專利名稱：螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及ー種利用膠體金免疫層析技術(shù)制作的ー種螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
螺旋霉素，英文名Spiramycin，是獸藥中常見(jiàn)的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)抗生素。螺旋霉素對(duì)葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌、淋球菌等具有抗菌作用，主要用于抗禽獸細(xì)菌及支衣原體感染，也可以作為飼料添加劑促進(jìn)增重和提高飼料轉(zhuǎn)換率。動(dòng)物長(zhǎng)期服用后，代謝物會(huì)在動(dòng)物的組織及器械內(nèi)蓄積或貯存，達(dá)到一定濃度可造成動(dòng)物前庭和俄耳蝸神經(jīng)的損害，導(dǎo)致眩暈和聽(tīng)力減退，嚴(yán)重者還將造成肝腎的損害。螺旋霉素能夠通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，將對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重的危害。國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟以及日本均規(guī)定該藥 物的最高殘余量限量值為200 μ g/L，因此，需要建立ー種快速、靈敏的螺旋霉素檢測(cè)方法。目前，關(guān)于螺旋霉素殘留的檢測(cè)分析方法主要為高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、薄層色譜分析法、微生物效價(jià)法等，但這些方法存在著儀器昂貴、檢測(cè)過(guò)程繁瑣、對(duì)檢驗(yàn)人員的技能要求高等缺點(diǎn)，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩查，在實(shí)際的應(yīng)用中受到限制。而本發(fā)明方法克服了上述方法的缺點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)螺旋霉素的快速檢測(cè)。本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術(shù)制備了 ー種螺旋霉素檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏、無(wú)需復(fù)雜儀器等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、成本低的螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法。ー種螺旋霉素檢測(cè)試劑盒，包括樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，其中檢測(cè)線(T線)上包被了螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白，質(zhì)控線(C線)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體；所述吸樣墊為吸水紙。偶聯(lián)螺旋霉素的載體蛋白為牛血清白蛋白，或卵清白蛋白，或血藍(lán)蛋白。本發(fā)明采用納米膠體金技術(shù)及抗原抗體特異性反應(yīng)，應(yīng)用免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)的原理制備而成，即待檢樣本中可能含有的螺旋霉素與硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(T線)包被的螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的螺旋霉素抗體，通過(guò)T線的顯色來(lái)判定待檢樣本中是否含有螺旋霉素。本發(fā)明提供了ー種螺旋霉素檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟(I)制備螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白將螺旋霉素與載體蛋白偶聯(lián)，合成螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原和包被原。
(2)制備螺旋霉素單克隆抗體采用螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白為免疫原免疫BALB/C小鼠，制備螺旋霉素單克隆抗體。(3)制備膠體金取0.01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液Iml,繼續(xù)煮沸約5min,出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20_40nm。(4)制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入螺旋霉素單克隆抗體，使螺旋霉素單克隆抗體的濃度為20-100 u g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；取初始膠體金溶液體 積5%的量的膠體金復(fù)溶液于上述溶液中，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30-70%初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解，得到螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按15-35 iil/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥2. 5-3小時(shí)，制成膠體金墊。上述膠體金復(fù)溶液為含0. 30% 的 Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP, 0. 30% Casein-Na,pH值7. 0-9. 0的溶液。(5)包被螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白、羊抗鼠IgG多克隆抗體將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開(kāi)劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設(shè)置劃膜儀參數(shù)為C線I. 0 i! 1/cm, T線I. 0 i! 1/cm。 將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號(hào)筆標(biāo)出，將包被板置干燥箱設(shè)置451，干燥1-1.5小時(shí)。其中，T線包被液為0.8-3. 5mg/ml的螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白；C線包被液為
