專利名稱:防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)物,尤其是一種能夠有效防止無血清微載體細(xì)胞培養(yǎng)過程 中,微載體易通過細(xì)胞連接出現(xiàn)聚集的培養(yǎng)物,屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)生產(chǎn)生物制品如疫苗、酶、激素、抗體是十分重要的。大多 數(shù)動(dòng)物細(xì)胞是貼壁依賴性細(xì)胞,需要貼壁后才能生長(zhǎng)和增殖。傳統(tǒng)的培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì) 胞是在培養(yǎng)皿或轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行的。隨著病毒疫苗及基因工程蛋白等生物制品需求量的增
加,發(fā)展新的系統(tǒng)并更大規(guī)模的培養(yǎng)細(xì)胞已成為一種必然。自從1967年Van Wezel發(fā) 明微載體以來,用微載體培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)不斷取得進(jìn)步,每毫升可培養(yǎng)出上億個(gè)細(xì)胞。 微載體培養(yǎng)細(xì)胞相比其他大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞方法具有很多優(yōu)點(diǎn)1.微載體可提供較大 的比表面積,通過改變微載體的使用濃度來提高單位體積培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量,以此來獲得 細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)品的高產(chǎn)量。2.細(xì)胞增殖與傳代可以只在一個(gè)高產(chǎn)容器內(nèi)進(jìn)行,而不是多個(gè) 低產(chǎn)容器,以充分利用培養(yǎng)基,達(dá)到節(jié)約培養(yǎng)基的目的。3.容易操作及控制多個(gè)細(xì)胞培 養(yǎng)條件,如pH、 P02、 pC02等。4.取樣操作簡(jiǎn)單易行。5.因?yàn)槲⑤d體顆粒容易沉降, 所以收獲細(xì)胞和下游產(chǎn)品的純化操作容易進(jìn)行。6.微載體培養(yǎng)細(xì)胞可選擇不同的規(guī)模, 容易放大培養(yǎng)規(guī)模。
用微載體大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞雖有如此多的優(yōu)點(diǎn),但仍存在下列問題l.在無血清條件 下,微載體顆粒聚集成團(tuán)現(xiàn)象較為嚴(yán)重,甚至影響了細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng);2.在低血清 條件下,細(xì)胞在微載體上的貼壁及生長(zhǎng)狀況并不理想;3.在無血清條件下,市場(chǎng)上可供 選用的微載體數(shù)目有限,而且價(jià)格大都比較昂貴。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中,培養(yǎng)基(液)是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的基本溶液,是 組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)最重要的條件。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,對(duì)各種培養(yǎng) 液的要求也越來越嚴(yán)格?,F(xiàn)在大多數(shù)人工和合成培養(yǎng)基需要加入不同濃度的血清才能培 養(yǎng)細(xì)胞。血清除了提供細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件外,還能促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成,并含有細(xì)胞 增殖所必需的生長(zhǎng)因子。但由于血清成分非常復(fù)雜,對(duì)一些要求較高的基礎(chǔ)性研究的結(jié) 果影響較大。同時(shí)血清中也含有一定的細(xì)胞毒性物質(zhì)和抑制性物質(zhì),對(duì)細(xì)胞有去分化作 用,影響細(xì)胞某些功能的表達(dá)。尤其是血清中可能帶有外源因子,如瘋牛病病毒等。在
4以細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)疫苗的過程中,血清中的某些成分會(huì)嚴(yán)重影響病毒感染細(xì)胞的效果, 如流感病毒、甲肝病毒等。因而,很多培養(yǎng)研究工作者都在研制、尋求不含血清的無血 清或無蛋白的培養(yǎng)液。目前已商品化的無血清培養(yǎng)液有Sigma公司的MCDB131,它可用 于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞,還有Bioflnids公司的LHC-9,主要用于培養(yǎng)器官上皮細(xì)胞等。
