞系，細胞具有哺乳動物胚胎干細胞的許多特征。而有關花鱸胚胎干細胞系的建立國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立花鱸胚胎干細胞及培養(yǎng)方法，使細胞保持良好的生長狀態(tài)及其典型的胚胎干細胞特征，為開展魚類基因打靶和基因功能研究提供細胞基礎，為海水魚類基因工程育種提供技術手段。
本發(fā)明是按如下技術內(nèi)容實現(xiàn)的花鱸胚胎干細胞其特征為細胞小且呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15-25um，具有大的細胞核和較少的細胞質(zhì)，細胞增殖速度快，在24℃下，細胞倍增時間為20小時左右；在人工誘導條件下，可以分化成神經(jīng)細胞、肌肉細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等不同細胞類型。
花鱸胚胎干細胞的培養(yǎng)方法本發(fā)明是按以下操作程序完成的花鱸胚胎囊胚期細胞的收集；胚胎干細胞的培養(yǎng)和傳代，包括對囊胚期細胞進行原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)、溫度對花鱸胚胎干細胞生長的影響、穩(wěn)定胚胎干細胞的培養(yǎng)。對培養(yǎng)的花鱸胚胎干細胞進行特征鑒定，包括形態(tài)學鑒定、堿性磷酸酶檢測、倍性檢測，細胞發(fā)育多能性的鑒定。
花鱸胚胎囊胚期細胞的收集采集花鱸胚胎，鏡檢合格后在常溫下培養(yǎng)至中囊胚期時使用，此時囊胚期細胞數(shù)目為1000個左右。將花鱸囊胚分組，每組為50-70個胚胎，從中分離出囊胚期細胞，用于原代培養(yǎng)。
胚胎干細胞的培養(yǎng)和傳代對囊胚期細胞進行原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)將收集的囊胚期細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板中單層培養(yǎng)，加入完全培養(yǎng)基1.0ml，24℃培養(yǎng)。待培養(yǎng)2-3天后，更換培養(yǎng)基，細胞長滿培養(yǎng)孔，按1∶2的比例進行細胞傳代，每2-3天更換1次培養(yǎng)基，1周傳代2-3次。完全培養(yǎng)基配方為DMEM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.5)，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，2mmol/l谷氨酸、1mmol/l丙酮酸鈉，1mmol/l非必需氨基酸，5ng/ml重組人白血病抑制因子，15％胎牛血清和1％花鱸魚血清，0.1％胚胎抽提物，8nM的亞硒酸鈉，5ng/ml的成纖維生長因子，27.5μM巰基乙醇。
溫度對花鱸胚胎干細胞生長的影響研究發(fā)現(xiàn)，LJESl在4-32℃下都能存活，適宜生長溫度為20-28℃；在4℃下，細胞可存活40天，再轉(zhuǎn)到24℃下依然生長良好，能正常傳代；在32℃下，LJES1細胞可以生長、增殖，但生長速度開始下降，細胞最適宜溫度為24-28℃，28℃細胞生長速度達到最大。適宜LJES1生長的最適pH值為7.2-7.4。
穩(wěn)定胚胎干細胞的培養(yǎng)形成穩(wěn)定的胚胎干細胞系后，細胞保持較快的生長速度，基本上不再自發(fā)分化，得到第13、35和60代胚胎干細胞倍增時間分別為19.76、20.67和21.31小時，在60小時細胞增殖速率達到最大。
花鱸胚胎干細胞特征鑒定形態(tài)學鑒定在100×和400×的相差顯微鏡下觀察細胞的外形和細胞大小，顯微照相記錄細胞形態(tài)，比較本細胞與典型的胚胎干細胞的異同，其細胞具有典型的胚胎干細胞特征多邊形或多角形，具有大的細胞核，一個或兩個核仁，細胞的直徑約為15-25um。
