專利名稱：：一種螺旋霉素發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及螺旋霉素的發(fā)酵工藝優(yōu)化方法。具體說是通過添加金屬離子提高螺旋霉素產(chǎn)量的一種發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
：螺旋霉素是由生二鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)所產(chǎn)生的多組分大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。螺旋霉素鏈霉菌生物合成螺旋霉素的過程受許多酶的調(diào)控作用。?；っ负王；o酶A合成酶是螺旋霉素內(nèi)脂環(huán)合成的重要酶。由于合成酶的活性較小，推測(cè)其可能是大環(huán)合成的"瓶頸"，如果提高其活性，就有可能大幅度提高發(fā)酵效價(jià)。在發(fā)酵前期加入激活因子，乙酸激酶處于初級(jí)代謝中，活性提高對(duì)次級(jí)代謝影響不大，效價(jià)提高不明顯。在發(fā)酵中期加入激活因子，大大提高了參與次級(jí)代謝的乙酸激酶和乙酰CoA合成酶的活性，突破了大環(huán)合成的限制，從而明顯提高了螺旋霉素的發(fā)酵效價(jià)。毛全貴等人發(fā)表在中國(guó)抗生素雜志2005年11月第30巻第11期(文索編號(hào)1001-8689(2005)11-0647-02)金屬離子對(duì)螺旋霉素生物合成的影響一文也曾報(bào)道過在螺旋霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)發(fā)酵過程中添加012+、Ca2+、Fe2+和Mg2+等無(wú)機(jī)金屬離子，測(cè)定不同離子濃度對(duì)螺旋霉素發(fā)酵水平的影響。研究表明Ci^對(duì)螺旋霉素生物合成有較強(qiáng)的抑制作用，C^+對(duì)螺旋霉素生物合成影3響不大，F(xiàn)e2+、Mg^都有明顯激活作用，其中Fe"在添加濃度為2.5ug/ml時(shí)對(duì)螺旋霉素生物合成的促進(jìn)作用最大，效價(jià)比對(duì)照組高18.3%;Mg^在濃度為3.0Pg/ml時(shí)效果最好，效價(jià)比對(duì)照組高出11.4%。現(xiàn)有的螺旋霉素的發(fā)酵生產(chǎn)只是一些較常規(guī)的發(fā)酵生產(chǎn)方式，即不添加金屬離子的生產(chǎn)工藝，發(fā)酵工藝為將冷凍管接種于母瓶種子培養(yǎng)40-48h，子瓶培養(yǎng)24h，一級(jí)種子培養(yǎng)23-30h;二級(jí)種子培養(yǎng)20-32h;發(fā)酵培養(yǎng)100-136h放罐。所存在的突出問題是發(fā)酵單位較低，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，往往達(dá)不到生產(chǎn)化的要求。本申請(qǐng)加入的錳離子相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中未加入金屬離子相比，發(fā)酵單位可提高25%。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便的螺旋霉素生產(chǎn)工藝，在發(fā)酵過程中通過添加金屬離子達(dá)到提高螺旋霉素堿單位產(chǎn)量之目的。本發(fā)明是通過以下方式來實(shí)現(xiàn)在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)螺旋霉素堿的發(fā)酵工藝，所述工藝包括螺旋霉素產(chǎn)生菌采取種子培養(yǎng)和發(fā)酵過程，其特征在于在發(fā)酵過程中，添加錳離子的水溶液，使得發(fā)酵罐錳離子的濃度為15-40mM。在本發(fā)明中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基重量配比為淀粉10~15%，黃豆餅粉12%，玉米漿2~3%，磷酸二氫鉀0.010.02%，氯化鈉11.5%，碳酸鈣11.2%，豆油0.5~0.8%。在本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案中，發(fā)酵工藝包括將冷凍管接種于母瓶培養(yǎng)基，在27士0.5。C下培養(yǎng)40-48h，搖床轉(zhuǎn)速220—240轉(zhuǎn)/分；按6Q^接種量接種子瓶培養(yǎng)基，在27i0.5"C下培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速220-240轉(zhuǎn)/分；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到40小時(shí)左右時(shí)加入含有錳離子的溶液。優(yōu)選錳離子的濃度為15-40mM。優(yōu)選錳離子源為四水氯化錳。在本發(fā)明進(jìn)一步的方法中，涉及工業(yè)化生產(chǎn)螺旋霉素的方法，其特征在于所述方法包括將冷凍管接種于母瓶培養(yǎng)基，在27士0.5'C下培養(yǎng)40-48h，搖床轉(zhuǎn)速220-240轉(zhuǎn)/分；按6%接種量接種子瓶培養(yǎng)基，在27士0.5。