專利名稱：快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種宿主蛋白，尤其是涉及一種運(yùn)用革蘭氏陽性和陰性滅活病原菌快速分離純化與之互作的宿主蛋白，特別是其中微量蛋白的方法。
背景技術(shù)：
多細(xì)胞生物如果無法感知并消除微生物的入侵將無法生存，由于微生物分子的異質(zhì)性和高速度的進(jìn)化，辨別它們是很困難的。但生物已經(jīng)進(jìn)化出幾種策略來完成該任務(wù)，模式識別策略(pattern-recognition strategy)就是其中一個(gè)，生物通過模式識別受體(PRRs)與病原的模式相關(guān)的分子模式(PAMPs)結(jié)合識別病原，啟動(dòng)信息傳遞機(jī)制。Toll-like receptor(TLR)家族是最具代表性的PRRs，1996年Hoffmann的研究小組在果蠅中發(fā)現(xiàn)了作為模式識別受體的Toll受體。1年后，又從人體內(nèi)找到了可激發(fā)獲得性免疫的Toll同源物(即Toll-like receptor 4，TLR4)。到20世紀(jì)90年代，發(fā)現(xiàn)鼠的TLR4是識別脂多糖的受體，此后，許多哺乳動(dòng)物的TLRs受體陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，它們分別識別特異的PAMPs。TLR的發(fā)現(xiàn)使人們意識到先天性的免疫反應(yīng)不僅是機(jī)體抵抗微生物的第一道防線，而且也是激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。通過病原菌與動(dòng)物的宿主體液蛋白互作，然后洗脫黏附在病原菌表面的宿主蛋白，有望獲得宿主體液防御體系中參與識別入侵病原菌的某些蛋白，甚至可能找到一些新的PRRs，以進(jìn)一步闡明宿主啟動(dòng)免疫反應(yīng)的信息傳遞機(jī)制。新加坡國立大學(xué)的Zhu等人(Zhu Y，Thangamani S，Ho B and Ding JL.The ancient origin of the complement system.TheEMBO Journal.2005，24382-394.)用活葡萄球菌(Staphylococcus aureus)吸附宿主鱟的血清，從中分離出了與病原菌互作的與脊椎動(dòng)物補(bǔ)體C3功能類似的CrC3，然而其葡萄球菌的陰性對照組中出現(xiàn)了許多來自病原菌的雜帶，很難與來自宿主的蛋白區(qū)分開，這對后續(xù)的研究帶來了許多不便，特別是無法鑒定出低豐度的蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對宿主中與病原菌互作的蛋白，存在使用活菌時(shí)來自病原菌的蛋白污染樣品的不足之處，提供一種快速可靠檢測鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法。
為此本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是采用滅活的病原菌與宿主蛋白在體外互作，其步驟為1)利用甲醛滅活病原菌；
2)用洗脫液去除病原菌菌體外膜上易脫落的成分；3)讓病原菌與宿主蛋白孵育，讓宿主蛋白中能與病原菌互作的蛋白黏附到病原菌的表面；4)用洗脫液收集互作的宿主蛋白。
在步驟1)中所述的滅活病原菌是將用生理鹽水洗過至少1遍的病原菌用0.5％-1％的甲醛溶液重懸；在70～90℃滅活30～90min。
在步驟2)中所述的去除病原菌外膜上易脫落的成分是以4000～15000g離心至少2min，去除甲醛溶液；然后用含4～5M urea(以4.5M為佳)的pH為7.4～8.5(以8.0為佳)的0.01M Tris-HCl溶液重懸菌體，震蕩60～120min(以90min為佳)，以4000～15000g離心至少2min，去上清，至少重復(fù)1次；最后用生理鹽水洗至少1遍，離心至少2min，去除上清。
在步驟3)中所述的病原菌與宿主蛋白孵育是把宿主蛋白和病原菌混勻，震蕩30～120min(最好為90min)，以4000～15000g離心至少2min，去上清；最后用生理鹽水洗至少1遍，4000～15000g離心至少2min，去除上清。
在步驟4)中所述的用洗脫液收集互作的宿主蛋白是用4～5M urea的Tris-HCl溶液(以4M urea為佳)重懸菌體，以4000～15000g離心至少2min，所得的菌體待用；上清加入3～5倍體積的丙酮，置于低于-20℃的溫度下至少30min，在3～6℃的溫度下以10000～30000g離心至少10min，沉淀干燥，用pH為7.4～8.5(以pH8.0為佳)的0.01MTris-HCl溶液或者0.01M PBS溶液重懸，用Bradford檢測法測定蛋白濃度，然后進(jìn)一步用SDS-PAGE分析，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
在步驟4)中，所得的菌體用生理鹽水洗至少1遍后，可以與在步驟3)中的宿主蛋白上清重新混勻，然后按上述步驟3)和4)洗脫所需的蛋白。所述的菌體和宿主蛋白上清可以重復(fù)利用至少3次。