0.6-2. Omg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體。(6)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 7. 0-8. O的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含0. 5-1. 5% BSA, 0. 5-1.0% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用。(7)組裝試劑盒取上述制備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然后膠體金墊貼于PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5_，樣品墊貼于膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm(如圖I所示)。打開(kāi)切條機(jī)，按產(chǎn)品要求設(shè)置裁切寬度，將上述組裝好的PVC板放于切條機(jī)上，按設(shè)置寬度進(jìn)行切條，得到所述用于檢測(cè)螺旋霉素的試紙條；試紙條可以裝入塑料卡內(nèi)，組裝成檢測(cè)卡。本發(fā)明所述試劑盒的檢測(cè)方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出螺旋霉素檢測(cè)裝置，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，5-10分鐘時(shí)觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測(cè)結(jié)果；或?qū)⒙菪顾貦z測(cè)試紙條樣品墊末端浸入被測(cè)樣品溶液中約10秒鐘后，水平放置；5-10分鐘時(shí)觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)測(cè)定螺旋霉素，檢測(cè)時(shí)，將被測(cè)樣品加在試劑盒上的樣品墊上，可以直接觀察到免疫反應(yīng)的結(jié)果，完成樣品檢測(cè)。本發(fā)明可用于檢測(cè)樣本中可能存在的螺旋霉素，具有使用方便、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)。


圖I螺旋霉素檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；附圖符號(hào)說(shuō)明I :樣品墊；
2 :膠體金墊(膠體金標(biāo)記螺旋霉素單克隆抗體的聚酯膜)3 :硝酸纖維素膜(T :包被了螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白的檢測(cè)線；C :包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體的質(zhì)控線)；4 :吸樣墊；5 =PVC 支撐板；圖2本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果示意圖。自左至右依次為C線一條線陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果；T、C兩條線陰性檢測(cè)結(jié)果；無(wú)效。實(shí)施例I :螺旋霉素檢測(cè)試劑盒的制備I.制備螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白將螺旋霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)，合成螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白做為免疫原和包被原。2.制備螺旋霉素單克隆抗體采用螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白為免疫原免疫BALB/C小鼠,制備螺旋霉素單克隆抗體。3.制備膠體金取O. 01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液Iml,繼續(xù)煮沸約5min,出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20_40nm。4.制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，用O. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至8. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入70 μ I濃度為3. 5mg/ml的螺旋霉素單克隆抗體，混合均勻后，室溫放置30分鐘；取250 μ I的膠體金復(fù)溶液于上述溶液中，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剰余的沉淀用2. 5ml的膠體金復(fù)溶液溶解，得到螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將螺旋霉素單克隆抗體-膠體標(biāo)記物按20 μ I/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥3小時(shí)，制成膠體金墊。上述膠體金復(fù)溶液為含O. 30% 的 Tris，5%蔗糖，O. 50% PVP，O. 30% Casein-Na,PH值8. O的溶液。5.包被螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白、羊抗鼠IgG多克隆抗體將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開(kāi)劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設(shè)置劃膜儀參數(shù)為C線I. O μ 1/cm, T線I. O μ 1/cm。將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號(hào)筆標(biāo)出，將包被板置干燥箱設(shè)置45°C，干燥I小吋。其中，T線包被液為3. Omg/ml的螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白；(線包被液為I.Omg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體。6.樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 8. O的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含I. 0% BSA, 0. 5% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用7.組裝試劑盒取上述制備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然后膠體金墊貼于PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5_，樣品墊貼于膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm(如圖I所示)。打開(kāi)切條機(jī)，設(shè)置裁切寬度為3. 8mm，將上述組裝好的PVC板放于切條機(jī)上，按設(shè)置寬度進(jìn)行切條，得到所述用于檢測(cè)螺旋霉素的試紙條；試紙條可以裝入塑料卡內(nèi)，組裝成檢測(cè)卡。實(shí)施例2 :螺旋霉素檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)I.樣品的處理血清抽取血清，離心或靜置后取透明上清液使用；尿液用尿液直接進(jìn)行測(cè)試，若尿液呈可見(jiàn)的混濁狀，需先離心、過(guò)濾或待其沉淀后取上清液檢測(cè)；牛奶4°C、3000r/min離心15min,去除上層脂肪后檢測(cè)。蜂蜜、蛋用0. 01mol/L，pH 7. 5的PBS制成I 2的待測(cè)樣品懸浮液，震蕩IOmin,3000r/min離心15min,取上清液檢測(cè)。組織樣品取5-10g組織樣品搗碎后，加入20-30ml(0. 01mol/L,pH 7. 5)PBS，震蕩IOmin, 37°C恒溫箱中反應(yīng)30min后,水浴IOmin,于4°C、3000r/min離心15min,去除上層脂