堿性磷酸酶檢測細胞經(jīng)1％多聚甲醛固定，BCIP/NBT作為反應底物，在黑暗環(huán)境下對細胞進行染色，囊胚中期細胞為對照，相差顯微鏡觀察結(jié)果為其細胞被染色顯現(xiàn)紫紅色。
倍性檢測對胚胎干細胞進行常規(guī)的染色體制備，顯微鏡下觀察染色體形態(tài)，統(tǒng)計二倍體細胞的比率，即染色體數(shù)目為48條的細胞所占比率為60％以上。
細胞發(fā)育多能性的鑒定通過花鱸胚胎干細胞的分化能力驗證。體外誘導分化主要是在培養(yǎng)基中添加視黃酸(RA)，可以形成多種不同類型的細胞如神經(jīng)樣細胞、肌肉樣細胞、纖維樣細胞和擬胚體等；體內(nèi)誘導分化主要是通過細胞移植構(gòu)建嵌合體進行多能性的鑒定。
本發(fā)明與已有技術對比，具有以下特點目前除本發(fā)明外，國內(nèi)外尚無花鱸胚胎干細胞培養(yǎng)的報道，國際上成功的胚胎干細胞培養(yǎng)也主要局限在小型模式魚青鳉和斑馬魚上。本發(fā)明首次建立了花鱸胚胎干細胞系及其培養(yǎng)方法。建立的花鱸胚胎干細胞培養(yǎng)方法適用于大型的、經(jīng)濟價值較高的海水魚類，本發(fā)明拓寬了魚類胚胎干細胞培養(yǎng)的研究范疇，突破了以往魚類胚胎干細胞培養(yǎng)僅具有理論意義的局限，為進一步將魚類胚胎干細胞應用于生產(chǎn)實踐提供了技術手段。
本發(fā)明所采用的是無滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)方法。與斑馬魚胚胎干細胞和小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)常用的滋養(yǎng)層培養(yǎng)法相比，本方法無需培養(yǎng)用于控制胚胎干細胞分化的滋養(yǎng)層成纖維細胞，而是在培養(yǎng)基中添加LIF因子來控制細胞分化，為保證細胞能有效貼壁，則采用0.1％明膠處理培養(yǎng)板的方法；因此，本發(fā)明具有操作簡單、培養(yǎng)方便的優(yōu)點。另外，本方法可保證細胞處于快速、穩(wěn)定的生長狀態(tài)。
具體實施例方式下面通過實施例詳細敘述本發(fā)明的內(nèi)容花鱸胚胎干細胞培養(yǎng)采用較為簡單的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)法，更為重要的是，花鱸是我國重要的海水養(yǎng)殖品種，經(jīng)濟價值較高?；|胚胎干細胞不僅可以作為海水魚類模式細胞，為開展基因打靶研究奠定細胞學基礎，并且在魚類功能基因研究、定點突變的轉(zhuǎn)基因研究等方面也有重要作用。建立簡便、有效的花鱸胚胎干細胞培養(yǎng)方法在開展海水魚類基因工程育種研究和實際生產(chǎn)應用方面意義重大。
花鱸胚胎干細胞是從花鱸囊胚期胚胎中分離出的、具有發(fā)育全能性的細胞，其特征是細胞小、呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15-25um，具有大的細胞核和較少的細胞質(zhì)，具有高的堿性磷酸酶活性、細胞增殖速度快，在24℃下，細胞倍增時間為20小時左右；在人工誘導條件下，可以分化成不同細胞類型，通過細胞移植，可以在受體囊胚內(nèi)分化發(fā)育形成不同的組織和器官，從而形成嵌合體。
花鱸胚胎干細胞的培養(yǎng)方法本發(fā)明是按以下操作程序完成的花鱸胚胎囊胚期細胞的收集；胚胎干細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，包括對囊胚期細胞進行原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)；溫度對花鱸胚胎干細胞生長的影響；穩(wěn)定胚胎干細胞的培養(yǎng)；對培養(yǎng)的花鱸胚胎干細胞特征進行鑒定，包括形態(tài)學鑒定、堿性磷酸酶檢測、倍性檢測，細胞發(fā)育多能性的鑒定。