無血清和無蛋白微載體培養(yǎng)細(xì)胞則綜合了微載體培養(yǎng)細(xì)胞和無血清培養(yǎng)細(xì)胞兩者 的優(yōu)點(diǎn),表現(xiàn)出極大優(yōu)勢(shì),但實(shí)際操作過程中仍存在下列問題①無血清條件下接種細(xì) 胞后,微載體易通過細(xì)胞連接出現(xiàn)聚集成團(tuán)的現(xiàn)象, 一旦聚集成團(tuán)將影響細(xì)胞在微載體 上的均勻貼壁。②接種細(xì)胞時(shí), 一部分貼壁于微載體上的細(xì)胞不能及時(shí)伸展而凋亡。③ 在無血清條件下,微載體的聚集成團(tuán)會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。如;在用無血清微 載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞時(shí),Cytodex 1、 Cytodex 2等都會(huì)不同程度的聚集成團(tuán)。
在微載體培養(yǎng)過程中,為改善細(xì)胞的貼壁性能以及促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng),可采用下列途 徑;用膠原或明膠來包覆微載體,如Cytodex3,但價(jià)格昂貴,而且細(xì)胞貼壁也不理想, 還會(huì)產(chǎn)生弱的載體聚集。
用膠原包覆微載體后能顯著改善細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng),而且細(xì)胞容易從微載體上用酶 消化下來。目前幾種膠原包覆的微載體己商品化,如SoloHillm膠原包被微載體和法 瑪西亞的Cytodex 3。專利"膠原包覆載體的制備工藝"(US 4, 994, 388),應(yīng)用膠原 包裹核心球粒(微載體半成品)經(jīng)過了兩個(gè)步驟包裹和固定,即核心球粒先懸浮在酸 性膠原溶液(0.01-0.1N醋酸)中,再使溶液蒸發(fā)干燥。干燥的、膠原包裹的核心球粒 再懸浮在含蛋白交聯(lián)劑(如戊二醛)的溶液中,使得膠原交聯(lián)固定。在此專利中應(yīng)用的 是膠原或變性膠原,它是三條a-肽鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu),且不溶于水,只有在酸性 環(huán)境中才能溶解。
應(yīng)用明膠包覆微載體亦能顯著改善細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。在專利"包覆細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì) 的工藝"(Pub. No:WO/2004/056976)中,明膠包覆過程跟上述US 4, 994, 388專利相 似。此專利中的明膠是膠原在酸、堿、酶或高溫作用下的變性產(chǎn)物,分子量范圍是約40 kDa至200 kDa單肽鏈。
發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的無血清培養(yǎng)細(xì)胞過程中微載體易成團(tuán),從而影響細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的 不足,本發(fā)明提供一種能防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物。 本發(fā)明的難點(diǎn)在于
A、解決水解膠原蛋白包覆在微載體上的問題。B、 如何在浩瀚無比的化合物中尋找出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)既無毒性,又能有效預(yù)防細(xì)胞培 養(yǎng)過程中的微載體聚集成團(tuán),而且能促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的一種化合物。
C、 解決如何應(yīng)用水解膠原蛋白的問題 一是包覆在微載體上后使用;二是直接加 入到培養(yǎng)基中使用。
本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,包括微 載體或含微載體的培養(yǎng)基,其特征在于-
A、 將微載體按10 40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為1 20%的水解膠原蛋白溶液中 3 6小時(shí),之后加熱至80 10(TC,直至溶液蒸發(fā)干燥,得水解膠原蛋白微載體;
B、 將A歩驟所得水解膠原蛋白微載體按10 40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為0. 5 5%的蛋白交聯(lián)劑溶液中,1 4小時(shí),使水解膠原蛋白交聯(lián)固定在微載體上,干燥后得包 覆有水解膠原蛋白的微載體,按常規(guī)量配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物;或者
C、 將水化膨脹后的微載體Cytodexl,按50-100ml/g的量,放入質(zhì)量濃度為1 2 %。的水解膠原蛋白溶液中,浸泡至少4小時(shí),得包覆有水解膠原蛋白的微載體,按常規(guī) 量配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物;或者
D、 在含有濃度為1-5g /L的微載體Cytodexl培養(yǎng)基中,按1 2%。的質(zhì)量比,直 接加入水解膠原蛋白,即得培養(yǎng)物。
所述B步驟的蛋白交聯(lián)劑為戊二醛、羥甲基磷化氫、碳化二亞胺和PFP-ester中的 一種或幾種。
所述水解膠原蛋白采用分子量為400Da 19kDa的水解膠原蛋白,是小分子單肽鏈, 且易溶于水。
所述微載體為市購(gòu)的Cytodexl 、 Cytodex2或Cytodex3。 所述培養(yǎng)物通過下列具體歩驟得到