與現(xiàn)有的采用活菌捕捉的方法相比，由于本發(fā)明利用滅活病原菌捕捉宿主體內(nèi)相互作用蛋白，采用滅活的病原菌來吸附宿主蛋白，避免了因?yàn)榛罹够プ鞯乃拗鞯鞍资艿讲≡饽せ蛘叻置诘鞍孜廴镜膯栴}。因此本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于所得到的蛋白全是來源于宿主，無病原菌污染物，是一種高效可靠的檢測宿主中參與針對病原菌的防御系統(tǒng)中的首道防線中的蛋白組成情況的方法。


圖1為與大腸桿菌K12相互作用的文昌魚體液蛋白的SDS/PAGE分析。在圖1中，1.活病原菌的陰性對照(滅活葡萄球菌與生理鹽水孵育)；2.與活病原菌互作的宿主蛋白(滅活葡萄球菌與文昌魚體液蛋白孵育)。
圖2為本發(fā)明與金黃色葡萄球菌相互作用的文昌魚體液蛋白的SDS/PAGE分析。在圖2中，1.為與病原菌互作的宿主蛋白(滅活K12與文昌魚體液孵育)；2.為病原菌的陰性對照(滅活K12與生理鹽水孵育)。
圖3為本發(fā)明與嗜水氣假單胞菌相互作用的文昌魚體液蛋白的SDS/PAGE分析。在圖3中，1.為與病原菌互作的宿主蛋白(滅活金黃色葡萄球菌與文昌魚體液孵育)；2.為病原菌的陰性對照(滅活金黃色葡萄球菌僅與生理鹽水孵育)。
圖4為本發(fā)明與大腸桿菌K12相互作用的果蠅體液蛋白的SDS/PAGE分析。在圖4中，1.為與病原菌互作的宿主蛋白(滅活大腸桿菌K 12與果蠅體液孵育)；2.為病原菌的陰性對照(滅活大腸桿菌K12僅與生理鹽水孵育)。
圖5為本發(fā)明與金黃色葡萄球菌相互作用的小白鼠體液蛋白的SDS/PAGE分析。在圖5中，1.為與病原菌互作的宿主蛋白(滅活金黃色葡萄球菌與小白鼠血清孵育)；2.為病原菌的陰性對照(滅活金黃色葡萄球菌僅與生理鹽水孵育)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、病原菌滅活實(shí)驗(yàn)采用的大腸桿菌K12(Escherichia coli K12)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。挑取該菌株的單菌落，接種于500ml培養(yǎng)基中37℃，200rpm，12h搖菌，5000g室溫，離心10min，去上清；菌體用生理鹽水洗過3遍，5000g室溫，離心10min；所得菌體分別用1％的甲醛溶液重懸；80℃滅活90min。
2、去除病原菌表面易脫落的成分12000g，室溫5min離心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸菌體，輕搖90min，12000g，室溫5min離心，去上清，重復(fù)3次；最后用8.5％的生理鹽水洗3遍(12000g，5min離心，室溫去上清)。
3、病原菌與宿主蛋白孵育把病原菌平分成兩組，一組與文昌魚體液混勻，另一組作為對照組與等體積生理鹽水混勻；都置于室溫，輕搖60min；12000g 4℃離心5min；文昌魚的血清4℃暫時(shí)保存；最后兩組都用8.5％的生理鹽水洗3遍。
4、蛋白洗脫用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分別重懸菌體，室溫輕搖60min，分別于12000g，4℃，5min離心，菌體分別都收于4℃；上清分別加入4倍體積的丙酮，置于-20℃，過夜，12000g，4℃，離心20min，沉淀風(fēng)干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重懸，然后進(jìn)一步用SDS-PAGE分析結(jié)果見圖1，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)1號蛋白為histone h4，并且蛋白得分具有顯著性。檢測結(jié)果見圖1。
實(shí)施例21、病原菌滅活實(shí)驗(yàn)采用的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。挑取該菌株的單菌落，接種于500ml培養(yǎng)基中37℃，200rpm，12h搖菌，5000g室溫，離心10min，去上清；菌體用生理鹽水洗過3遍，5000g室溫，離心10min；所得菌體分別用1％的甲醛溶液重懸；70℃滅活90min。
2、去除病原菌表面易脫落的成分12000g，室溫5min離心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸菌體，輕搖90min，12000g，室溫5min離心，去上清，重復(fù)3次；最后用8.5％的生理鹽水洗3遍(12000g，5min離心，室溫去上清)。
3、病原菌與宿主蛋白孵育把病原菌平分成兩組，一組與文昌魚體液混勻，另一組作為對照組與等體積生理鹽水混勻；都置于室溫，輕搖60min；12000g 4℃離心5min；文昌魚的血清4℃暫時(shí)保存；最后兩組都用8.5％的生理鹽水洗3遍。
4、蛋白洗脫用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分別重懸菌體，室溫輕搖60min，分別于12000g，4℃，5min離心，菌體分別都收于4℃；上清分別加入4倍體積的丙酮，置于-20℃，過夜，12000g，4℃，離心20min，沉淀風(fēng)干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重懸，然后進(jìn)一步用SDS-PAGE分析結(jié)果見圖2，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)1號蛋白為pol protein，并且蛋白得分具有顯著性。檢測結(jié)果見圖2。