囊胚期細胞的收集采集花鱸胚胎，顯微鏡下挑選胚胎發(fā)育正常的浮性卵，在常溫下培養(yǎng)至中囊胚期(約1000個細胞的胚胎)備用，每組胚胎數(shù)量為50-70枚，在1×PBS溶液中反復浸洗，然后轉(zhuǎn)移到70％酒精中對胚胎進行快速消毒，并用滅菌的1×PBS(pH為7.4)溶液沖洗3次。在顯微鏡下用鑷子剝除卵膜，分離出胚胎細胞，用槍頭反復輕輕吹打形成單個細胞，吸出溶液以800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清，加入培養(yǎng)基形成細胞懸液，同樣轉(zhuǎn)速離心，重復此步驟3次，徹底去除卵黃和油球，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕吹打形成細胞懸液待用。
胚胎干細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)對囊胚期細胞進行原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)將囊胚期細胞懸液接種到24孔細胞培養(yǎng)板的1孔中，加入1ml完全培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24℃。完全培養(yǎng)基配方為DMEM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.5)，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，2mmol/l谷氨酸、1mmol/l丙酮酸鈉，1mmol/l非必需氨基酸，5ng/ml重組人白血病限制因子，15％胎牛血清和1％花鱸血清，0.1％花鱸胚胎抽提物，8nM的亞硒酸鈉，5ng/ml的成纖維生長因子，27.5μM巰基乙醇。鏡檢觀察細胞長滿培養(yǎng)孔的95％時，按1∶2的比例進行細胞傳代，每2-3天更換1次培養(yǎng)基，1周傳代2-3次。獲得的8個囊胚細胞原代培養(yǎng)物，在傳代過程中，有6個出現(xiàn)分化，逐漸死亡，2個囊胚細胞原代培養(yǎng)物形成細胞系，保持較穩(wěn)定的生長狀況，細胞呈現(xiàn)胚胎干細胞形態(tài)細胞為圓形或多邊形，核大，細胞質(zhì)稀薄，細胞大小為15-25μm。待細胞經(jīng)過150天的培養(yǎng)傳代到40代時，即形成穩(wěn)定的胚胎干細胞系。
溫度對花鱸胚胎干細胞生長的影響研究發(fā)現(xiàn)，LJES1在4-32℃下都能存活，適宜生長溫度為20-28℃；在4℃下，細胞可存活40天，再轉(zhuǎn)到24℃下依然生長良好，能正常傳代；在32℃下，LJES1細胞可以生長、增殖，但生長速度開始下降，細胞最適宜溫度為24-28℃，28℃細胞生長速度達到最大(如表1所示)。適宜LJES1生長的最適pH值為7.2-7.4。
表1不同溫度對LJES1細胞生長的影響


穩(wěn)定胚胎干細胞的培養(yǎng)形成穩(wěn)定的干細胞系后，細胞保持較快的生長速度，基本上不再自發(fā)分化，得到第13、35和60代胚胎干細胞倍增時間分別為19.76、20.67和21.31小時，在60小時細胞增殖速率達到最大。
胚胎干細胞特征鑒定主要是形態(tài)學鑒定、堿性磷酸酶檢測、倍性檢測以及細胞發(fā)育多能性的鑒定。
形態(tài)學鑒定在100×或400×的相差顯微鏡下可觀察到花鱸胚胎干細胞具有典型的干細胞特征，一般為多邊形或多角形，具有大的細胞核，一個或兩個核仁，細胞的直徑約為15-25um，在含有LIF抑制分化因子的條件培養(yǎng)基中成單層生長?；|胚胎干細胞(LJES1)生長迅速，在極低密度下(103cells/ml)接種于培養(yǎng)瓶中，10-15天即可由一個細胞形成單克隆集落。