(1) 將微載體按10 40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為1 20%的水解膠原蛋白溶液 中3 6小時(shí),之后加熱至80 10(TC,直至溶液蒸發(fā)干燥,得水解膠原蛋白微載體;
(2) 將(1)步驟所得水解膠原蛋白微載體按10 40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為 0.5 5%的蛋白交聯(lián)劑溶液中1 4小時(shí),使水解膠原蛋白交聯(lián)固定在微載體上,得水解 膠原蛋白包裹的微載體;
(3) 將上述(2)步驟的水解膠原蛋白包裹的微載體加熱至80 10(TC,直至水解 膠原蛋白包裹的微載體干燥,臨用前用磷酸鹽緩沖夜(PBS)反復(fù)洗滌微載體,按常規(guī) 量配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物。所述培養(yǎng)物還通過下列具體步驟得到
(1) 將干燥的微載體,按50-100ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS
中,室溫下至少浸泡3小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,
余下的微載體按30-50ml/g的量,用新鮮的無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS換洗1 3 次,在0. 05 0. lMPa, 15 20min,,高壓蒸汽滅菌消毒,備用;
(2) 將經(jīng)過上述(1)歩驟處理的微載體,按50-100ml/g的量,放入在36. 5 37. 5 'C溫度下預(yù)熱的培養(yǎng)基即含有質(zhì)量濃度為1 2%。的水解膠原蛋白的培養(yǎng)基中,浸泡至 少4個(gè)小時(shí),并每隔15 20分鐘晃動(dòng)一次,之后待微載體沉降后,倒掉上清,將微載 體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)容器中,按常規(guī)量配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基后即得培養(yǎng)物,備用。
所述培養(yǎng)物也可通過下列具體步驟得到
(1) 將干燥微載體按50-100ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS中, 室溫下至少浸泡3小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,剩余 的微載體按30-50ml/g的量,用新鮮無鈣鎂離子磷酸鹽緩沖液PBS換洗1 3次,在 0.05 0. lMPa, 15 20min,條件下,高壓蒸汽滅菌消毒,備用;
(2) 將經(jīng)過上述(1)歩驟處理的微載體,按20-50ml/g的量,放入在36. 5 37.5 'C溫度下預(yù)熱的培養(yǎng)基中漂洗,待微載體沉降后,倒掉上清,將微載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng) 容器中,備用;
(3) 將經(jīng)過上述(2)歩驟處理的微載體,按1-5g/L的量配入常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基 中,再按1 2%。的質(zhì)量比,直接加入水解膠原蛋白,得培養(yǎng),備用。
用本發(fā)明提供的培養(yǎng)物培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),其接種細(xì)胞濃度為5Xl()4 2X105個(gè)/ml。 本發(fā)明水解膠原蛋白的用量為;每克微載體Cytodex 1用的水解膠原蛋白固體粉末 的有效量為0.1 2克,水解膠原蛋白用量減少,則貼壁及生長(zhǎng)效果不明顯;水解膠原 蛋白用量過多,則會(huì)影響滲透壓,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。用微載體Cytodex3時(shí),因其已用 膠原包被,具有比較優(yōu)良的促細(xì)胞貼壁性能,所以加入少量水解膠原蛋白,即每克微載 體加入0. 05g水解膠原蛋白,即會(huì)顯著改善微載體的成團(tuán)現(xiàn)象。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案,即在無血清微載體細(xì) 胞培養(yǎng)基中,加入包覆有水解膠原蛋白的微載體,或者在微載體細(xì)胞培養(yǎng)基中,直接加 入水解膠原蛋白后,避免了無血清或無蛋白微載體培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞過程中的微載體成 團(tuán)現(xiàn)象,最大限度地降低了因微載體成團(tuán)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成的影響,使細(xì)胞可以更好的貼 壁生長(zhǎng),且貼壁及生長(zhǎng)狀況良好,細(xì)胞密度可達(dá)5X106個(gè)/ml,適用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng),
7同時(shí)可選擇價(jià)格低廉、種類多的微載體,較大程度地降低了生產(chǎn)成本,具有節(jié)能、降耗、 增效等優(yōu)點(diǎn)。
