專利名稱：：一種耐熱木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種耐熱木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木聚糖酶可廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、能源、造紙、紡織等行業(yè)。例如，在釀造工業(yè)中，木聚糖酶可以分解原材料中的(3-木聚糖，降低釀造過程中物料的粘度，促進有效物質(zhì)的釋放；在詞料工業(yè)中，木聚糖酶可以通過降解木聚糖，降低飼料用糧中的非淀粉多糖的量，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。木聚糖酶中的內(nèi)切木聚糖酶(1，4-p-D-xylanohydrolase:EC3.2.1.8)，主要隨機水解木聚糖主鏈上的(5-l，4-木糖苷鍵，其特殊作用決定了它是木聚糖復(fù)雜酶解過程中的關(guān)鍵酶。應(yīng)用木聚糖酶的許多工業(yè)中，常需要高溫條件，這就需要木聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性，但是一般情況下酶在遇到高溫時，其活性往往會降低甚至完全失去。工業(yè)所需的苛刻條件和酶穩(wěn)定性之間的矛盾，制約著木聚糖酶技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，因此，亟待需要一種耐熱的木聚糖酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種耐熱的木聚糖酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的木聚糖酶，來源于嗜熱擬青霉(尸seciJo/^cesWe/7ff叩^7a)J18，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由226個氨基酸組成，分子量約為24.599Xl(y!kDa。為了使(a)中的木聚糖酶便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>Poly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYK腦DKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述(a)和(b)中的木聚糖酶可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。(b)中的木聚糖酶的編碼基因可通過將序列表中序列1的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述木聚糖酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述編碼基因可為如下l)、2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述木聚糖酶的DNA分子；3)與l)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且編碼所述木聚糖酶的DNA分子。上述嚴(yán)格條件是，在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。實驗證明，本發(fā)明的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為75°C，在溫度不高于60'C條件下處理30min幾乎沒有酶活損失，80卩時保溫30min后還能殘留60%的活力；其最適pH值為7.0;用本發(fā)明酶水解木聚糖的主要產(chǎn)物為木二糖和木三糖。本發(fā)明的木聚糖酶具有耐熱特性，可廣泛用于分解半纖維素中的木聚糖，生產(chǎn)功能性低聚糖，適合于對溫度要求高的很多工業(yè)環(huán)境，具有在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的巨大潛力。圖1為本發(fā)明的耐熱木聚糖酶基因PCR和回收產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為本發(fā)明的耐熱木聚糖酶的純化過程圖。圖3為本發(fā)明的耐熱木聚糖酶的最適pH。圖4為本發(fā)明的耐熱木聚糖酶的最適溫度。圖5為本發(fā)明的耐熱木聚糖酶水解櫸木木聚糖的水解產(chǎn)物TLC圖。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，如《分子克隆4實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的方法。實施例1、木聚糖酶的編碼基因"t^的分離以嗜熱擬青霉(尸seci7o/^cesz^e/7^/7力W3)J18(中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，保藏號為AS3.6885)(Yang,SQ，Yan,QJ,Jiang,ZQ，Li，LT，Tian，HM，Wang，YZ.High-levelofxylanaseproductionbythethermophilic尸3eci2o,cest^e277(9//j73J18onwheatstrawinsolid—statefermentation.BioresourTechnol，2006;97:1794-1800)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué))的cDNA序列為模板，用如下引物進行PCR擴增PT-XynA-HFWD(正向):5，—CCATGGTGATCGGTATTACCTCC-3，(含有vVcoI酶切位點)，PT-XynA-歷V70TII-His-REV(反向)5，-AAGCTTGCCGACGTCAGCGACGGTGAT-3，(含有酶切位點)。