檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的試紙條及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的試紙條及方法。試紙條包括試紙和微孔試劑，所述微孔試劑中凍干有膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單克隆抗體、鏈霉素單克隆抗體、慶大霉素單克隆抗體、新霉素單克隆抗體；所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜、底板依次連接組成，所述反應(yīng)膜上包括檢測(cè)線和質(zhì)控線，四條檢測(cè)線分別包被有螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被有羊抗鼠抗抗體。本發(fā)明試紙條可有效同時(shí)檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素，方法簡(jiǎn)單、快速、直觀、準(zhǔn)確、成本低，易于推廣使用。
【專利說明】檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的試紙條及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的試紙條及方法，具體涉及一種用于檢測(cè)牛奶中螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的膠體金試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]鏈霉素、慶大霉素、新霉素屬于氨基糖苷類抗生素，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的治療，由于這些藥物具有神經(jīng)毒性和腎臟毒性，在動(dòng)物食品中的殘留會(huì)影響人類健康，歐美國家及我國均要求其限量使用。螺旋霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可用于治療由革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。由于肝膽系統(tǒng)是乙酰螺旋霉素排泄的主要途徑，故嚴(yán)重肝功能不全患者慎用該品。農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定鏈霉素在牛奶中殘留限量為200yg/L，慶大霉素在牛奶中殘留限量為200 μ g/L，新霉素在牛奶中殘留限量為500μ g/L。歐盟在動(dòng)物源性食品最高殘留限量規(guī)定2377/90/EC規(guī)定螺旋霉素在牛奶中最大殘留限量為200 μ g/kg。
[0003]目前，氨基糖甙類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留監(jiān)控中免疫測(cè)定法仍是最常見的分析手段，免疫分析方法與儀器檢測(cè)方法相比，樣品前處理過程較簡(jiǎn)單，適合進(jìn)行大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。膠體金免疫層析試紙條已廣泛用于藥物殘留檢測(cè)中，具有操作簡(jiǎn)便、快速、不需要任何設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為免疫學(xué)檢測(cè)發(fā)展方向之一。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的膠體金快速檢測(cè)試紙條。
[0005]本發(fā)明所提供的試紙條包括試紙、微孔試劑，微孔試劑具有微孔塞，試紙包括反應(yīng)膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板；所述微孔試劑中分別凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，反應(yīng)膜上包括檢測(cè)線和質(zhì)控線，均呈與所述試紙的長(zhǎng)相垂直的條帶狀，檢測(cè)線分別包被有螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被羊抗鼠抗抗體。
[0006]所述螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由螺旋霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得至IJ，所述鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由鏈霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由新霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺蛋白、血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白。
[0007]所述螺旋霉素單克隆抗體是以螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的，鏈霉素單克隆抗體是以鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的，慶大霉素單克隆抗體是以慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的，新霉素單克隆抗體是以新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的。
[0008]所述保護(hù)膜粘貼在樣品吸收墊上，為檢測(cè)端，上面有MAX標(biāo)記線。
[0009]所述檢測(cè)線位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控線位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。
[0010]所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或全血濾膜；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述試紙條的方法，其包括步驟:
[0012]I)制備凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；
[0013]2)制備分別包被有螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；
[0014]3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；
[0015]4)將I)和3)制備好的凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
[0016]具體地說,步驟包括:
[0017]I)分別制備螺旋霉素半抗原、鏈霉素半抗原、慶大霉素半抗原、新霉素半抗原；
[0018]2 )分別將螺旋霉素半抗原、鏈霉素半抗原、慶大霉素半抗原、新霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；