C下發(fā)酵24h，轉(zhuǎn)速220—240轉(zhuǎn)/分；按10%接種量接種于一級(jí)種子罐中進(jìn)行發(fā)酵，在25-28.5'C下培養(yǎng)23-30h;按10。％移種量接種于二級(jí)種子罐中進(jìn)行發(fā)酵，在20-28"C下培養(yǎng)20-32h;最后，按IO%移種量接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，在24-28.5。C下培養(yǎng)100-136h，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到40小時(shí)時(shí)左右，添加錳離子的水溶液，使得發(fā)酵液中的錳離子濃度為15-40mM，最終獲得螺旋霉素，其發(fā)酵單位可提高大約25%。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選發(fā)酵裝置為100m3不銹鋼罐，轉(zhuǎn)速的優(yōu)選范圍120140轉(zhuǎn)/分，罐壓的優(yōu)選范圍0.010.04MPa，風(fēng)量的優(yōu)選范圍15002000mVh。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點(diǎn)(1)發(fā)酵水平高，已明顯超過原工藝的水平。(2)對(duì)組分沒有影響。(3)操作簡(jiǎn)單。(4)成本低，便于大規(guī)模生可以看出這種方法有效地克服了國(guó)內(nèi)現(xiàn)有生產(chǎn)螺旋霉素堿工藝的不足，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要。具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例的制備方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下，類似的制備方法都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)，另外，本發(fā)明說明書中的(w/w)是指重量比或者重量比濃度，(v/v)是指體積比或者體積比濃度，W/V是指重量與體積的比例(例如，克/毫升，g/ml或者千克/升)。實(shí)施例1、2、3為搖瓶實(shí)驗(yàn)，是將斜面種子轉(zhuǎn)接搖瓶種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵；實(shí)施例4、5和6為放大試驗(yàn)，種子經(jīng)一級(jí)、二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)而來，在1001113發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)施例1將斜面(即菌種)接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，在27t:下培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速220r/min;按6%接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為220r/min，在27。C下，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)96h。發(fā)酵培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制(發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硝酸銨、碳酸鈣、玉米漿、豆油，其比例為淀粉10~15%，黃豆餅粉12%，玉米漿23%，磷酸二氫鉀0.010.02%，氯化鈉11.5%，碳酸f丐11.2%，豆油0.50.8%)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到35小時(shí)時(shí)，一次性投入含一定量錳離子的四氯化錳水溶液與發(fā)酵液中，使得投入到發(fā)酵搖瓶中的錳離子濃度為30mM。實(shí)施例2如實(shí)施例1的方法，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到40小時(shí)時(shí)一次性投入含一定量錳離子的水溶液與發(fā)酵液中，此時(shí)投入到發(fā)酵搖瓶中的錳離子濃度為35mM。實(shí)施例3如實(shí)施例1的方法，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到45小時(shí)時(shí)一次性投入含一定量錳離子的水溶液到發(fā)酵液中，此時(shí)發(fā)酵搖瓶中的錳離子濃度為40mM。表l.