PCR擴增反應(yīng)混合物為:水，14.810XExTaqbuffer,2pi;2.5mraol/LdNTP，1jxl;100pmol/LPT-XynA-#coI-FTO，0.5pi;100pmol/LPT-XynA-歷/2oTI1-His-REV，0.5pi;模板，1pi;Taq酶，0.2^1;反應(yīng)混合物總體積為20pl。PCR擴增反應(yīng)的條件為94°C5min;94°C30s，65°C30s和72°C1rain，30個循環(huán)后72。C延伸10min，然后冷卻至4°C。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外下照射，切下目標(biāo)DNA片段，然后采用QIAquickGelExtrationKit(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，再進行電泳檢測。結(jié)果如圖l所示(M為DNA分子MarkerDL2000,1為木聚糖酶基因的PCR擴增產(chǎn)物，2為用試劑盒回收的基因片段)，結(jié)果表明，木聚糖酶基因的PCR擴增產(chǎn)物的長度大小為700bp左右；用試劑盒回收的該基因片段，條帶單一且濃度適當(dāng)，可以用于接下來的連接實驗。采用拓撲TA克隆將上述純化得到的基因片段克隆到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化，用菌落PCR和提取質(zhì)粒雙酶切方法篩選帶有重組子的菌落。用pMD-18T質(zhì)粒載體上的標(biāo)準(zhǔn)引物序列作為測序引物，測插入基因的DNA序列。結(jié)果表明，插入的上述純化得到的木聚糖酶基因(xjtl4)的全長為681bp(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，編碼226個氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列2所示)，編碼的蛋白(xynA)的分子量約為24.599X103kDa。將含有序列表中序列1所示木聚糖酶基因的陽性重組質(zhì)粒命名為pMD-18TAf，A將核苷酸序列如序列表中序列1所示的基因序列在Genbank中進行比對，比對結(jié)果表明，本發(fā)明木聚糖酶基因與來源于7Xe_nzw/^c"7a/w&;70^AS的木聚糖酶(No.U35436)編碼基因序列同源性最高(91%)，與其余來源的木聚糖酶編碼基因的同源性低于75%。在設(shè)計上述引物對PT-XynA-#coI-FWD/PT-XynA-His-REV時，引物上引入了能插入pET-28a(+)質(zhì)粒的Tfeol-酶切位點；在設(shè)計PT-XynA-^coI-FWD正向引物時，考慮到在表達載體中C-末端帶有6XHis標(biāo)簽，在5'端由引物導(dǎo)入一個密碼子突變，即ATGA承TG…一ATGG承TG…，這樣翻譯后從酶切位點第二個氨基酸由M變?yōu)閂;根據(jù)引物設(shè)計的這一突變確保了目的基因克隆于開放閱讀框內(nèi)，同時具有ATG起始密碼子和6XHis標(biāo)簽，而不會發(fā)生開放閱讀框漂移。實施例2、木聚糖酶xynA的表達及性質(zhì)檢測在本實施例中所使用的表達載體為pET-28a(+)(Novagen公司)，靶基因克隆于pET-28a(+)載體上，使其表達置于T7噬菌體強啟動子轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制之下。由于大腸桿菌胞內(nèi)蛋白多，設(shè)計使^7^基因的3'末端帶有6XHis標(biāo)簽，這樣表達出的目標(biāo)蛋白質(zhì)帶有6XHistag，利用6XHistag與Ni-NTA的親和性，可將表達出的重組蛋白進行親和層析提純，這樣可方便快速地純化表達的酶。一、木聚糖酶基因XJ77J的亞克隆將上述pMD-18T/xynA質(zhì)粒，用一對限制性內(nèi)切酶辰ot和歷/7oHI酶切，電泳，在紫外下照射，迅速切下目標(biāo)DNA，然后采用QIAquickGelExtrationKit(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段；用限制性內(nèi)切酶和酶切pET-28a(+)載體(Novagen公司)，將酶切回收的DNA片段和pET-28a(+)載體混合，并加入T4DNALigase(TaKaRa)，在16。C下連接4h，然后用熱激法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞￡BL21(Novagen公司)，將100pl菌液涂在含卡那霉素抗性的LB平板上，37。C培養(yǎng)過夜，將生長出的單菌落標(biāo)號，采用菌落PCR法篩選帶重組質(zhì)粒的菌落。提取陽性菌落的重組質(zhì)粒，進行雙酶切電泳和DNA序列測定。