[0019]3)用螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物分別免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，分別得到分泌螺旋霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分泌鏈霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分泌慶大霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株和分泌新霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0020]4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；
[0021]5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；
[0022]6)將制備的螺旋霉素單克隆抗體、鏈霉素單克隆抗體、慶大霉素單克隆抗體、新霉素單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
[0023]7)將螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中后，將微孔試劑加上微孔塞；
[0024]8)將樣品吸收墊用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0.5%體積百分含量)、PH為7.2、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h ；[0025]9)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜；
[0026]10)將制備好的微孔試劑、試紙組裝成試紙條，2?8°C條件下保存12個(gè)月。
[0027]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用上述試紙條檢測(cè)樣品中螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素殘留的方法，它包括步驟:
[0028](I)用試紙條進(jìn)行檢測(cè)；
[0029](2)分析檢測(cè)結(jié)果。
[0030]本發(fā)明中用試紙條檢測(cè)樣品時(shí)，將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后室溫鮮育5min,將標(biāo)有MAX標(biāo)記線端向下，插入鮮育后的微孔試劑，待檢樣品液與微孔中的金標(biāo)抗體結(jié)合后一起向反應(yīng)膜擴(kuò)散；若待檢樣品液中待檢藥物的含量高，則擴(kuò)散過程中待檢樣品液中的待檢藥物可與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而完全封閉金標(biāo)抗體上待檢藥物的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與反應(yīng)膜上待檢藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測(cè)線不顯色，而抗抗體則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控線顯色；若待檢樣品液中待檢藥物的含量低或無，則金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)不能被封閉，進(jìn)而金標(biāo)抗體會(huì)與反應(yīng)膜上藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測(cè)線顯色，同時(shí)抗抗體也可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控線顯色。如果質(zhì)控線不顯色，則試紙失效。如圖4a-4k所不。
[0031]陰性(_):C線顯色，T線均顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣本中螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素濃度均低于檢測(cè)限。
[0032]陽性(+ ):C線顯色，T1線不顯色，表示牛奶樣本中螺旋霉素濃度等于或高于檢測(cè)限；
[0033]C線顯色，T2線不顯色，表示牛奶樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測(cè)限；
[0034]C線顯色，T3線不顯色，表示牛奶樣本中慶大霉素濃度等于或高于檢測(cè)限；
[0035]C線顯色，T4線不顯色，表示牛奶樣本中新霉素濃度等于或高于檢測(cè)限；
[0036]無效:當(dāng)質(zhì)控線(C)不顯示條帶，表明不正確的操作過程或試紙條已失效。
[0037]本發(fā)明的試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。將金標(biāo)抗體凍干在微孔試劑中，在檢測(cè)過程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個(gè)體系的反應(yīng)靈敏度。用本發(fā)明試紙條檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的方法，簡(jiǎn)便、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1為試紙剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0039]圖2為試紙俯視圖。
[0040]圖3為微孔試劑圖。
[0041]圖4a_4k為試紙檢測(cè)結(jié)果判定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043]實(shí)施例1檢測(cè)螺旋霉素&鏈霉素&慶大霉素&新霉素的試紙條的構(gòu)成
[0044]一、試紙(圖1)[0045]所述試紙是由底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜組成；
[0046]所述樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜7依次按順序粘貼在底板6上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；
[0047]所述試紙的樣品吸收墊端粘貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜7覆蓋在樣品吸收墊上的檢測(cè)端，在檢測(cè)端保護(hù)膜上印有MAX字樣(圖2)；
[0048]所述反應(yīng)膜上有四條檢測(cè)線4-1，4-2，4-3，4_4和質(zhì)控線5，均呈與所述試紙的長(zhǎng)相垂直的條帶狀，檢測(cè)線位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，質(zhì)控線位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。四條檢測(cè)線分別包被有螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被有羊抗鼠抗抗體；