實(shí)施例31、病原菌滅活實(shí)驗(yàn)采用的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。挑取該菌株的單菌落，接種于500ml培養(yǎng)基中37℃，200rpm，12h搖菌，5000g室溫，離心10min，去上清；菌體用生理鹽水洗過3遍，5000g室溫，離心10min；所得菌體分別用1％的甲醛溶液重懸；80℃滅活90min。
2、去除病原菌表面易脫落的成分12000g，室溫5min離心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸菌體，輕搖90min，12000g，室溫5min離心，去上清，重復(fù)3次；最后用8.5％的生理鹽水洗3遍(12000g，5min離心，室溫去上清)。
3、病原菌與宿主蛋白孵育把病原菌平分成兩組，一組與文昌魚體液混勻，另一組作為對照組與等體積生理鹽水混勻；都置于室溫，輕搖60min；12000g 4℃離心5min；文昌魚的血清4℃暫時(shí)保存；最后兩組都用8.5％的生理鹽水洗3遍。
4、蛋白洗脫用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分別重懸菌體，室溫輕搖60min，分別于12000g，4℃，5min離心，菌體分別都收于4℃；上清分別加入4倍體積的丙酮，置于-20℃，過夜，12000g，4℃，離心20min，沉淀風(fēng)干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重懸，然后進(jìn)一步用SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)1號蛋白為Actin，muscle，并且蛋白得分具有顯著性。檢測結(jié)果見圖3。
實(shí)施例41、實(shí)驗(yàn)采用的大腸桿菌K12(Escherichia coli K12)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。挑取該菌株的單菌落，接種于500ml培養(yǎng)基中37℃，200rpm，12h搖菌，5000g室溫，離心10min，去上清；菌體用生理鹽水洗過3遍，5000g室溫，離心10min；所得菌體分別用1％的甲醛溶液重懸；80℃滅活90min。
2、去除病原菌表面易脫落的成分12000g，室溫5min離心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸菌體，輕搖90min，12000g，室溫5min離心，去上清，重復(fù)3次；最后用8.5％的生理鹽水洗3遍(12000g，5min離心，室溫去上清)。
3、病原菌與宿主蛋白孵育把病原菌平分成兩組，一組與果蠅體液混勻，另一組作為對照組與等體積生理鹽水混勻；都置于室溫，輕搖60min；12000g 4℃離心5min；文昌魚的血清4℃暫時(shí)保存；最后兩組都用8.5％的生理鹽水洗3遍。
4、蛋白洗脫用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分別重懸菌體，室溫輕搖60min，分別于12000g，4℃，5min離心，菌體分別都收于4℃；上清分別加入4倍體積的丙酮，置于-20℃，過夜，12000g，4℃，離心20min，沉淀風(fēng)干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重懸，然后進(jìn)一步用SDS-PAGE分析結(jié)果見圖4，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)1號蛋白為glycogen phosphorylase；2號蛋白為ATP synthase beta subunit；并且蛋白得分都具有顯著性。檢測結(jié)果見圖4。
實(shí)施例51、病原菌滅活實(shí)驗(yàn)采用的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。挑取該菌株的單菌落，接種于500ml培養(yǎng)基中37℃，200rpm，12h搖菌，5000g室溫，離心10min，去上清；菌體用生理鹽水洗過3遍，5000g室溫，離心10min；所得菌體分別用1％的甲醛溶液重懸；70℃滅活90min。
2、去除病原菌表面易脫落的成分12000g，室溫5min離心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸菌體，輕搖90min，12000g，室溫5min離心，去上清，重復(fù)3次；最后用8.5％的生理鹽水洗3遍(12000g，5min離心，室溫去上清)。
3、病原菌與宿主蛋白孵育把病原菌平分成兩組，一組與小白鼠血清混勻，另一組作為對照組與等體積生理鹽水混勻；都置于室溫，輕搖60min；12000g 4℃離心5min；小白鼠的血清4℃暫時(shí)保存；最后兩組都用8.5％的生理鹽水洗3遍。