堿性磷酸酶檢測花鱸胚胎干細胞用1×PBS洗滌后，以1％的多聚甲醛固定10分鐘，再用1×PBS洗滌2次，以BCIP/NBT為底物在黑暗環(huán)境染色15-20分鐘。囊胚中期細胞為對照，花鱸胚胎干細胞與囊胚中期細胞一樣，顯現(xiàn)強烈的紫紅色，為堿性磷酸酶陽性。
倍性檢測花鱸胚胎干細胞生長至對數(shù)期，在培養(yǎng)基中添加秋水仙素使終濃度為10μg/ml，4小時后收獲細胞，75mmol/L KCl溶液低滲處理30分鐘，3∶1甲醇、冰醋酸固定細胞3次，每次15分鐘，冷滴片，空氣干燥，5％Giemsa染色20分鐘。顯微鏡下觀察染色體形態(tài)，計數(shù)染色體數(shù)目，做出核型?；|胚胎干細胞的染色體數(shù)目48條占60％以上，核型公式為2n＝48t，與花鱸體細胞染色體相同。
細胞發(fā)育多能性的檢測包括胚胎干細胞的體外分化能力、花鱸胚胎干細胞可形成擬胚體并發(fā)生分化、花鱸胚胎干細胞的體內(nèi)分化能力。
胚胎干細胞的體外分化能力胚胎干細胞在誘導劑視黃酸的作用下，可以在體外誘導分化為多種類型的細胞，如神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、肌肉細胞、成纖維細胞等。細胞的誘導過程是胚胎干細胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天，細胞經(jīng)胰酶消化后，以高和低兩種細胞密度分別接種到12孔培養(yǎng)板，以含有不同濃度RA(0.1uM、0.2uM、0.5uM、luM)的ES細胞培養(yǎng)液(撤除了LIF因子)培養(yǎng)LJES1單層細胞，誘導3-4周，在誘導期間，為保持細胞處于合適的密度大小，要適時傳代。結(jié)果如表2和表3所示表2高密度下誘導分化結(jié)果

表3低密度下誘導分化結(jié)果

花鱸胚胎干細胞可形成擬胚體并發(fā)生分化花鱸胚胎干細胞經(jīng)胰酶消化后，制成約20×104cells/ml密度的單細胞懸液，再將其接種于9cm培養(yǎng)皿上蓋的內(nèi)表面上，接種培養(yǎng)基為誘導分化培養(yǎng)基1(在基礎培養(yǎng)基DMEM的基礎上添加5％的小牛血清和50mM 2-巰基乙醇)，制成許多懸浮細胞小滴。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-10天后，ES細胞形成擬胚體，可以看見一部分擬胚體中出現(xiàn)黑色素細胞。將擬胚體移至誘導分化培養(yǎng)基2(在基礎培養(yǎng)基DMEM的基礎上添加5％的小牛血清FBS、50mM2-巰基乙醇和0.5uM的視黃酸)中繼續(xù)培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察其分化情況，結(jié)果為LJES1細胞在誘導分化培養(yǎng)基1中懸滴培養(yǎng)3天后，形成擬胚體結(jié)構(gòu)，擬胚體不斷的向外生長，變大，大部分的擬胚體都出現(xiàn)典型的黑色素細胞。隨后，將擬胚體轉(zhuǎn)移到誘導分化培養(yǎng)基2中培養(yǎng)6-8小時后，擬胚體貼壁，并開始分化為樹狀肌肉細胞，最外層是成纖維細胞，有些擬胚體內(nèi)部還能看到分化為幾個胚層的現(xiàn)象；在完全培養(yǎng)基(撤除LI F因子，添加RA)中，擬胚體分化為神經(jīng)細胞，可以看見神經(jīng)細胞向外輻射的細長的軸絲。