[0049]所述底板為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或全血濾膜；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
[0050]二、微孔試劑(圖3)
[0051 ] 所述微孔試劑8具有微孔塞9，微孔試劑上分別凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0052]將上述試紙、微孔試劑組裝成試紙條，在疒8°C環(huán)境中保存，有效期12個(gè)月。
[0053]實(shí)施例2實(shí)施例1中所述試紙條的制備方法
[0054]一、試紙條的制備
[0055]試紙條的制備方法主要包括以下步驟:
[0056]I)制備凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；
[0057]2)制備具有分別包被有螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；
[0058]3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；
[0059]4)將I)和3)制備好的凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
[0060]下面分步詳細(xì)敘述:
[0061](一)各部件的制備
[0062]1.抗原制備
[0063]( I)螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的制備
[0064]a、半抗原的合成
[0065]0.85g螺旋霉素在5ml 二甲基亞砜(DMSO)中的混合物，60°C下緩慢滴加入0.5ml乙二胺和0.5ml吡啶在IOml DMSO的混合液中，滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)，旋蒸除去溶
劑和未反應(yīng)的乙二胺，定量得到螺旋霉素的乙二胺單縮合物。[0066]b、免疫原的制備
[0067]取半抗原30mg用2.7ml N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶解完全，制成I液；取50%戊二醛(GA) 300y 1，加入I液中，反應(yīng)I小時(shí)得到II液；取牛血清白蛋白(BSA) 120mg用7ml 0.lmol/L PBS (PH7.0)溶解完全，制成III液；將II液加入III液中，室溫反應(yīng)24小時(shí)，用0.01mol/L PBS透析三天,每天換液三次,得免疫原。
[0068]C、包被原的制備
[0069]同上，將牛血清白蛋白(BSA)換成卵清白蛋白(0VA)，制備得到包被原。
[0070](2)鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的制備
[0071]a、半抗原的合成
[0072]1.0g鏈霉素、0.3g鄰苯二甲酸酐和Iml吡啶在20ml DMSO中的混合液，在80°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，蒸除溶劑，乙醇-水體系中多次重結(jié)晶得到鄰苯二甲酸單鏈霉素酯。
[0073]b、免疫原的制備
[0074]取半抗原40mg用2ml DMF溶解完全，制成IV液；取83々80mg用7ml 0.lmol/L PBS(pH7.5)溶解完全，制V液；將~液加入V液中，制成VI液；取碳化二亞胺(EDC)IOOmg用Iml水溶解后緩沖加入VI液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)；用0.0111101/1 PBS透析三天，每天換液三次，得
免疫原。
[0075]C、包被原的制備
[0076]同上，將BSA換成OVA，制備得到包被原。
[0077](3)慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的制備
[0078]a、半抗原的合成
[0079]0.39g溴乙酸叔丁酯在5ml DMSO中的溶液，40°C下緩慢滴加入0.90g慶大霉素和Iml吡啶在IOml DMSO中的混合物中。滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)6小時(shí)后，蒸除溶劑。簡(jiǎn)單柱層析分離后，除去溶劑，加入20ml DMSO和5ml甲酸，室溫反應(yīng)20小時(shí)，蒸除溶劑，乙醇-水體系中重結(jié)晶得到羧甲基慶大霉素。
[0080]b、免疫原的制備
[0081]取半抗原35mg用2ml DMF溶解完全，制成A液；取BSA IOOmg用7ml 0.lmol/LPBS (ρΗ7.5)溶解完全，制成B液；將A液加入B液中，制成C液；取EDC IOOmg用Iml水溶解后緩沖加入C液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，用0.01mol/L PBS透析三天，每天換液三次，得免疫原。
[0082]C、包被原的制備
[0083]同上，將BSA換成OVA，制備得到包被原。
[0084](4)新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的制備
[0085]a、半抗原的合成
[0086]0.61g新霉素和10ml DMSO的混合液，室溫下緩慢滴加入到0.14g對(duì)苯二甲醛的10ml DMSO溶液中，滴加完畢后室溫至60°C反應(yīng)2_4小時(shí)，除去溶劑，乙醇-水體系中重結(jié)晶得到新霉素對(duì)苯二甲醛單縮合物。
[0087]b、免疫原的制備
[0088]取半抗原30mg用3ml DMF溶解完全，制成D液；取BSA IOOmg用7ml 0.lmol/L PBS(PH7.0)溶解完全，制成E液；將D液加入E液中，制成F液，室溫反應(yīng)24小時(shí)；用0.0lmol/L PBS透析三天，每天換液三次，得免疫原。
[0089]C、包被原的制備
[0090]同上，將BSA換成OVA，制備得到包被原。
[0091 ] (5)藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定
[0092]將載體蛋白、螺旋霉素半抗原、螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)20(T800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、螺旋霉素半抗原、螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明螺旋霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。用同樣的方法鑒定鏈霉素半抗原與載體蛋白、慶大霉素半抗原與載體蛋白、新霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物是否偶聯(lián)成功。
[0093]2.單克隆抗體的制備
[0094]( I)動(dòng)物免疫
[0095]將上述制備得到的免疫原分別注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使
其產(chǎn)生抗血清。
[0096](2)細(xì)胞融合和克隆化