錳離子添加工藝在搖瓶上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有添加過Mr^+搖瓶對(duì)照Mr^+添加濃度(mM)Mn2+搖瓶對(duì)照<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>效價(jià)與螺旋霉素的含量相對(duì)應(yīng)，而效價(jià)的高低是評(píng)價(jià)發(fā)酵水平的標(biāo)志。按干燥品計(jì)算:每lmg螺旋霉素相當(dāng)于卯0螺旋霉素的效價(jià)單位。由此可見，在上述發(fā)酵過程中，加入錳離子之后顯著提高了螺旋霉素的含量。實(shí)施例4如實(shí)施例l的方法，按6%接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為220r/min，在27。C下，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)27h。按10%接種量接種于lm3—級(jí)種子罐中進(jìn)行發(fā)酵，25-28.5'C培養(yǎng)23-30h;按10%移種量接種于101113二級(jí)種子罐中進(jìn)行發(fā)酵，20-28"C培養(yǎng)20-32h;按10%移種量接種于100m3發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，24-28.5'C培養(yǎng)100-136h。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到35小時(shí)一次性投入含一定量錳離子的水溶液(四氯化錳水溶液)與發(fā)酵液中，使得此時(shí)投入到發(fā)酵搖瓶中的錳離子濃度為30mM。實(shí)施例5如實(shí)施例4的方法，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到40小時(shí)時(shí)一次性投入含一定量錳離子的水溶液與發(fā)酵液中，此時(shí)投入到發(fā)酵搖瓶中的錳離子濃度為35mM。實(shí)施例6如實(shí)施例4的方法，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到45小時(shí)時(shí)一次性投入含一定量錳離子的水溶液與發(fā)酵液中，此時(shí)投入到發(fā)酵搖瓶中的錳離子濃度為35mM。表2.錳離子添加工藝在1001113發(fā)酵罐上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上表可以看出在100m3發(fā)酵罐上試驗(yàn)，發(fā)酵前期(40小時(shí)左右)加入錳離子濃度為15-40mM，加入錳離子的發(fā)酵單位比對(duì)照高出大約25.0%。權(quán)利要求1.一種添加金屬離子提高螺旋霉素堿產(chǎn)量的發(fā)酵工藝，發(fā)酵工藝為將冷凍管接種于母瓶培養(yǎng)基，27±0.5℃培養(yǎng)40-48h，轉(zhuǎn)速220--240轉(zhuǎn)/分；按6％接種量轉(zhuǎn)接子瓶培養(yǎng)基，27±0.5℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速220--240轉(zhuǎn)/分；按10％接種量接種于一級(jí)種子罐中進(jìn)行發(fā)酵，25-28.5℃培養(yǎng)23-30h；按10％移種量接種于二級(jí)種子罐中進(jìn)行發(fā)酵，20-28℃培養(yǎng)20-32h；按10％移種量接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，24-28.5℃培養(yǎng)100-136h；其特征在于在發(fā)酵的過程中，添加錳離子的水溶液，使得發(fā)酵液中錳離子的濃度為15-40mM。2.如權(quán)利要求l所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到40小時(shí)左右時(shí)，添加錳離子的水溶液，使得發(fā)酵液中的錳離子濃度為15-40mM。全文摘要一種添加金屬離子提高螺旋霉素堿產(chǎn)量的發(fā)酵工藝。本發(fā)明是在按常規(guī)方法配置發(fā)酵培養(yǎng)基后，添加一定量的錳離子溶液，用本發(fā)明所建立的發(fā)酵工藝進(jìn)行螺旋霉素堿的發(fā)酵水平已明顯超過原工藝的水平，不僅效價(jià)高，而且操作簡(jiǎn)單成本低，便于大規(guī)模生產(chǎn)，有效地克服了現(xiàn)有發(fā)酵方法的不足，并為下一階段的工業(yè)產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)奠定了良好基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12P19/62GK101497907SQ200910118920公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2009年3月6日優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日發(fā)明者唐慧慧,孔德周,李武德,李翠平,毛全貴,焦國(guó)華,偉王,祝立新申請(qǐng)人:河南天方藥業(yè)股份有限公司