肪，取上清液檢測(cè)。飼料取0. 5-2g 磨碎的待測(cè)飼料，加入 8-20ml(0. 01mol/L,pH 7. 5)PBS，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min后,水浴IOmin,于4°C、3000r/min離心15min,取上清液檢測(cè)。2.檢測(cè)方法取出螺旋霉素檢測(cè)試劑盒，水平放置；在樣品墊上滴入3滴樣品，10分鐘后觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測(cè)結(jié)果。3.結(jié)果判定陽(yáng)性T線不顯色，僅C線顯色，判定為陽(yáng)性結(jié)果；陰性T線、C線均顯色，判定為陰性結(jié)果；無(wú)效C線不顯色，說(shuō)明不正確操作或試劑盒已經(jīng)變質(zhì)損壞。檢測(cè)樣品時(shí)，樣品因毛細(xì)管作用向吸樣墊一端層析。若被測(cè)樣品中含有螺旋霉素，它們將和檢測(cè)線(T線)上包被的螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單克隆抗體上有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)樣品中的螺旋霉素達(dá)到一定濃度時(shí)，與膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)并完全飽和，此時(shí)膠體金復(fù)合物已無(wú)空余的位點(diǎn)和檢測(cè)線上包被的螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白結(jié)合，此時(shí)T線不顯色，此為陽(yáng)性結(jié)果；若被測(cè)樣品中不含螺旋霉素，標(biāo)記了螺旋霉素單克隆抗體的膠體金顆粒將隨同樣品層析至T線位置后，與T線上包被的螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，膠體金顆粒在T線位置堆積使得T線呈現(xiàn)出一條肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，此為陰性結(jié)果。無(wú)論被測(cè)樣品中是否含有螺旋霉素，膠體金標(biāo)記物均會(huì)與C線包被的羊抗鼠IgG反應(yīng)形成一條肉眼可見(jiàn)的紅色、條帶，C線顯色與否，是判定是否有足夠樣本，層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的 內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，其中檢測(cè)線(T線)上包被了螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白，質(zhì)控線(C線)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體；所述吸樣墊為吸水紙。
2.—種權(quán)利要求I所述的螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白為螺旋霉素偶聯(lián)牛血清白蛋白，或卵清白蛋白，或血藍(lán)蛋白；所述的螺旋霉素單克隆抗體由螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原免疫BALB/C小鼠獲得。
3.—種權(quán)利要求I所述的螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑枸櫞酸三鈉作用下制成大小為20-40nm的膠體金顆粒。
4.一種權(quán)利要求I所述的螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金墊的制備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調(diào)至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入螺旋霉素單克隆抗體，使螺旋霉素單克隆抗體的濃度為20-100 ii g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；取初始膠體金溶液體積5%的量的膠體金復(fù)溶液于上述溶液中，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30-70%初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解，得到螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將螺旋霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按15-35 u I/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥2. 5-3小時(shí)，制成膠體金墊。
5.一種權(quán)利要求I所述的螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金復(fù)溶液為含 0. 30% 的 Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP, 0. 30% Casein-Na，pH 值 7. 0-9. 0 的溶液。
6.一種權(quán)利要求I所述的螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上T、C線的包被方法為；將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5_。打開(kāi)劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，將貼好的PVC板放在劃膜儀上，設(shè)置劃膜儀參數(shù)為C線I. 0 ii l/cm，T線I. 0 ii 1/cm ;用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號(hào)筆標(biāo)出，將包被板置干燥箱設(shè)置45°C，干燥1-1. 5小時(shí)。其中，T線包被液為0.8-3. 5mg/ml的螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白；C線包被液為0. 6-2. Omg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體。
全文摘要
螺旋霉素檢測(cè)試劑盒及其制備方法，本發(fā)明涉及生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒由樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)組成，在PVC支撐板上依次連續(xù)粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。膠體金墊為膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單克隆抗體聚酯膜，硝酸纖維素膜上依次包被了螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白作為檢測(cè)線(T線)，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線(C線)。本發(fā)明利用膠體金免疫層析技術(shù)，運(yùn)用被測(cè)樣品中可能含有的螺旋霉素與硝酸纖維素膜上包被的螺旋霉素偶聯(lián)載體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單克隆抗體的原理檢測(cè)樣品中的螺旋霉素。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102721808SQ20111007644
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者李峰, 楊利, 陳立柱 申請(qǐng)人:庫(kù)爾醫(yī)療技術(shù)(北京)有限公司