在用微載體Cytodex 1無血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞時(shí),當(dāng)不采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)物及 制備方法時(shí),微載體成團(tuán)現(xiàn)象嚴(yán)重,細(xì)胞貼壁狀態(tài)差,1天后未貼壁細(xì)胞壞死,2天后 已貼壁細(xì)胞大多脫落壞死。而當(dāng)采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)物及制備方法時(shí),細(xì)胞的貼壁狀 態(tài)與生長(zhǎng)狀態(tài)可以達(dá)到有血清Cytodex 1培養(yǎng)條件的效果。
本發(fā)明的水解膠原蛋白有比較寬的分子量范圍,小的可為分子多肽400Da,大的可 與明膠相仿20kDa。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用小至2000Da水解膠原蛋白,大至5000Da水解膠原蛋白 都取得了明顯的無血清微載體細(xì)胞培養(yǎng)效果。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。 實(shí)施例1
(1) 將微載體按10g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為2%的水解膠原蛋白溶液中3小時(shí), 之后加熱至80 10(TC,直至溶液蒸發(fā)干燥,得水解膠原蛋白微載體;
(2) 將(1)步驟所得水解膠原蛋白微載體按10g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為0. 5% 的蛋白交聯(lián)劑溶液中4小時(shí),使水解膠原蛋白交聯(lián)固定在微載體上,得水解膠原蛋白包 裹的微載體;
(3) 將上述(2)歩驟的水解膠原蛋白包裹的微載體加熱至80 10(TC,直至水解 膠原蛋白包裹的微載體干燥,使用時(shí)用PBS反復(fù)洗滌微載體,再干燥后,按3g/L量配 入到無血清培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物;
(4) 按接種細(xì)胞濃度為5Xl()5個(gè)/ml的量,在上述培養(yǎng)物中接種細(xì)胞后,即可培 養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)過程中不會(huì)造成微載體的聚集。
實(shí)施例2
(1) 將微載體按40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為20%的水解膠原蛋白溶液中3小時(shí), 之后加熱至80 10(TC,直至溶液蒸發(fā)干燥,得水解膠原蛋白微載體;
(2) 將(1)步驟所得水解膠原蛋白微載體按40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為5% 的蛋白交聯(lián)劑溶液中l(wèi)小時(shí),使水解膠原蛋白交聯(lián)固定在微載體上,得水解膠原蛋白包 裹的微載體;
(3) 將上述(2)歩驟的水解膠原蛋白包裹的微載體加熱至80 10(TC,直至水解 膠原蛋白包裹的微載體干燥,使用時(shí)用PBS反復(fù)洗滌微載體,再干燥后,按5g/L量配入到無血清培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物;
(4)按接種細(xì)胞濃度為2X105個(gè)/ml的量,在上述培養(yǎng)物中接種細(xì)胞后,即可培 養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)過程中不會(huì)造成微載體的聚集。 實(shí)施例3
(1) 將干燥的微載體,按50ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(PBS) 中,室溫下浸泡4小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,余下 的微載體按50ml/g的量,用新鮮的無鈣鎂離子的PBS換洗2次,在0. 05MPa, 15min,高 壓蒸汽滅菌消毒,備用;
(2) 將經(jīng)過上述(1)步驟處理的微載體,按50ml/g的量,放入在36.5。C溫度下 預(yù)熱的培養(yǎng)基即含有質(zhì)量濃度為1%。的水解膠原蛋白的培養(yǎng)基中,浸泡至少4個(gè)小時(shí), 并每隔20分鐘晃動(dòng)一次,之后待微載體沉降后,倒掉上清,將微載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng) 容器中,按3g/升量配入到無血清培養(yǎng)基中,備用;
(4)按接種細(xì)胞濃度為5Xl()5個(gè)/ml的量,在上述培養(yǎng)物中接種細(xì)胞后,即可培 養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)過程中不會(huì)造成微載體的聚集,細(xì)胞密度可達(dá)到5X106個(gè)/ml。 實(shí)施例4
(1) 將干燥的微載體,按100ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS 中,室溫下浸泡3小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,余下 的微載體按50ml/g的量,用新鮮的無鈣鎂離子的PBS換洗2次,在0. lMPa, 20min,高 壓蒸汽滅菌消毒,備用;
