專利名稱：殼聚糖樹脂固定化酶純化大豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用制備的殼聚糖樹脂固定化胰蛋白酶，從大豆乳清廢水中純化大豆胰蛋 白酶抑制劑。該工藝?yán)锰崛〈蠖沟鞍缀蟮娜榍鍙U水，可得電泳純胰蛋白酶抑制劑，在大豆 乳清廢水高值化利用及環(huán)境工程等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
大豆是我國豐富的糧食資源，大豆乳清是工業(yè)上采用堿溶酸沉工藝生產(chǎn)大豆分離 蛋白的副產(chǎn)物，其中含有大量的胰蛋白酶抑制劑、低聚糖、異黃酮、維生素等功能性成分。 但目前我國相關(guān)企業(yè)一般都沒有對大豆乳清液采取相應(yīng)的治理、回收措施，而將其作為廢水 處理。據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)大豆分離蛋白生產(chǎn)企業(yè)每年排放的大豆乳清廢棄液在300萬噸以上。這 不但浪費了大量有用資源，還造成了環(huán)境污染。因此，對大豆乳清廢棄液進(jìn)行資源化處理， 回收其中的功能性物質(zhì)成為近年來我國研究和工程的一個熱點問題。目前，從大豆乳清廢棄 液中提取生物活性物質(zhì)研究較為成熟的是大豆低聚糖、大豆異黃酮和大豆皂甙的提取，也有 相關(guān)專利文獻(xiàn)。而對于其中的大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化尚未受到充分重視。
胰蛋白酶抑制劑具有多種生理功能，在生物農(nóng)藥及生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。 而胰蛋白酶抑制劑的分離純化，僅在實驗室水平上采取水浸、酸提、鹽析、離子交換層析或 凝膠過濾層析等較為繁雜的方法純化制得，且耗時長、產(chǎn)率和純度也不高；用制備電泳方法， 雖可得到高純度胰蛋白酶抑制劑，但產(chǎn)率極低，花費更高。殼聚糖在自然界中含量豐富，安 全無毒，容易進(jìn)行化學(xué)修飾；制備的殼聚糖微球樹脂具有剛性大，內(nèi)部多孔、呈立體網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，比表面積大，親水性好的特點，可以滿足各種吸附與分離工作的需要。因此，采用無毒 的環(huán)氧氯丙烷作為活化劑，在殼聚糖微球樹脂上引入環(huán)氧基，進(jìn)而偶聯(lián)胰蛋白酶，應(yīng)用于大 豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的分離純化，具有十分廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是利用制備的多孔、立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖微球樹脂固定化胰蛋白酶，提 供一種從大豆乳清廢水中純化大豆胰蛋白酶抑制劑的工藝過程。
工藝流程如下將殼聚糖溶于醋酸溶液中，控制溫度，分別加入液體石蠟、司班、乙酸 乙酯、甲醛、戊二醛，調(diào)節(jié)pH，反應(yīng)3 4小時，再加入硼氫化鈉溶液，繼續(xù)反應(yīng)1 1.5小 時后，減壓抽濾、洗漆、干燥，即得殼聚糖微球樹脂。將殼聚糖樹脂置于NaOH溶液中，以環(huán) 氧氯丙烷為活化劑， 一定溫度下活化樹脂?；罨髽渲尤胍鹊鞍酌高M(jìn)行偶聯(lián)，減壓抽濾、 真空干燥，即得殼聚糖樹脂固定化胰蛋白酶。將固定化酶樹脂裝柱，以乳清廢棄液過柱，洗 脫，收集活性部分冷凍干燥，得到電泳純大豆胰蛋白酶抑制劑。
具體實施方式
