專利名稱：：一種檢測col7a1基因突變的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測CO丄Z47基因突變的方法，尤其C(9丄Z^基因突變G26311T的檢測方法，本發(fā)明還提供了該方法的用途，即在檢測人類營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的基因芯片或制劑上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：遺傳性大皰性表皮松解癥是由一組臨床表現(xiàn)相關(guān)的疾病組成，按照電鏡標(biāo)準(zhǔn)，以水皰在皮膚的位置為標(biāo)準(zhǔn)，可將其分為單純型大皰性表皮松解癥，交界型大皰性表皮松解癥和營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥。VII型膠原最早是由Bebtz等分離出的一種膠原，當(dāng)時命名為長鏈膠原(LC)。Ryynanen等通過Northern雜交發(fā)現(xiàn)VII型膠原mRNA在角質(zhì)形成細胞和口腔表皮癌細胞系表達。間接免疫熒光示19周的胎兒基底膜帶有VII型膠原基因的表達，提示角質(zhì)形成細胞也許是VII型膠原最初的細胞來源。1993年Greenspan等通過熒光原位雜交將編碼VII型膠原的基因CO丄Z4/定位于人3p21.3區(qū)域。Ryynanen等和Hovnanian等分別發(fā)現(xiàn)DDEB和RDEB都是由C"Z4/基因突變所致。Christiano等檢測克隆的VII型膠原cDNA序列發(fā)現(xiàn)其有118個外顯子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的外顯子最多的基因，其第一個外顯子編碼5'非翻譯區(qū)信號肽，第2至第27外顯子編碼氨基酸球形NC-1區(qū)域，之后的84個外顯子編碼三螺旋區(qū)，113至118個外顯子編碼NC-2的其余部分。VII型膠原是錨原纖維的主要成分，當(dāng)發(fā)生突變時，甘氨酸被替代，有可能改變了三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使VII型膠原分子易被蛋白水解酶降解，使錨原纖維變細或數(shù)量減少。COL7Al基因突變型和DEB表型近年來報道DDEB和RDEB都是由COL7Al發(fā)生突變所致。利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)及DNA直接測序等技術(shù)，對DEB患者及其家系進行基因突變的檢測，取得了很大的進展。DDEB和局限型RDEB的區(qū)別這兩型患者在臨床上和病理上難以區(qū)分。家族史很重要，但由于很少有大的家系或自發(fā)性突變(dencwd)的DDEB的出現(xiàn)，更使兩者難于區(qū)分。利用透射電鏡也很難將兩者區(qū)分，從而說明了分子生物學(xué)水平上闡明兩者區(qū)別的重要性。Mallipeddi等通過對兩個家系輕中度DEB四個患者直接測序，結(jié)果表明兩個患者的兩個等位基因都存在突變，患者1的兩條等位基因的突變型分別是Arg578stop(R578X)和Gly2263Val(G2263V)，其父母是雜合子；患者2的兩條等位基因的突變型分別是Arg578stop(R578X)和Gly2674Asp(G2674D)，無其父母血樣，兩患者均診斷為RDEB。這進一步證實了甘氨酸替代也見于隱性遺傳的DEB，這種突變在雜合子中是顯性失活的，只有在另一個等位基因上也存在突變時才有臨床表現(xiàn)，而且臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度取決于第二個突變。所以DDEB只要找出一個突變即可，RDEB則要分別找出來源于父母的兩個突變才能實現(xiàn)基因診斷。Hammami-Hauasli等在研究了數(shù)例隱性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥時發(fā)現(xiàn)，在73外顯子發(fā)生的突變G2006D，G2034R，G2015E以顯性失活的的方式，干預(yù)了VII型膠原的折疊和分泌，利用共焦激光掃描和免疫印跡方法研究，表明營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的角質(zhì)形成細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，聚集了高于對照組的變異的前VII型膠原。進一步分析表明，此三個突變均接近三螺旋區(qū)的絞鏈區(qū)。而顯性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的突變位置更接近非膠原絞鏈區(qū)。COLZAl基因突變的發(fā)現(xiàn)開辟了一個新領(lǐng)域。為營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患者打開一扇新的診斷、治療的大門。目前，通過國內(nèi)外同行的研究發(fā)現(xiàn)了多個COLZAl基因突變位點，通過發(fā)現(xiàn)新的突變位點有利于進一步認(rèn)識COLZAl基因?qū)τ谄つw組織生理功能意義，更加深入的了解其與疾病的關(guān)系。