(2) 將經(jīng)過上述(1)歩驟處理的微載體,按50-100ml/g的量,放入在37.5。C溫 度下預(yù)熱的培養(yǎng)基即含有質(zhì)量濃度為2%。的水解膠原蛋白的培養(yǎng)基中,浸泡至少4個(gè) 小時(shí),并每隔15分鐘晃動(dòng)一次,之后待微載體沉降后,倒掉上清,將微載體轉(zhuǎn)移到細(xì) 胞培養(yǎng)容器中,按5g/升量配入到無血清培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物,備用;
(3) 按接種細(xì)胞濃度為3X105個(gè)/ml的量,在上述培養(yǎng)物中接種細(xì)胞后,即可培 養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)過程中不會(huì)造成微載體的聚集,細(xì)胞密度可達(dá)到4X106個(gè)/ml。
實(shí)施例5
(1)將干燥微載體按50ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS中,室 溫下浸泡3 4小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,剩余的 微載體按30ml/g的量,用新鮮無鈣鎂離子PBS換洗3次,在0. 08MPa, 180min,高壓蒸 汽滅菌消毒,備用;(2) 將經(jīng)過上述(1)步驟處理的微載體,按20ml/g的量,放入在36.5。C溫度下 預(yù)熱的培養(yǎng)基中漂洗,待微載體沉降后,倒掉上清,將微載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)容器中, 備用;
(3) 將經(jīng)過上述(2)步驟處理的微載體,按lg/L的量配入常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 再按1%。的質(zhì)量比,直接加入水解膠原蛋白,得培養(yǎng),備用;
(4) 按接種細(xì)胞濃度為5X105個(gè)/ml的量,在上述培養(yǎng)物中接種細(xì)胞后,即可培 養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)過程中不會(huì)造成微載體的聚集,細(xì)胞密度可達(dá)到2Xl(f個(gè)/ml。
實(shí)施例6
(1) 將干燥微載體按100ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的液PBS中,室溫下浸泡5 小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,剩余的微載體按50ml/g 的量,用新鮮無鈣鎂離子磷酸鹽緩沖液PBS換洗3次,在0. 08MPa, 17min,高壓蒸汽滅 菌消毒,備用;
(2) 將經(jīng)過上述(1)歩驟處理的微載體,按50ml/g的量,放入在37.5。C溫度下 預(yù)熱的培養(yǎng)基中漂洗,待微載體沉降后,倒掉上清,將微載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)容器中, 備用;
(3) 將經(jīng)過上述(2)步驟處理的微載體,按5g/L的量配入常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 再按2%。的質(zhì)量比,直接加入水解膠原蛋白,得培養(yǎng),備用;
(4) 按接種細(xì)胞濃度為2X105個(gè)/ml的量,在上述培養(yǎng)物中接種細(xì)胞后,即可培 養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)過程中不會(huì)造成微載體的聚集,細(xì)胞密度可達(dá)到4X106個(gè)/ml。
實(shí)施例7
攪拌瓶無血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞 第一步微載體的準(zhǔn)備
稱取0. 3克干燥微載體Cytodex 1浸泡在30ml無鈣鎂離子的PBS中充分膨脹、水 化,室溫下至少3小時(shí)。倒掉浮在溶液表面的微載體,剩余微載體換洗15ml新鮮無f丐 鎂離子PBS,繼續(xù)用15ml新鮮無鈣鎂離子的PBS,換掉舊PBS,后以115。C, 15min條件 高壓蒸汽滅菌消毒。
用之前,待水化好的微載體沉降后,輕輕倒掉上清。用15ml暖培養(yǎng)基漂洗一下微 載體。待微載體沉降后,倒掉上清,將微載體轉(zhuǎn)移到100ml攪拌瓶中備用。
第二步細(xì)胞培養(yǎng)
接上歩,攪拌瓶中的0.3克微載體浸泡于40ml無血清培養(yǎng)基(來源于SAFC,其中
10再添加1%。膠原蛋白)中。種入107個(gè)Vero細(xì)胞,輕輕混勻(37°C)。細(xì)胞貼壁吸附過 程以30轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌。2小時(shí)后,將細(xì)胞培養(yǎng)體積擴(kuò)大到100ml,攪拌速度改為 40轉(zhuǎn)/分鐘,正常培養(yǎng)細(xì)胞。每隔兩天換一次培養(yǎng)基。
細(xì)胞吸附過程中微載體有聚集成團(tuán)現(xiàn)象,1.5小時(shí)后聚集現(xiàn)象消失,微載體呈現(xiàn)單 顆粒分散狀態(tài),此時(shí)取樣觀察知絕大部分細(xì)胞已貼附于微載體上。在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中, 取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞密度可達(dá)2Xl(T個(gè)/ml。