[0097]取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按8:1 (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌螺旋霉素的螺旋霉素單克隆抗體的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株、分泌鏈霉素單克隆抗體的鏈霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株、分泌慶大霉素單克隆抗體的慶大霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株、分泌新霉素單克隆抗體的新霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0098](3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
[0099]將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
[0100](4)單克隆抗體的制備與純化
[0101]增量培養(yǎng)法:將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。
[0102]所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為
0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
[0103]3.羊抗鼠抗抗體的制備
[0104]以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
[0105]4.四種單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0106](I)膠體金的制備
[0107]用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01% (質(zhì)量百分含量)，取IOOml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5ml 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時(shí)停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。
[0108](2)分別制備四種單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物
[0109]分別制備單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入10-50μ g抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻IOmin,加入10%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000rpm，4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0110]復(fù)溶緩沖液:含牛血清白蛋白(BSA) 0.2%~Ο.5% (體積百分含量)、吐溫_80
0.05%~0.2% (質(zhì)量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0111]5.將四種單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上
[0112]向微孔試劑微孔中分別加入50μ I螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、50μ I鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、50 μ I慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、50 μ I新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度為_50°C條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠 體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，密封保存。
[0113]6.樣品吸收墊的制備
[0114]將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0.5%(體積百分含量))、pH7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。
[0115]7.反應(yīng)膜的制備
[0116]包被過程:分別用磷酸緩沖液將螺旋霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物、新霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到lmg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線，包被量為1.0 μ 1/cm ;用0.01mol/L、ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線，包被量為1.0 μ Ι/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥2h，備用。
[0117](二)各部件的組裝
[0118]1.試紙的組裝
[0119]將所述樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次按順序粘貼在所述底板上；樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；在組裝好的試紙樣品吸收墊上粘貼保護(hù)膜，保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線。
[0120]2.試紙條的組裝
[0121]將上述步驟I得到的試紙與微孔試劑組裝成試紙條，在疒8°C的環(huán)境中貯存，有效期12個(gè)月。
[0122]實(shí)施例3樣品中螺旋霉素&鏈霉素&慶大霉素&新霉素的檢測(cè)
[0123]1.用試紙條檢測(cè)樣品
[0124]從原包裝中取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙，并做好標(biāo)記；吸取待檢牛奶樣品，用微量移液器移取200μ I于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，室溫(20°C -25°C)孵育5min ;將印有“MAX”線端朝下插入微孔中，使之充分浸入溶液中；室溫(20°C _25°C)孵育5min后,取出試紙,判定結(jié)果。
[0125]2.檢測(cè)結(jié)果分析[0126]陰性:C線顯色，T線均顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣本中螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素濃度均低于檢測(cè)限，判為陰性，用“一 ”表示，如圖4a。