將相對于醋酸溶液3. 0 7. 0%的殼聚糖粉末溶于2. 0 7. 0%的醋酸溶液中， 于20 50。C不斷攪拌下加入司班0.5 5. 5ml，加入乙酸乙酯15 55ml，反應(yīng)20 50min;調(diào) 節(jié)溫度50~80°C，加入甲醛15 55ml，反應(yīng)30 50min;調(diào)節(jié)溫度85 95。C，加入戊二醛 10 50ml并調(diào)節(jié)pH值為7.0 10.0，繼續(xù)反應(yīng)3 5小時。逐滴加入0. 5 8. 5%的硼氫化鈉 溶液10 100ml，反應(yīng)1 5小時，減壓抽濾，分別以石油醚、無水乙醇洗滌，'真空干燥即得 殼聚糖微球樹脂。取殼聚糖樹脂，加入1.0 8.0mol/LNaOH溶液，使加入的環(huán)氧氯丙垸濃度 達(dá)5 40%， 40 9(TC恒溫振蕩活化樹脂2 10小時，抽慮去除環(huán)氧氯丙垸后加入胰蛋白酶，
10 4(TC偶聯(lián)10 24小時，減壓抽慮，干燥即得殼聚糖樹脂固定化胰蛋白酶。將固定化酶裝 入層析柱，以大豆乳清廢棄液上樣過柱，梯度洗脫，收集活性峰，冷凍干燥即得胰蛋白酶抑 制劑。
實例l:取殼聚糖粉末10.0g溶于2.0X的醋酸溶液中，3(TC不斷攪拌下加入司班80溶 液1.5ml，加入乙酸乙酯15ml，反應(yīng)20min;調(diào)節(jié)溫度至70。C，加入甲醛25ml，反應(yīng)30min; 調(diào)節(jié)溫度為95t:，加入戊二醛10ml并調(diào)節(jié)pH值為9. 0，反應(yīng)3小時。逐滴加入1.5%的硼 氫化鈉溶液100ml，反應(yīng)1.5小時，減壓抽濾，分別以石油醚、無水乙醇洗滌，真空干燥即 得殼聚糖微球樹脂。取10. Og殼聚糖樹脂，加入2. Oml環(huán)氧氯丙垸和6. Omol/L 30ml的NaOH 溶液，4(TC恒溫振蕩活化樹脂2小時，抽慮去除環(huán)氧氯丙烷后加入胰蛋白酶，3(TC偶聯(lián)24 小時，減壓抽慮，干燥即得殼聚糖樹脂固定化胰蛋白酶。將固定化酶裝入16mmX20cm層析柱， 以大豆乳清廢棄液上樣過柱，pH梯度洗脫，收集活性峰，冷凍干燥即得胰蛋白酶抑制劑。
實例2:取殼聚糖粉末8.0溶于1.0%的醋酸溶液中，5(TC不斷攪拌下加入司班60溶液 5.0ml，加入乙酸乙酯55ml，反應(yīng)20min;調(diào)節(jié)溫度8(TC，加入甲醛15ml，反應(yīng)30min;調(diào) 節(jié)溫度85'C，加入戊二醛50ml并調(diào)節(jié)pH值為8. 0，繼續(xù)反應(yīng)5小時。逐滴加入8.0%的硼 氫化鈉溶液80ml，反應(yīng)5小時，減壓抽濾，分別以石油醚、丙酮、水洗滌，干燥即得殼聚糖 微球樹脂。取8. Og殼聚糖樹脂，加入12. Oml環(huán)氧氯丙烷和1. Omol/L 20ml的NaOH溶液，80 'C恒溫振蕩活化樹脂10小時，抽慮去除環(huán)氧氯丙烷后加入胰蛋白酶，4(TC偶聯(lián)24小時，減 壓抽慮，干燥即得殼聚糖樹脂固定化胰蛋白酶。將固定化酶裝入45mmX20cm層析柱，以大豆 乳清廢棄液上樣過柱，離子強度梯度洗脫，收集活性峰，冷凍干燥即得胰蛋白酶抑制劑。
實例3:取殼聚糖15. 0g溶于7.0%的醋酸溶液中，2(TC不斷攪拌下加入司班40溶液 0.5ml，加入乙酸乙酯45ml，反應(yīng)50min;調(diào)節(jié)溫度5(TC，加入甲醛45ml，反應(yīng)50min;調(diào) 節(jié)溫度90°C，加入戊二醛35ml并調(diào)節(jié)pH值為7. 0，繼續(xù)反應(yīng)5小時，逐滴加入4. 0%的硼 氫化鈉溶液80ml，反應(yīng)2小時，減壓抽濾，分別以石油醚、蒸餾水洗滌，干燥即得殼聚糖微 球樹脂。取15. 0g殼聚糖樹脂，加入7. Oml環(huán)氧氯丙烷和7. Omol/L 60ml的NaOH溶液，55 'C恒溫振蕩活化樹脂7小時，抽慮去除環(huán)氧氯丙烷后加入胰蛋白酶，25'C偶聯(lián)18小時，減壓 抽慮，干燥即得殼聚糖樹脂固定化胰蛋白酶。將固定化酶裝入550mmX40cm層析柱，以大豆 乳清廢棄液上樣過柱，pH梯度洗脫，收集活性峰，冷凍干燥即得胰蛋白酶抑制劑。