實(shí)施例8
發(fā)酵罐無血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞和流感病毒 第一步微載體的準(zhǔn)備
稱取4. 5克干燥微載體Cytodex 1浸泡在450ml無鈣鎂離子的PBS中充分膨脹、水 化,室溫下至少3小時(shí)。倒掉浮在溶液表面的微載體,剩余微載體換洗200ml新鮮無銬 鎂離子PBS,繼續(xù)用200ml新鮮無鈣鎂離子的PBS換掉舊PBS,再以115°C, 15min條件 高壓蒸汽滅菌消毒。
用之前,待水化好的微載體沉降后,倒掉上清。用400ml暖培養(yǎng)基(含2%。膠原蛋 白)浸泡微載體至少4個(gè)小時(shí),每隔20分鐘晃動(dòng)一下。4小時(shí)后待微載體沉降,倒掉上 清,將微載體轉(zhuǎn)移到2L的Sartorius發(fā)酵罐中備用。
第二步接種細(xì)胞
接上步,發(fā)酵罐中的4.5克微載體浸泡于600ml無血清培養(yǎng)基(來源于Hyclone) 中。種入2X108個(gè)Vero細(xì)胞,以30轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌(37°C)使細(xì)胞貼壁。2小時(shí) 后,將細(xì)胞培養(yǎng)體積擴(kuò)大到2L,攪拌速度改為50轉(zhuǎn)/分鐘,控制細(xì)胞培養(yǎng)溫度、pH、溶 氧等條件,正常培養(yǎng)細(xì)胞。每隔兩天換一次培養(yǎng)基。
細(xì)胞吸附過程中微載體無聚集現(xiàn)象,微載體呈現(xiàn)單顆粒分散狀態(tài),此時(shí)取樣可觀察 到絕大部分細(xì)胞已貼附于微載體上。在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中,取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
第三步病毒培養(yǎng)
取樣觀察知90%微載體己長(zhǎng)滿細(xì)胞,細(xì)胞密度約K)6個(gè)/ml時(shí)準(zhǔn)備接種病毒。停止攪 拌,待微載體沉降后,抽棄上清液至細(xì)胞培養(yǎng)體積400ml,加入效價(jià)384的流感病毒H1N1 病毒液2ml, 30轉(zhuǎn)/分鐘的低攪拌速度攪拌2小時(shí)(37°C),使病毒吸附于細(xì)胞,再加入 病毒維持液至2L,增大攪拌速度至50轉(zhuǎn)/分鐘,控制培養(yǎng)溫度、pH、溶氧等條件培養(yǎng)病 毒。兩天后補(bǔ)加TPCK胰酶IO毫升。
第四步收獲病毒約3-4天,取樣觀察細(xì)胞是否病變。停止攪拌,待微載體沉降后,吸取上清液(勿 丟棄,其中亦含病毒),加入流感病毒收獲液50ml,增大攪拌速度為90轉(zhuǎn)/分鐘,攪拌 20分鐘使細(xì)胞脫落,靜置,收集細(xì)胞懸液,再重復(fù)操作兩次,將細(xì)胞收集完全,反復(fù)凍 融3次,合并病毒培養(yǎng)上清,測(cè)得其血凝效價(jià)為l: 1024。
權(quán)利要求
1、一種防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,包括微載體或含微載體的培養(yǎng)基,其特征在于A、將微載體按10~40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為1~20%的水解膠原蛋白溶液中3~6小時(shí),之后加熱至80~100℃,直至溶液蒸發(fā)干燥,得水解膠原蛋白微載體;B、將A步驟所得水解膠原蛋白微載體按10~40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為0.5~5%的蛋白交聯(lián)劑溶液中,1~4小時(shí),使水解膠原蛋白交聯(lián)固定在微載體上,干燥后得包覆有水解膠原蛋白的微載體,按常規(guī)量配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物;或者C、將水化膨脹后的微載體,按50-100ml/g的量,放入質(zhì)量濃度為1~2‰的水解膠原蛋白溶液中,浸泡至少4小時(shí),得包覆有水解膠原蛋白的微載體,按常規(guī)量配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物;或者D、在含有濃度為1-5g/L的微載體Cytodex1培養(yǎng)基中,按1~2‰的質(zhì)量比,直接加入水解膠原蛋白,即得培養(yǎng)物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,其特征在于所述B 步驟的蛋白交聯(lián)劑為戊二醛、羥甲基磷化氫、碳化二亞胺和PFP-ester中的一種或幾種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,其特征在于所述 水解膠原蛋白采用分子量為400Da 19kDa的水解膠原蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,其特征在于所述 微載體為市購(gòu)的Cytodexl 、 Cytodex2或Cytodex3。