并且有可能存在著突變熱點，這將有利于將來在臨床上開展患者的COLZAl突變篩查工作，為患者產(chǎn)前診斷和治療提供服務(wù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測COLZAl基因突變的方法，該方法可以檢測出人類營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥致病基因突變，本發(fā)明還提供了該方法的用途。本發(fā)明提供的檢測C0L7A1基因突變的方法，其步驟包括(1)采用引物p87F和P87R對包含(GenBankL23982)基因26124-26619位的堿基序列(序列表中序列1)在內(nèi)區(qū)段進行PCR擴增；p87F的堿基序列為TGGGCCTGAAATATGAGGAG(序列表中序列2)P87R的堿基序列為TAGGCCACTGGAGAGACAGG(序列表中序列3)(2)PCR產(chǎn)物進行純化；(3)采用p87F或P87R引物對PCR產(chǎn)物進行測序。本發(fā)明提供的檢測基因突變的另一種方法，其步驟包括(1)采用p87F和P87R引物對CO丄7"基因包含26124-26619的堿基序列在內(nèi)區(qū)段進行PCR擴增；(2)采用p87Fa和P87Ra對上述PCR產(chǎn)物進行巢式擴增；p87Fa的堿基序列為TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG(序列表中序列4);P87Ra的堿基序列為TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA(序列表中序列5);(3)對巢式PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶BslI進行酶切；(4)使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，檢測片斷大小。上述二種方法在檢測人類營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的基因芯片或制劑上的應(yīng)用。發(fā)明人選取COL7A1基因作為研究對象，通過在一營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥家系9名患者和11名正常家系成員及200名對照組中進行篩查，發(fā)現(xiàn)一個營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的新致病突變點(G26311T)，即87內(nèi)含子區(qū)的第1個堿基)。這一突變位點在11名家系內(nèi)正常人及200名對照組中均沒有發(fā)現(xiàn)，說明這一突變位點會導(dǎo)致營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥，這一突變位點位于COL7A1基因一個剪切識別位點。本發(fā)明為營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患者的產(chǎn)前診斷提供了一種新的途徑，以及為患者提供了基因治療的依據(jù)。圖1為COL7A1測序結(jié)果COL7A1突變測序結(jié)果比對(左圖為正常序列，右圖為突變序列)圖2為PCR結(jié)合限制性酶切檢測COL7A1突變位點G26311T。具體實施例方式正常COL7A1基因的編碼區(qū)(GenBank/EMBLaccessionNo.L23982)26124-26619的堿基序列如序列表中序列1所示。其第26311位堿基由G突變?yōu)門;突變基因的86-88外顯子轉(zhuǎn)錄的mRNA缺少87外顯子。本發(fā)明包括檢測COL7A1基因的第26311位堿基(87內(nèi)含子第1個堿基)的改變，或由該點突變引起的表達產(chǎn)物的相應(yīng)改變或其互補序列的相應(yīng)改變。所述第26311位堿基的改變?yōu)镚突變?yōu)門。通過擴增人體中全長或部分COL7A1基因以獲得擴增序列，然后對擴增序列測序來檢測。在發(fā)明人進行的研究中，發(fā)明人收集表皮松解癥遺傳資源，建立表皮松解癥遺傳資源庫。在患者自愿的前提下，簽署知情同意書后，留取5—1Oml血樣，并建立門診病歷資料庫，詳細記錄患者病情、家系中的發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。應(yīng)用酚氯仿的方法提取基因組DNA定量后入庫，一20℃保存，每份DNA樣品均詳細對應(yīng)于登記的患者臨床資料。應(yīng)用在線引物設(shè)計軟件primer3設(shè)計80對引物，包含COL7A1整個編碼區(qū)及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)，應(yīng)用PCR擴增。PCR產(chǎn)物直接測序；測序引物與PCR擴增引物相同，正反向側(cè)序(例如應(yīng)用ABI公司3100測序儀)。得到的序列與Genebank中的序列比較確定了突變位點。發(fā)明人還利用一對巢式引物對以上PCR產(chǎn)物創(chuàng)造一個新的酶切位點，通過酶切后電泳確認(rèn)了突變點堿基的改變。本發(fā)明所述的突變可以通過本領(lǐng)域己知的任何檢測方法來進行，例如擴增人體中全長或部分CO丄7J7基因基因組DNA或cDNA以獲得擴增序列，然后對擴增序列測序來檢測，或通過將從組織中分離出來的Q9丄7^/基因與C(9丄Z4/基因探針雜交來檢測，或通過從組織中分離出的CO丄Z47基因與C(9丄Z47等位基因特異性探針雜交來檢測所述堿基的改變，或通過限制性片段長度多態(tài)性來檢測所述堿基的改變。