測序結(jié)果表明，測定的重組xy/^基因序列由722對堿基組成(其核苷酸序列如序列表中序列3所示)[該序列是在序列表中序列1所示序列的基礎(chǔ)上有以下變化在起始位置加上兩個堿基CC，后面接上ATG(起始密碼子)，再接GTG，中間與序列表中序列1的相同，終止密碼子前加入AAGCTT(歷'7oni酶切位點)，以及GCGGCCGCACTCGAG(pET-28載體上的序列)和六個組氨酸CACCACCACCACCACCAC)]，編碼239個氨基酸(序列表中序6列4所示)(起始位置由于加入AfcoI酶切位點，第二個氨基酸由M變?yōu)閂，終止密碼子前加入的氨基酸為KLAAALEHHHHHH)，計算分子量約為26kDa。將獲得的含有上述722bp核苷酸序列的陽性重組質(zhì)粒命名為pET28a/xynA，將含有pET28a/xynA的菌命名為BL21-xynA。將得到的含有239個氨基酸殘基的氨基酸序列，與已知木聚糖酶蛋白質(zhì)氨基酸進行同源比對，結(jié)果表明，該序列與來源于7Xe，o/^ces7朋收i/oms的XynA(No.AAB94633)同源性最高，達到93%，與來源于尸aec^o/^ces的木聚糖酶(No.P81536)同源性次之，為88%，與其它木聚糖酶的同源性小于73%。通過以上基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列的同源比較，得出來源于嗜熱擬青霉J18的XynA蛋白屬于F/11族木聚糖酶，并且只含有一個單一功能區(qū)。二、木聚糖酶的表達(一)酶的表達取100|il含有重組質(zhì)粒pET28a/xynA的大腸桿菌BL21-xynA，于100mlLB(含50ng/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)12-16h;再以10%的接種量轉(zhuǎn)接到100mlLB(含50嗎/ml卡那霉素)培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液0D6。。m達到0.5-0.6時，加入IPTG至終濃度1咖ol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)10-20h后，離心收集細胞，再用超聲波破碎儀破碎細菌細胞，離心收集上清即為粗酶液。(二)酶的純化1、Ni-NTA純化用平衡緩沖液(50mmol/L，pH8.0，磷酸緩沖液，0.3mol/LNaCl，20raraol/L咪唑)平衡Ni-NTA(1X5cm);將上述粗酶液以0.1ml/min的速度過平衡好的Ni柱，上樣結(jié)束后封柱子lh;用相同緩沖液以1.0ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它雜質(zhì)；接著用45mmol/L咪唑洗至基線，有少量目標(biāo)蛋白被洗下來，但從電泳圖觀察以雜蛋白為主，未收集；用45mmol/L的咪唑溶液為起始液，以175mmol/L的咪唑溶液為終止液，進行線性梯度洗脫，洗脫速度為1ml/min，咪唑的濃度變化速度為1.3mmol/L/min，收集梯度洗脫的各管樣品；待洗脫峰趨于平緩后用0.5niol/L的咪唑溶液洗脫吸附的雜質(zhì)，最后用平衡緩沖液平衡柱料。對上述收集的每管樣品分別進行電泳，由于已知目標(biāo)蛋白的理論分子量，通過與低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比較，即判斷目標(biāo)蛋白在哪些管中存在，保留電泳圖上含有目標(biāo)蛋白的純度類似的各管。重復(fù)三次上述親和純化，將每次保存的各管樣品超濾到0.8ml。2、S印hadexG50過濾將上述步驟1得到的各管0.8ml樣品分別進行如下實驗。用50mmol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液平衡S印hadexG50，將步驟1中的0.8ml樣品上樣于柱中，用50腿ol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液，以0.1ml/min的流速進行洗脫，收集洗脫下來的液體。為確定蛋白含量，測定洗脫下來的溶液的0D28。值(蛋白質(zhì)分子中色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在280nm，蛋白質(zhì)OD，值與其濃度成正比，故可測定蛋白質(zhì)的含量)，并將峰值附近各管電泳，通過電泳確定純的目標(biāo)蛋白在哪些管中。將粗酶液、Ni-NTA層析得到的酶液、經(jīng)S印hadexG50凝膠過濾得到的酶液，分別進行電泳，電泳結(jié)果如圖2所示(M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；l為粗酶液；2為過Ni-NTA層析得到的酶液；3為經(jīng)S印hadexG50凝膠過濾得到的酶液)。結(jié)果表明，得到的蛋白與預(yù)期蛋白的分子量相符(26kDa)。將得到的蛋白的N端測15個氨基酸(Edman化學(xué)降解)，C端也測15個氨基酸(串聯(lián)質(zhì)譜法)，結(jié)果表明，測得的序列正確，證明得到的蛋白正確。SDS-PAGE方法按照Laemmli方法，如文獻(LaemraliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,1970，277:680-685)中所述進行。