權(quán)利要求
1.殼聚糖樹脂固定化酶純化大豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的特征工藝流程如下將殼聚糖溶于醋酸溶液中，控制溫度，分別加入液體石蠟、司班、乙酸乙酯、甲醛、戊二醛，調(diào)節(jié)pH，反應(yīng)3～4小時，再加入硼氫化鈉溶液，繼續(xù)反應(yīng)1～1.5小時，減壓抽濾、洗滌，真空干燥，即得殼聚糖微球樹脂。將殼聚糖樹脂置于NaOH溶液中，加入環(huán)氧氯丙烷為活化劑，活化樹脂；活化樹脂加入胰蛋白酶進(jìn)行偶聯(lián)，減壓抽濾、真空干燥，即得殼聚糖樹脂固定化胰蛋白酶。將固定化酶樹脂裝柱，以乳清廢棄液過柱，洗脫，收集活性部分冷凍干燥，得到電泳純大豆胰蛋白酶抑制劑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖樹脂固定化酶純化大豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的工藝流 程中，加入司班使其濃度為0.2 2.0%，乙酸乙酯的濃度為5.0 15.0%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖樹脂固定化酶純化大豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的工藝流 程中，加入甲醛溶液使其濃度為5 15%，戊二醛的濃度為4.0 14.0%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖樹脂固定化酶純化大豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的工藝流 程中，加入0.5~8.5%的硼氫化鈉溶液，并使其濃度為2.0 20.0%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖樹脂固定化酶純化大豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的工藝流 程中，活化樹脂時加入環(huán)氧氯丙烷使其濃度達(dá)5. 0 40. 0%。
全文摘要
本發(fā)明研究了殼聚糖樹脂固定化酶純化大豆乳清廢水中胰蛋白酶抑制劑的工藝，屬輕工、食品及環(huán)境工程領(lǐng)域。大豆乳清是工業(yè)上采用堿溶、酸沉工藝生產(chǎn)大豆蛋白的副產(chǎn)物，其中含有大量胰蛋白酶抑制劑等功能性成分。據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)大豆分離蛋白生產(chǎn)企業(yè)每年排放大豆乳清廢棄液在300萬噸以上。目前，從大豆乳清廢水中提取活性物質(zhì)研究較為成熟的是大豆低聚糖等的提取，而對于其中胰蛋白酶抑制劑的分離純化尚未受到充分重視。本發(fā)明是利用制備的多孔、立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖微球樹脂，經(jīng)活化偶聯(lián)胰蛋白酶后，親和吸附大豆乳清廢水中的胰蛋白酶抑制劑，經(jīng)洗脫可得電泳純胰蛋白酶抑制劑。該方法可高值化利用提取大豆蛋白后的廢棄物，操作簡單，成本低，易于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N11/08GK101367018SQ20071015390
公開日2009年2月18日 申請日期2007年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月13日
發(fā)明者侯仰鋒, 賓 張, 莉 張, 李海燕, 汪東風(fēng) 申請人:中國海洋大學(xué)