所用的雜交探針可以是與正常的09￡7」/核酸序列雜交，或與突變的核酸序列雜交，或與它們的互補序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素，發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記。在進行探針檢測前，優(yōu)選PCR擴增目標(biāo)基因。尤其；利用等位基因特異探針，可以篩查已被確定的突變是否存在。另外，還可以通過檢測該基因的表達產(chǎn)物；如蛋白和mRNA來檢測該基因的突變。本發(fā)明還提供一種檢測導(dǎo)致營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥基因CO丄7J7(G26311T)突變位點的試劑盒，其內(nèi)裝有一個或多個容器，容器內(nèi)裝有用以檢測C"Z4/(G26311T)突變的一種或多種成分，同時提供經(jīng)政府藥物管理機構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售的信息。例如，采用PCR擴增后，直接檢測樣品中CO丄Z4/基因G26311T突變位點的試劑盒。含有擴增引物，dNTP，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知，以上組分僅是示意性的；例如，所述的引物可以依據(jù)己知的核著酸序列設(shè)計，通常為l5-30個堿基，GC含量為45-55%左右，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡c模板特異性結(jié)合，其可以利用專門的計算機程序設(shè)計，所述的用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴增的酶。并說明使用方法如下PCR擴增PCR反應(yīng)條件為94t預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，退火溫度60℃30秒，72'C延伸40秒，35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72℃延伸7分鐘，4"C保存。PCR產(chǎn)物純化將含有PCR產(chǎn)物的Multiscreen-PCR板抽真空，加入去離于水，靜置，7隨后將Multiscreen-PCR板置于混合器上震蕩，純化后的PCR產(chǎn)物重新溶解后至另一潔凈的96孔板中。測序反應(yīng)及驗證以PCR引物之一作為測序引物進行測序反應(yīng)，在ABI9700熱循環(huán)儀上進行測序反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，延伸產(chǎn)物上樣于ABIPRISM3100DNA序列分析儀。將所得到的圖譜進行分析。與Genebank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較可以發(fā)現(xiàn)突變位點。該試劑盒可簡便快捷地檢測09丄7力7(G26311T)突變位點，從而應(yīng)用于營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥基因的檢測和治療方法中。例如，在檢測為發(fā)生了突變之后，可以將正?；?qū)霐y帶突變基因的細胞并在其中表達，它可與內(nèi)源性突變基因發(fā)生重組，從而可進行基因治療。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)說明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列事實例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringharborLabortoryPress,1989)，分子克隆實驗室指南(第三版，科學(xué)出版社，2002)中所述的條件，或按照生產(chǎn)廠商所建議的條件。實施例1下面通過基因測序檢測COL7A1基因突變。一、COL7A1基因編碼區(qū)的PCR擴增對象門診收集的營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥家系包括9例患者，ll位健康人，正常對照200例。對所有參加者詳細進行體格檢査，在簽署知情同意書以后每人采集血樣5m1?；蚪MDNA提取采用酚氯仿抽提法。1、抗凝血用PBS作1倍稀釋。2、在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18。C一28°C)，上面鋪一層1倍體積己稀釋的血液，室溫離心1000*g20分。3、吸棄上清，小心吸出中間有核細胞層，轉(zhuǎn)入5mlEp管中，5000g，IO分鐘，然后用PBS洗一次。5000*g10分。4、將細胞懸于2mlTE緩沖液中，力f]10X的SDS至終濃度0.5X(10(il)，蛋白酶100—200pl(10mg/ml)，50。C水浴3—5小時。5、用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，離心5000g1O分鐘。6、吸上清至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000*g10分鐘。7、吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000*g10分鐘。8、吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入l/1O體積的乙酸鈉，混勻。9、加入2.5倍體積的無水乙醇。10、20。C沉淀DNA過夜。11、高速離心，10000*g，1O分鐘，4°C。