花鱸胚胎干細胞的體內(nèi)分化能力體內(nèi)分化能力是證明胚胎干細胞發(fā)育全能性的重要證據(jù)。采用脂質(zhì)體介導法將pCMVEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染花鱸胚胎干細胞，使其表達綠色熒光蛋白并作為細胞供體。方法如下花鱸胚胎干細胞用完全培養(yǎng)基以20×104/ml細胞接種到12孔細胞培養(yǎng)板中，使細胞長滿培養(yǎng)孔的60％-80％，24℃過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)12-16小時后，進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。將DNA和脂質(zhì)體genejuice分別溶于不含血清和抗體的DMEM中，然后進行混合，形成DNA-脂質(zhì)體混合物，將其逐滴加到培養(yǎng)基表面并均勻的分布在培養(yǎng)基中，6-8h后，添加1ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時后，在激發(fā)波長為488nm的熒光顯微鏡下觀察熒光的表達，表達效率為10％-20％。以此細胞作為供體，采用顯微注射方法進行細胞移植制備花鱸嵌合體胚胎。注射時，將發(fā)育至囊胚中期的花鱸胚胎小心吸入到特制的瓊脂凹槽內(nèi)，使其在凹槽內(nèi)呈單排直線排列，加入少量滅菌海水浸沒胚胎。用撥卵針小心將胚胎的動物極轉(zhuǎn)至上方，將注射針注射入囊胚內(nèi)，每個囊胚注入20～50個供體細胞。將注射后發(fā)育形成的嵌合體于18℃無菌海水中培養(yǎng)，胚胎孵化后用新鮮過濾海水培養(yǎng)；注射后的胚胎和孵化出的魚苗進行熒光顯微觀察。在細胞移植24h后可觀察到綠色熒光蛋白在受體胚胎中的表達，共有7.7％的胚胎發(fā)育形成了表達綠色熒光蛋白的嵌合體，嵌合部位發(fā)生在胚胎的三個胚層內(nèi)，有的分布在眼、聽囊等部位，有的在胚體中部，有的在卵黃囊，充分證明了花鱸胚胎干細胞的體內(nèi)分化能力和發(fā)育全能性。
因此，形態(tài)學和倍性檢測、生理生化檢測、細胞體外分化檢測及細胞移植實驗充分證明本發(fā)明建立的花鱸胚胎干細胞系具有典型的胚胎干細胞特征。
權利要求
1.一種花鱸胚胎干細胞，其特征在于它的胚胎干細胞小且呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15-25um，具有大的細胞核和較少的細胞質(zhì)，具有高的堿性磷酸酶活性，細胞增殖速度快，在24℃下，細胞倍增時間為20小時左右；在人工誘導條件下，可以分化成神經(jīng)細胞、肌肉細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等不同類型細胞.
2.一種花鱸胚胎干細胞培養(yǎng)方法，其特征在于它的操作程序是花鱸胚胎囊胚期細胞的收集；胚胎干細胞的培養(yǎng)和傳代包括對囊胚期細胞進行原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)、溫度對花鱸胚胎干細胞生長的影響、穩(wěn)定胚胎干細胞的培養(yǎng)；對培養(yǎng)的花鱸胚胎干細胞進行特征鑒定包括形態(tài)學鑒定、堿性磷酸酶檢測、倍性檢測、細胞發(fā)育多能性的鑒定，花鱸胚胎囊胚期細胞的收集采集花鱸胚胎，鏡檢合格后在常溫下培養(yǎng)至囊胚中期時使用，每個胚胎含有大約1000個細胞，胚胎干細胞的培養(yǎng)和傳代對囊胚期細胞進行原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)將收集的囊胚期細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板中單層培養(yǎng)，加入完全培養(yǎng)基1.0ml，24℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)2-3天后，更換培養(yǎng)基，細胞長滿培養(yǎng)孔，按1∶2的比例進行細胞傳代，每2-3天更換1次培養(yǎng)基，1周傳代2-3次。