4、蛋白洗脫用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分別重懸菌體，輕搖60min，分別于12000g，4℃，5min離心，菌體分別都收于4℃；上清分別加入4倍體積的丙酮，置于-20℃過夜；12000g，4℃，離心20min，沉淀風(fēng)干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重懸，然后用SDS-PAGE分析結(jié)果見圖5，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)1號蛋白為immunoglobulinheavy chain variable region，并且蛋白得分具有顯著性。檢測結(jié)果見圖5。
權(quán)利要求
1.快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于其步驟為1)利用甲醛滅活病原菌；2)用洗脫液去除病原菌菌體外膜上易脫落的成分；3)讓病原菌與宿主蛋白孵育，讓宿主蛋白中能與病原菌互作的蛋白黏附到病原菌的表面；4)用洗脫液收集互作的宿主蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟1)中，所述的滅活病原菌是將用生理鹽水洗過至少1遍的病原菌用0.5％-1％的甲醛溶液重懸；在70～90℃滅活30～90min。
3.如權(quán)利要求1所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟2)中所述的去除病原菌外膜上易脫落的成分是以4000～15000g離心至少2min，去除甲醛溶液；然后用含4～5M urea的pH為7.4～8.5的0.01M Tris-HCl溶液重懸菌體，震蕩60～120min，以4000～15000g離心至少2min，去上清，至少重復(fù)1次；最后用生理鹽水洗至少1遍，離心至少2min，去除上清。
4.如權(quán)利要求3所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟2)中所述的去除甲醛溶液后用含4.5M的pH為8.0的0.01M Tris-HCl溶液重懸菌體，震蕩90min。
5.如權(quán)利要求1所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟3)中所述的病原菌與宿主蛋白孵育是把宿主蛋白和病原菌混勻，震蕩30～120min，以4000～15000g離心至少2min，去上清；最后用生理鹽水洗至少1遍，4000～15000g離心至少2min，去除上清。
6.如權(quán)利要求5所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟3)中所述的震蕩為90min。
7.如權(quán)利要求1所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟4)中所述的用洗脫液收集互作的宿主蛋白是用4～5M urea的Tris-HCl溶液重懸菌體，以4000～15000g離心至少2min，所得的菌體待用；上清加入3～5倍體積的丙酮，置于低于-20℃的溫度下至少30min，在3～6℃的溫度下以10000～30000g離心至少10min，沉淀干燥，用pH為7.4～8.5的0.01M Tris-HCl溶液或者0.01M PBS溶液重懸，用Bradford檢測法測定蛋白濃度，然后進(jìn)一步用SDS-PAGE分析，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
8.如權(quán)利要求7所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟4)中所述的Tris-HCl溶液的濃度為4M urea；0.01M Tris-HCl溶液的pH為8.0。
9.如權(quán)利要求1所述的快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，其特征在于在步驟4)中，所得的菌體用生理鹽水洗至少1遍后，可以與在步驟3)中的宿主蛋白上清重新混勻，然后按步驟3)和4)洗脫所需的蛋白。
全文摘要
快速鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法，涉及一種運(yùn)用革蘭氏陽性和陰性滅活病原菌快速分離純化與之互作的宿主蛋白的方法。提供一種快速可靠檢測鑒定與病原菌互作的宿主蛋白的方法。利用甲醛滅活病原菌；用洗脫液去除病原菌菌體外膜上易脫落成分；讓病原菌與宿主蛋白孵育，讓宿主蛋白中能與病原菌互作的蛋白黏附到病原菌表面；用洗脫液收集互作的宿主蛋白。由于利用滅活病原菌捕捉宿主體內(nèi)相互作用蛋白，采用滅活的病原菌吸附宿主蛋白，避免因活菌而使互作的宿主蛋白受到病原菌外膜或者分泌蛋白污染的問題。所得蛋白全來源于宿主，無病原菌污染物，是一種高效可靠的檢測宿主中參與針對病原菌的防御系統(tǒng)中的首道防線中的蛋白組成情況的方法。
文檔編號C12Q1/04GK1869704SQ20061009148
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月14日
發(fā)明者彭宣憲, 莊振宏, 王三英 申請人:廈門大學(xué)