[0127]陽性:C線顯色,T1-T4線均不顯色，表示牛奶樣本中螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素濃度高于或等于檢測(cè)限，判為陽性，用“ + ”表示，如圖4b ;(:線顯色，1\線不顯色，表示牛奶樣本中螺旋霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，判為陽性，用“ + ”表示，如圖4c ;(:線顯色，T2線不顯色，表示牛奶樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，判為陽性，用“ + ”表示，如圖4d ;C線顯色，T3線不顯色，表示牛奶樣本中慶大霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，判為陽性，用“ + ”表示，如圖4e ；C線顯色，T4線不顯色，表示牛奶樣本中新霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，判為陽性，用“ + ”表示，如圖4f。
[0128]無效:未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已失效，如圖4g_4k所示。
[0129]實(shí)施例4試紙條技術(shù)參數(shù)的確定
[0130]1.檢測(cè)限試驗(yàn)
[0131]向空白牛奶樣品中分別添加螺旋霉素、慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為0、10、20、40 μ g/L,添加鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為0、40、80、160μ g/L,添加新霉素標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為0、250、500、1000μ g/L，用試紙條進(jìn)行牛奶樣品檢測(cè)，結(jié)果為:當(dāng)螺旋霉素添加濃度為O、10 μ g/L時(shí)，慶大霉素添加濃度為O、10 μ g/L時(shí)，鏈霉素添加濃度為0、40 μ g/L時(shí)，新霉素添加濃度為0、250μ g/L時(shí)，C線顯色,T1-T4均顯色，呈陰性；當(dāng)螺旋霉素添加濃度為20、40μ g/L時(shí)，C線顯色,T1不顯色，表示牛奶樣本中螺旋霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，呈陽性；當(dāng)鏈霉素添加濃度為80、160 μ g/L時(shí)，C線顯色，T2不顯色，表示牛奶樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，呈陽性；當(dāng)慶大霉素添加濃度為20、40 μ g/L時(shí)，C線顯色，T3不顯色，表示牛奶樣本中慶大霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，呈陽性；當(dāng)新霉素添加濃度為500、1000μ g/L時(shí)，C線顯色，T4不顯色，表示牛奶樣本中新霉素濃度等于或高于檢測(cè)限，呈陽性；表明本試紙條對(duì)牛奶樣品螺旋霉素檢測(cè)限為20 μ g/L，慶大霉素檢測(cè)限為20μ g/L，鏈霉素檢測(cè)限為80 μ g/L,新霉素檢測(cè)限為500 μ g/L。
[0132]2.假陽性率、假陰性率試驗(yàn)
[0133]取已知螺旋霉素含量大于20 μ g/L的牛奶陽性樣品20份、慶大霉素含量大于20 μ g/L的牛奶陽性樣品20份、鏈霉素含量大于80 μ g/L的牛奶陽性樣品20份、新霉素含量大于500 μ g/L的牛奶陽性樣品20份、以及牛奶陰性樣品20份，用3個(gè)批次生產(chǎn)的試紙條分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1、表2。
[0134]表I檢測(cè)陽性樣品結(jié)果
[0135]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素的試紙條，其特征在于包括試紙和微孔試劑，所述試紙包括反應(yīng)膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板，所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線分別包被有螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被有羊抗鼠抗抗體，所述微孔試劑中凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次粘貼在底板上組成，所述微孔試劑上具有微孔塞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試紙，其特征在于所述保護(hù)膜粘貼在樣品吸收墊上，為檢測(cè)端，上面有MAX標(biāo)記線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述檢測(cè)線位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控線位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，均呈與所述試紙的長(zhǎng)相垂直的條帶狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述螺旋霉素單克隆抗體是以螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的，鏈霉素單克隆抗體是以鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的，慶大霉素單克隆抗體是以慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的，新霉素單克隆抗體是以新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的。
6.一種制備權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述試紙條的方法，其包括步驟: 1)制備凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑； 2)制備具有分別包被有螺旋霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和新霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜； 3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙； 4)將I)和3)制備好的凍干有螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
7.—種檢測(cè)樣品中螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素殘留的方法，其包括步驟: 1)用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試紙條進(jìn)行檢測(cè)； 2)分析檢測(cè)結(jié)果。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103713133SQ201210374754
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月29日
【發(fā)明者】萬宇平, 何方洋, 羅曉琴, 陶光燦, 馮靜, 劉葉, 羅貴昆 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司