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,其特征在于所述 培養(yǎng)物經(jīng)過下列步驟(1) 將微載體按10 40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為1 20%的水解膠原蛋白溶液 中3 6小時(shí),之后加熱至80 100'C,直至溶液蒸發(fā)干燥,得水解膠原蛋白微載體;(2) 將(1)步驟所得水解膠原蛋白微載體按10 40g/L的量,懸浮在質(zhì)量濃度為 0.5 5%的蛋白交聯(lián)劑溶液中1 4小時(shí),使水解膠原蛋白交聯(lián)固定在微載體上,得水解 膠原蛋白包裹的微載體;(3) 將上述(2)步驟的水解膠原蛋白包裹的微載體加熱至80 10(TC,直至水解 膠原蛋白包裹的微載體干燥,之后用水反復(fù)洗滌微載體,再干燥后,按常規(guī)量配入常規(guī) 細(xì)胞培養(yǎng)基中,即得培養(yǎng)物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,其特征在于所述培 養(yǎng)物經(jīng)過下列步驟(l)將干燥的微載體,按50-100ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS中,室溫下至少浸泡3小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,余下的微載體按30-50ml/g的量,用新鮮的無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS換洗1 3 次,在0. 05 0. lMPa, 15 20min,,高壓蒸汽滅菌消毒,備用;(2)將經(jīng)過上述(1)步驟處理的微載體,按50-100ml/g的量,放入在36.5 37.5 'C溫度下預(yù)熱的培養(yǎng)基即含有質(zhì)量濃度為1 2%。的水解膠原蛋白的培養(yǎng)基中,浸泡至 少4個(gè)小時(shí),并每隔15 20分鐘晃動(dòng)一次,之后待微載體沉降后,倒掉上清,將微載 體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)容器中,按常規(guī)量配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基后即得培養(yǎng)物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,其特征在于所述培 養(yǎng)物經(jīng)過下列步驟(1) 將干燥微載體按50-100ml/g的量,浸泡在無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液PBS中, 室溫下至少浸泡3小時(shí),使微載體充分膨脹、水化;倒掉浮在溶液表面的微載體,剩余 的微載體按30-50ml/g的量,用新鮮無鈣鎂離子磷酸鹽緩沖液PBS換洗1 3次,在 0. 05 0. lMPa, 15 20min,條件下,高壓蒸汽滅菌消毒,備用;(2) 將經(jīng)過上述(1)步驟處理的微載體,按20-50ml/g的量,放入在36.5 37.5 'C溫度下預(yù)熱的培養(yǎng)基中漂洗,待微載體沉降后,倒掉上清,將微載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng) 容器中,備用;(3) 將經(jīng)過上述(2)步驟處理的微載體,按l-5g/L的量配入常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基 中,再按1 2%。的質(zhì)量比,直接加入水解膠原蛋白,得培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種防止無血清微載體細(xì)胞聚集的培養(yǎng)物,包括微載體或含微載體的培養(yǎng)基,其特征在于在微載體上包覆水解膠原蛋白,在按常規(guī)時(shí)配入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基,或者在含微載體的培養(yǎng)基中直接加入水解膠原蛋白。使用本發(fā)明的培養(yǎng)物在微載體培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的過程中,具有下列優(yōu)點(diǎn)①在無血清和無蛋白培養(yǎng)條件下,能防止Ctodex1等微載體的聚集,促進(jìn)細(xì)胞的貼壁、伸展和生長(zhǎng)。②擴(kuò)大了在無血清培養(yǎng)下微載體的品種使用范圍,可以使用價(jià)格低廉的微載體培養(yǎng)細(xì)胞,達(dá)到科研及生產(chǎn)的要求。③降低生產(chǎn)成本,使微載體無血清或無蛋白大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)用于以細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)及其它生物制品的生產(chǎn)中。④在低血清及正常血清微載體培養(yǎng)細(xì)胞過程中,添加此成分可防止微載體弱聚集,促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101440358SQ200810189918
公開日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者健 周, 姜述德, 孫明波, 廖國(guó)陽, 張新文, 張英偉, 李衛(wèi)東, 瑋 蔡, 磊 馬, 高菁霞 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所