12、棄上清，加入75%乙醇2m1，高速離心10000*g，5分鐘。13、棄上清，吹干。14、用TE緩沖液溶解，(400plTE/5m1全血，600-800TE/10m1全血)15、分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計定量。C(9丄7J7基因擴增-PCR反應(yīng)條件引物序列p87F:TGGGCCTGAAATATGAGGAGP87R:TAGGCCACTGGAGAGACAGG反應(yīng)體系25^1名稱原液濃度加樣量(w)體系終濃度Buffer10*2.51*dNTP2.5mM3.0400pMPrimers10|iM1.07.5pmolAmpliTaq5units/pl1.01U/jxlTemplate25ng/pA1.010ng/|jlddHO補齊至25^1。其中Buffer、dNTP、Primers、Taq酶為上海生工公司提供。反應(yīng)條件反應(yīng)在ABI公司9700熱循環(huán)儀上進行，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94t變性30秒，退火溫度55°C30秒，72°C延伸40秒，35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72℃延伸7分鐘，4℃保存。二、PCR產(chǎn)物直接測序首先進行PCR產(chǎn)物純化1、向裝有PCR產(chǎn)物的96孔板中加入5O微升洗滌緩沖液，混勻。2、將其轉(zhuǎn)移到Mi11ipore純化板中，放到真空泵上抽濾約3分鐘，看到純化板中沒有水即可。3、向純化板中再次加入5O微升的洗滌緩沖液，繼續(xù)抽濾，直到純化板中沒有水為止。4、將純化板從真空泵上取下，向板中加入2O微升的去離子水，靜置l5分鐘。5、再震蕩l5分鐘，然后吸到一新96孔板內(nèi)。測序反應(yīng)所需試劑應(yīng)為新鮮配制，需要經(jīng)高壓滅菌的試劑必須滅菌后方可使用。測序反應(yīng)所需的器材(如384孔板、tip頭等)同樣應(yīng)為潔凈無菌的。6、為了保證測序樣本及反應(yīng)試劑的新鮮，加樣時應(yīng)在冰上操作。7、反應(yīng)體系為5^1，各種試劑加入量如下PCR產(chǎn)物3-10ng，BigDyev3.10.255*BigDyebuffer0.875pl，引物p87F1.6pmol8、樣品放于PCR儀上做如下反應(yīng)<table><row><column>步驟</column><column>作用</column></row><row><column>1</column><column>95°C，5分</column></row><row><column>2</column><column>重復(fù)以下程序30個循環(huán)95°C，10秒60°C，4分</column></row><row><column>3</column><column>4℃保持直到準(zhǔn)備純化</column></row><table>9、在每個孔中加入20ul180%乙醇，4，000rpm離心30min10、將樣品板放在折好的紙巾上，在離心機中倒甩，倒甩時速率1000rpm，11、在每孔中加入30^170%乙醇，4000rpm離心10min，倒甩；12、重復(fù)第11步的操作2次13、將樣品板放于干凈的抽屜中，避光干燥30min;14、加人5pl甲酰胺，封膜，離心后置于-2(TC冰箱中15、上測序儀前95'C變性5分鐘，放置冰上2分鐘，離心后上樣。測序結(jié)果如圖1所示。突變存在于第26311位堿基G-T。實施例2下面通過限制性片段長度多態(tài)性來檢測所述堿基的改變。一、CO丄7J7基因內(nèi)含子86/外顯子87的PCR擴增1、對于樣品DNA使用引物p87F和p87R及其他試劑PCR擴增86/外顯子87，步驟見實施例1中第一部分。2、PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋200倍后取1^1作為模板進行第二輪PCR，引物如下p87Fa:5，-TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG-3，禾Qp87Ra:5，-TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA-3，，其他試劑及步驟見實施例1中第一部分。3、PCR產(chǎn)物純化，步驟見實施例1中第二部分1-5步。4、20nlPCR產(chǎn)物加BslI(NEB公司)1U，10*buffer2.5pl,加水補齊25|^1，55。C保溫2小時。5、電泳使用1.5%瓊脂糖凝膠，1*TAE電泳緩沖液，電壓5V/cm，電泳30分鐘，在紫外燈下觀測，患者樣品會呈現(xiàn)123bp和104bp兩條帶，而正常對照只有104bp—條帶。(如圖2所示)實施例3檢側(cè)營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥致病基因點突變位G26311T試劑盒及其應(yīng)用1試劑盒含有擴增用引物p87F:TGGGCCTGAAATATGAGGAGP87R:TAGGCCACTGGAGAGACAGGPCR擴增用Taq酶5u/u110*緩沖液(含l5mlMgCl2。)dNTP2mMBigDyemix2使用方法主要包括如下步驟A.提取DNA，利用上述引物，進行PCR反應(yīng)；B:PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后直接測序，將所得的序列與Genebank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較確定突變位點的存在。