分離膠12.5%，濃縮膠4.5%，考馬斯亮藍染色顯示蛋白帶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白與樣品在同一條件下電泳。(三)酶活的測定1、酶活測定方法參照文獻(Bailey，MJ，Biely，P，Poutanen，K.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J"Biotechnol1992;23:257-70.)中所述的方法。具體步驟如下向0.9ml含有樺木木聚糖的、pH值為6.5、50mmol/L的MOPS緩沖液(樺木木聚糖在緩沖液中的終濃度為1g/100ml)中，加入O.lml步驟(一)得到的粗酶液(或0.1ml步驟(二)Ni-NTA層析得到的酶液，或0.1ml步驟(二)S印hadexG50凝膠過濾得到的酶液)，50。C反應(yīng)10rain,采用DNS法(Miller,GL.Useofdinitro-salicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.AnalChem1959，31:426-428.)測定產(chǎn)生的還原糖量，同時以D-木糖作標(biāo)準(zhǔn)。8酶活力單位(U)定義為上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生l)Limol相當(dāng)于D-木糖的還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位。2、蛋白含量的測定方法采用Lowry法，如文獻(Lowryetal.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.J"BiolChem，1951,193:265-275)中所述，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照如上方法檢測粗酶液、Ni-NTA層析得到的酶液、經(jīng)S印hadexG50凝膠過濾得到的酶液中酶蛋白的量、酶比活，計算回收率和純化倍數(shù)。其中，回收率=各步驟總酶活/粗酶總酶活，純化倍數(shù)=各步驟比活/粗酶比活。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如表2所示。表2、耐高溫木聚糖酶A的純化表不同步驟的酶液總體積(ml)酶液中酶活(U/ml)總蛋白(mg)總酶活(u)比酶活(U/mg)回收率(%)純化倍數(shù)粗酶液48173.2566.28315.514.71001Ni-NTA層析得到的酶液41147.311.14589.4413.555.228.1S印hadexG50層析得到的酶液2.51440.55.13601.2706.143.348.0蛋白含量以Lowry法測定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)。b酶活在50。C條件下測定，底物為1g/100ml樺木木聚糖，緩沖液為50mraol/LpH6.5M0PS。三、木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)將上述經(jīng)S印hadexG50凝膠過濾得到的酶蛋白分別進行下列性質(zhì)檢測。(一)最適反應(yīng)pH值的測定將上述經(jīng)S印hadexG50凝膠過濾得到的酶蛋白，分別置于下述不同緩沖體系中，在50'C條件下，測定其活力。測酶活的方法除了所用的緩沖體系不同外，其余均與步驟二中所述的酶活測定方法相同。選擇的pH值范圍及體系如下(50mmol/L):擰檬酸-檸檬酸三鈉pH2.5-4.5;乙酸-乙酸鈉pH4-5.5;M0PS(3-嗎啉丙磺酸)pH,6-8;Tris-HClpH7-9;CHES9(2-環(huán)己胺基乙磺酸)pH8-10;CAPS(3-(環(huán)已胺)-1-丙磺酸)pH9-11。通過比較這些緩沖體系下純酶活力差異，得出酶反應(yīng)的最適pH值。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖3所示(其中，"命"為檸檬酸-檸檬酸三鈉，"■"為乙酸-乙酸鈉，"A"為M0PS，"X"為Tris-HCl，"口"為CHES，"+，，為CAPS)。相對酶活的定義為不同pH下的酶活與最大酶活的百分比。將pH值為7.0(Tris-HC1)、50'C條件下，反應(yīng)10min的酶活記作100%。結(jié)果表明，本發(fā)明酶的最適pH值為7.0(圖3)。(二)最適反應(yīng)溫度的測定測定在pH值為7.0、不同溫度下(即30，40，50，60，70，75，80，85，90和IOO°C)酶的活力，比較得到酶的最適反應(yīng)溫度。其中，除了溫度不同、pH值不同，其余測酶活的方法均與步驟二中所述的酶活測定方法相同。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖4所示。相對酶活的定義為不同溫度下的酶活與最大酶活的百分比。將pH值為7.0(Tris-HC1)、75'C條件下，反應(yīng)10min的酶活記作100%。結(jié)果表明，本發(fā)明酶的最適溫度為75。C。(三)pH值及溫度穩(wěn)定性對酶在50'C的條件下對pH穩(wěn)定性進行測定，表明，該酶在pH6.5-10.5范圍內(nèi)能保持85%以上的酶活；將經(jīng)SephadexG50凝膠過濾得到的酶蛋白在不同溫度下保溫30min;保溫后，再于5(TC、pH值為7.0(Tris-HCl)條件下測定殘余酶活力，除了pH值不同，其余測酶活的方法均與步驟二中所述的酶活測定方法相同。