完全培養(yǎng)基的配方為DMEM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/lHepes(pH7.5)、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/l谷氨酸、1mmol/l丙酮酸鈉、1mmol/l非必需氨基酸、5ng/ml重組人白血病抑制因子、15％胎牛血清、1％花鱸魚血清、0.1％胚胎抽提物、8nM的亞硒酸鈉、5ng/ml的成纖維生長因子、27.5μM巰基乙醇，溫度對花鱸胚胎干細胞生長的影響研究發(fā)現(xiàn)，LJES1在4-32℃下都能存活；在4℃下，細胞可存活40天，再轉(zhuǎn)到24℃下依然生長良好，能正常傳代；在32℃下，LJES1細胞可以生長、增殖，但生長速度開始下降，細胞最適宜溫度為24-28℃，28℃細胞生長速度達到最大。適宜LJES1生長的最適pH值為7.2-7.4，穩(wěn)定胚胎干細胞的培養(yǎng)形成穩(wěn)定的胚胎干細胞系后，細胞保持較快的生長速度，基本上不再自發(fā)分化，得到第13、35和60代胚胎干細胞倍增時間分別為19.76、20.67和21.31小時，在60小時細胞增殖速率達到最大，胚胎干細胞特征鑒定形態(tài)學鑒定在100×和400×的相差顯微鏡下觀察細胞的外形和細胞大小，比較本細胞與典型的胚胎干細胞的異同，其細胞具有典型的胚胎干細胞特征多邊形或多角形，具有大的細胞核，一個或兩個核仁，細胞直徑約為15-25um，堿性磷酸酶檢測細胞經(jīng)1％多聚甲醛固定，BCIP/NBT作為反應底物，在黑暗環(huán)境下對細胞進行染色，囊胚中期細胞為對照，相差顯微鏡觀察，花鱸胚胎干細胞與囊胚中期細胞一樣，被染色顯現(xiàn)強烈的紫紅色，為堿性磷酸酶陽性，倍性檢測對胚胎干細胞進行常規(guī)的染色體制備，顯微鏡下觀察染色體形態(tài)，統(tǒng)計二倍體細胞的比率，即染色體數(shù)目為48條的細胞所占比率為60％以上，細胞發(fā)育多能性的鑒定通過花鱸胚胎干細胞的體外分化能力驗證。體外誘導分化主要是在培養(yǎng)基中添加視黃酸(RA)及控制培養(yǎng)條件，可以誘導細胞分化成多種不同類型的細胞，如神經(jīng)樣細胞、肌肉樣細胞、纖維樣細胞及擬胚體等；體內(nèi)誘導分化主要是通過細胞移植構(gòu)建嵌合體進行多能性鑒定。
全文摘要
一種花鱸胚胎干細胞及培養(yǎng)方法，它的細胞小且呈圓形、多角形或多邊形，細胞直徑15－25um，具有大的細胞核和較少的細胞質(zhì)，細胞增殖速度快，具有發(fā)育多能性和分化潛力；其操作程序是花鱸囊胚期細胞收集；胚胎干細胞的原代和傳代培養(yǎng)、溫度對花鱸胚胎干細胞生長的影響、穩(wěn)定期胚胎干細胞培養(yǎng)；花鱸胚胎干細胞特征鑒定，包括形態(tài)學、堿性磷酸酶、倍性，發(fā)育多能性的鑒定和檢測。胚胎干細胞采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每周傳代2－3次。細胞采用無滋養(yǎng)層技術，于0.1％明膠處理的培養(yǎng)板上單層培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24℃。以此方法培養(yǎng)的花鱸胚胎干細胞具有典型的胚胎干細胞特征。本發(fā)明技術操作簡單，細胞增殖快速，可用于其他魚類胚胎干細胞培養(yǎng)。
文檔編號C12Q1/02GK1737130SQ20051004403
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月12日 優(yōu)先權日2005年7月12日
發(fā)明者陳松林, 沙珍霞, 葉寒青 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所