具體方法參見實施例1。還可以通過從組織中分離出的COL7A1基因與COL7A1等位基因特異性探什雜交來檢測所述堿基的改變。應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容以后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，但改動或修改的等價形式同樣落在本發(fā)明所限定的范圍內(nèi)。序列表〈110>華中科技大學(xué)〈120〉一種檢測C0L7A1基因突變的方法及其用途〈160〉5〈170〉PatentlnVersion3.1<210〉1<211>496〈212〉DNA〈213>智人(HomoSapiens)<400〉1tgggcctgaacacgctgctccctggccccacaactcctctgcgggggagggc幼agggagggccaaggaagacctggtggtctctccagtatatgaggagtgccatagggcgggggccccgcctcaccca郷Eigga獄卿3ggtg3gtcccactgacgtgagccggtggcctatggggcagcagtcaccaggttggacaggtgcaagcctgtttcactagcattgtgtgtgggctctccccctaagtagggaaggggtggtggctgcctggccatctttgacctccaaatgcctccccacagggctgccagtgtaccagggagcttctgacagtgg卿ggcactgtcggaccctgacttccaatgggggtggctgtggtcgg3gggggggtccccctggaggcagatgttctctgagttcct60taaaggagaa120ccccctgcag180cagggtgggg240gctccctgga300aactggtggg360ccttgctgga420gggggtcctg480496〈210〉2<211>20〈212〉DNA<213〉智人(HomoSapiens)<400〉2tgggcctgaaatatgaggag<210>3〈211〉20〈212>DNA<213〉智人(HomoSapiens)〈400〉3taggccactggagagacagg<210>4<211>20<212〉DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>4tcccacgggggcccctggacag<210〉5〈211〉20<212〉DNA213〉智人(HomoSapiens)<400〉5tcccccgcccccaccctgcca權(quán)利要求1、一種檢測COL7A1基因突變的方法，其步驟包括(1)采用引物p87F和P87R對COL7A1基因包含26124-26619的堿基序列在內(nèi)區(qū)段進行PCR擴增；p87F的堿基序列為TGGGCCTGAAATATGAGGAGP87R的堿基序列為TAGGCCACTGGAGAGACAGG(2)PCR產(chǎn)物進行純化；(3)采用p87F或P87R引物對PCR產(chǎn)物進行測序。2、一種檢測C(9Z7^7基因突變的方法，其步驟包括(1)采用p87F和P87R引物對CO丄7^基因包含26124-26619的堿基序列在內(nèi)區(qū)段進行PCR擴增；(2)采用p87Fa和P87Ra對上述PCR產(chǎn)物進行巢式擴增；p87Fa的堿基序列為TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG;P87Ra的堿基序列為TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA;(3)對巢式PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶BslI進行酶切；(4)使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，檢測片斷大小。3、上述權(quán)利要求1或2所述方法的用途，其特征在于在檢測人類營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的制劑或基因芯片上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測COL7A1基因26311位突變的方法及其用途。該方法采用引物p87F(TGGGCCTGAAATATGAGGAG)和P87R(TAGGCCACTGGAGAGACAGG)對COL7A1基因包含26251-26350的區(qū)段進行PCR擴增；產(chǎn)物純化后進行測序；或用p87Fa(TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG)和P87Ra(TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA)對上述PCR產(chǎn)物進行巢式擴增后用BslI進行酶切檢驗。其用途是在檢測營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥的制劑或基因芯片上的應(yīng)用。本發(fā)明為表皮松解癥產(chǎn)前診斷提供了一種新的途徑，以及為基因治療提供了依據(jù)。文檔編號C12Q1/68GK101200758SQ20061012548公開日2008年6月18日申請日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日發(fā)明者代小華,翔任,劉木根,劉靜宇,淇姚,擎王,洲蔡申請人:華中科技大學(xué)