結(jié)果表明，該酶在溫度不高于60。C條件下處理30min后幾乎沒有酶活損失，80。C時保溫30min后殘留60%的活力，因此，該酶具有良好的溫度穩(wěn)定性。實施例3、木聚糖酶的應(yīng)用以含有櫸木木聚糖或樺木木聚糖的、50mM、pH值為7.0的Tris-HCl緩沖液做底物(其中，櫸木或樺木木聚糖在溶液中的終濃度為2g/100ml)，酶添加量為4U/ml底物溶液，于50'C水浴中保溫12h，在不同時間(15min，30min，1h，2h，4h，6h，12h)取樣進行TLC分析。TLC條件硅膠板(60F254，E.Merk，德國)在2:1:1的正丁醇-乙酸-水系統(tǒng)中展層2次后，在其表面均勻噴灑5%硫酸甲醇溶液，吹干在IOO'C顯色。標(biāo)準(zhǔn)為木寡糖混合物。TLC結(jié)果表明，該酶水解櫸木木聚糖終產(chǎn)物以木二糖和木三糖為主(圖5，A為木糖，B為木二糖，C為木三糖，D為木四糖，E為木五糖)，水解樺木木聚糖也以木二糖和木三糖為主，因此該酶可用于水解半纖維素生產(chǎn)低聚木糖。序列表<160〉4<210〉1<211>681〈212>DNA<213〉擬青霉屬嗜熱擬青霉(尸sed7o歷/cesz^e/wop/^^g)<400〉1atgatgatcgttcccgacagtggcacgatg3acctggsagaagggttggs3tcgttgagsgsgtgcgscggacggcstccaccgtccsg3gaccactsctsccgtcgctggtattacctcggaatactacgct3ttactsgcggcaccta3ccctggsctgttscctcgcacttcggcscgtsgc3cct3as3ctttcg3cgggctgccaaccsgatcgt3cgtcggct3ctttgctctcggagctcgaactcctggtggcgagattagcgaacgcaaggggtttacggtctscgstccctcgactcggcccagtactggcttcgacgcctgcgacggaggcggcattggaagcgacsgaagtgacggtgtggggcgatggccsttcscttggacccgcatcctcggatg3sgagcactctcggtccgcctgggctcgcgggctacttcaccgctactggCC3CCCCt33gagcccaggcgcggtaacctttgscggtgt3cccgctcgtccaccgacctgttacaacgcagaacaagcgctggtttgaagcagcggctaggccctggccctcggaaggcC3cgt3C3cccgtcggcggattsccagccccgagtactacgggtaccgtg3cct3gcstcctccagcggccgttaacggttgctcgcatc6816012018024030036042048054060〇660〈210〉2〈211〉226〈212〉Pro〈213〉擬青霉屬嗜熱擬青霉(/^ecW，/ces^e/m^^7a)<400〉2MetMetlieGlylieThrSerPheAlaLeuAlaAlaLeuAlaAlaThr151015GlyAlaLeuAlaPheProThrGlyAsnThrThrGluLeuGluLysArg202530GinThrThrProAsnSerGluGlyTrpHisAspGlyTyrTyrTyrSer354045TrpTrpSerAspGlyGlyAlaGinAlaThrTyrThrAsnLeuGluGly505560GlyThrTyrGlulieSerTrpGlyAspGlyGlyAsnLeuValGlyGly65707580LysGlyTrpAsnProGlyLeuAsnAlaArgAlalieHisPheAspGly12859095ValTyrGinProAsnGlyAsnSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpThr100105110ArgAsnProLeuValGluTyrTyrlieValGluAsnPheGlyThrTyr115120125AspProSerSerAspAlaThrAspLeuGlyThrValGluCysAspGly130135140SerThrTyrArgLeuGlyLysSerThrArgTyrAsnAlaProSerlie145150155160AspGlylieGinThrPheAspGinTyrTrpSerValArgGinAsnLys165170175ArgSerSerGlyThrValGinThrGlyCysHisPheAspAlaTrpAla180185190ArgAlaGlyLeuAsnValAsnGlyAspHisTyrTyrGinlieValAla195200205ThrGluGlyTyrPheSerSerGlyTyrAlaArglieThrValAlaAsp210215220ValGly225<210〉3<211〉722<212〉DNA<220〉<223>〈400>3ccatggtgatccttcccgscccascctggagaasgggttgcca3cggc333C3tcgttgatggagtgcgatcg3cggcstgcaccgtccagtgaccactatcsccgtcgccggtattsccagggaatacttggct3ttscaggcggcaccgaaccctggacsgttacctcgaacttcggccggtagcacccca33ctttcgacgggctgcctsccsgstctgscgtcggctcctttgctcacggagctcgtactcctggttacgagattactgaacgcaagcggtttacg3cct3cgstctatcgactcggaccagtactcacttcgacggttgcgacggaagcttgcggtcgcggcattggsgtgscgggctggggcgagggccattcagttggacccgcctcctcggsgcaagagcacggtcggtccgcctgggctcgsgggctscttccgcactcg3ggccgctactgsccsccccttggagcccagtggcggtaacctttgscggtC33cccgctctgccaccgactcgttsca3Cccaga3C33gcgctggtttgcsgcagcggcgcscc3cc3cggggccctgg60120gccacgtacs180ctcgtcggcg240gtttaccagc300gtcgsgtact360ctgggtaccg420gcacctagca480cgctccagcg540600tatgctcgca660C3CC3CC3Ct720722〈210〉4<211〉239<212>Pro<220><223〉<400>4MetVallieGlylieThrSerPheAlaLeuAlaAlaLeuAlaAlaThr151015GlyAlaLeuAlaPheProThrGlyAsnThrThrGluLeuGluLysArg202530GinThrThrProAsnSerGluGlyTrpHisAspGlyTyrTyrTyrSer354045TrpTrpSerAspGlyGlyAlaGinAlaThrTyrThrAsnLeuGluGly50556014GlyThrTyrGlulieSerTrpGlyAspGlyGlyAsnLeuValGlyGly65707580LysGlyTrpAsnProGlyLeuAsnAlaArgAlalieHisPheAspGly859095ValTyrGinProAsnGlyAsnSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpThr100105110ArgAsnProLeuValGluTyrTyrlieValGluAsnPheGlyThrTyr115120125AspProSerSerAspAlaThrAspLeuGlyThrValGluCysAspGly130135140SerThrTyrArgLeuGlyLysSerThrArgTyrAsnAlaProSerlie145150155160AspGlylieGinThrPheAspGinTyrTrpSerValArgGinAsnLys165170175ArgSerSerGlyThrValGinThrGlyCysHisPheAspAlaTrpAla180185190ArgAlaGlyLeuAsnValAsnGlyAspHisTyrTyrGinlieValAla195200205ThrGluGlyTyrPheSerSerGlyTyrAlaArglieThrValAlaAsp210215220ValGlyLysLeuAlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHisHisHis22523023權(quán)利要求1、一種木聚糖酶，選自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述木聚糖酶的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因選自如下l)、2)或3):1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述木聚糖酶的DNA分子；3)與l)限定的DNA序列有9(^以上同源性且編碼所述木聚糖酶的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體。5、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組菌。6、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。7、含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達盒。8、權(quán)利要求l所述木聚糖酶在降解半纖維素中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用。該木聚糖酶是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明的木聚糖酶在溫度不高于60℃條件下處理30min幾乎沒有酶活損失，其最適反應(yīng)溫度為75℃，最適pH值為7.0；用本發(fā)明酶水解木聚糖的主要產(chǎn)物為木二糖和木三糖。本發(fā)明的木聚糖酶具有耐熱特性，可廣泛用于分解半纖維素中的木聚糖，生產(chǎn)功能性低聚糖，適合于對溫度要求高的很多工業(yè)環(huán)境，具有在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的巨大潛力。文檔編號C12N9/42GK101659948SQ20081022573公開日2010年3月3日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者敏張,李里特,楊紹青,江正強,閆巧娟申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)