專利名稱：檢測pax2用于診斷乳腺癌的制作方法
檢測PAX2用于診斷乳腺癌本申請要求于2009年8月24日提交的美國申請?zhí)?2/546，292的優(yōu)先權。前述申請整體通過引用并入本文。領域本申請通常涉及醫(yī)療診斷，具體涉及用于診斷各種組織中癌癥狀態(tài)的方法。背景乳腺癌是女性最常見的癌癥原因，并且在美國是女性第二大常見的癌癥死亡原因。雖然多數(shù)初期乳腺癌是基于發(fā)現(xiàn)乳腺影像異常來診斷的，但是腫塊或乳腺組織堅實度的變化也可以是疾病的警報信號。過去幾十年內(nèi)提高乳腺癌風險意識已致使增加進行乳腺 攝影篩查的女性數(shù)量，導致更早期檢測癌癥并且由此提高存活率。盡管如此，乳腺癌是45至55歲女性最常見的死亡原因。乳腺癌可以分成幾期。O期是原位癌(包括小葉癌和乳腺導管癌)。I期是浸潤性乳腺癌的早期階段。腫瘤直徑不超過2厘米。癌細胞尚未超出乳腺擴散。II期腫瘤包括直徑不超過2厘米但已擴散到腋下淋巴結的腫瘤、2至5厘米且可能已擴散到腋下淋巴結的腫瘤，以及大于5厘米(2英寸)但尚未擴散到腋下淋巴結的腫瘤。III期是局部發(fā)展的癌。III期進一步被分成IIIA期、IIIB期和IIIC期。IV期是向遠處轉移的癌。腫瘤已擴散到身體的其他部位。早期階段的治療選擇不同于晚期選擇。已知許多類型的癌癥是由遺傳畸變即突變引起。突變的積聚和細胞控制功能的損失致使從正常組織學到早期癌前的進行性表型變化，如上皮內(nèi)瘤變(IEN)到日益嚴重的IEN到淺表癌以及最終到浸潤性疾病。該過程通常在幾年甚至幾十年內(nèi)相對緩慢地發(fā)生，雖然在一些情況下可能相對迅速。癌基因依賴是癌細胞對維持惡性表型的單一癌基因的連續(xù)活化或過表達的生理依賴。這種依賴發(fā)生于標志腫瘤進程的其它變化的環(huán)境中。長時期發(fā)展成浸潤性癌癥提供了臨床干預的時機。因此，重要的是鑒定指征癌前疾病的生物標志物，以便可以采取治療措施預防或延緩浸潤性癌癥發(fā)展。簡述本發(fā)明一方面涉及監(jiān)測個體中乳腺疾病的方法。所述方法包括測定獲自個體乳腺的細胞中配對盒2基因(Paired Box 2 gene)-比-β防御素-I基因(ΡΑΧ2-比-DEFB1)表達率，其中所述ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率與乳腺疾病相關并且能用作確定治療進程的預示物。在一實施方案中，ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率為100 I或更高是個體存在乳腺癌的指征，而ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率小于100 I是個體存在非癌或癌前乳腺疾病的指征。在另一實施方案中，所述測定步驟包括測定相對于對照基因表達水平的ΡΑΧ2基因表達水平；測定相對于同一對照基因表達水平的DEFBl基因表達水平；以及基于ΡΑΧ2和DEFBl的表達水平確定ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率。在一實施方案中，所述方法還包括測定獲自患有乳腺疾病的乳腺組織的細胞中雌激素受體/孕激素受體/人表皮生長因子受體2 (ER/PR/HER2)的狀態(tài)。本發(fā)明另一方面涉及用于監(jiān)測乳腺疾病的試劑盒。在一實施方案中，用于監(jiān)測乳腺疾病的試劑盒包含用于檢測組織樣品中PAX2表達的一對或多對寡核苷酸引物，用于檢測組織樣品中DEFBl表達的一對或多對寡核苷酸引物，以及如何利用所述引物測定組織樣品中PAX2-比-DEFBl表達率的說明書。在另一實施方案中，用于檢測PAX2表達的一對或多對寡核苷酸引物包括選自以下的寡核苷酸引物對SEQ ID NOS :43和47，SEQ ID NOS :44和48和SEQ ID N0S:45和49。在另一實施方案中，用于檢測DEFBl表達的一對或多對寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS 35和37。在另一實施方案中，所述試劑盒還包含一對或多對對照寡核苷酸弓I物。在一實施方案中，所述一對或多對對照寡核苷酸引物包括用于檢測β_肌動蛋白表達的寡核苷酸引物。在優(yōu)選實施方案中，所述用于檢測肌動蛋白表達的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS 34 和 36。在另一實施方案中,所述一對或多對對照寡核苷酸引物包括用于檢測GAPDH表達的寡核苷酸引物。在優(yōu)選實施方案中，所述用于檢測GAPDH表達的寡核苷酸引物包括SEQID NOS 42 和 46。在另一相關實施方案中，所述試劑盒還包含用于PCR反應的一種或多種試劑。在又一相關實施方案中，所述試劑盒還包含用于RNA提取的一種或多種試劑。在另一實施方案中，用于監(jiān)測乳腺疾病的試劑盒包含具有用于檢測ΡΑΧ2和DEFBl表達的寡核苷酸探針的寡核苷酸微陣列，以及如何利用所述寡核苷酸微陣列測定ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率的說明書。在相關實施方案中，所述試劑盒還包含用于從組織樣品中提取RNA的試劑。本發(fā)明另一方面涉及確定用于患有乳腺疾病的個體的治療方案的方法。所述方法包括以下步驟測定獲自所述患有乳腺疾病個體的乳腺組織的細胞中相對于對照基因表達水平的ΡΑΧ2基因表達水平，以及基于ΡΑΧ2基因的相對表達水平確定用于所述個體的治療方案。附圖簡要說明并入和組成本說明書一部分的附圖闡述了所公開方法和組合物的幾種實施方案，并與本部分說明一起用于說明所公開方法和組合物的原理。圖I給出β -防御素-I (DEFBl)表達的定量RT-PCR(QRT-PCR)分析。為驗證誘導DEFBl表達，進行QRT-PCR。圖IA給出比較來自經(jīng)過根治性前列腺切除術的6名患者的臨床樣品中的DEFBl相對表達水平。圖IB給出在DEFBl誘導之前和之后比較良性和惡性前列腺臨床樣品、hPrEC細胞和前列腺癌細胞系中的DEFBl相對表達水平。圖IC給出分析單個組織切片中良性組織、惡性組織和前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)中的DEFBl相對表達水平。圖ID給出比較一名患者中良性組織、惡性組織和PIN中的DEFBl表達與良性組織中存在的平均DEFBl表達水平。圖2給出DEFBl誘導膜完整性和細胞形態(tài)變化的顯微鏡分析。通過相差顯微鏡分析DEFBl誘導48小時之后的DU145、PC3和LNCaP的細胞形態(tài)。黑色箭頭指示膜波動，白色箭頭指示凋亡小體。圖3給出前列腺癌細胞中DEFBl的細胞毒性分析。用PonA處理前列腺細胞系DU 145、PC3和LNCaP來誘導DEFBl表達1_3天，之后進行MTT檢測以確定細胞活力。結果表示為平均值土標準偏差，η = 9。
圖4給出由DEFBl誘導DU145和PC3細胞的細胞死亡。誘導前列腺癌細胞系DU145 (A)和PC3⑶中的DEFBl表達，然后經(jīng)過膜聯(lián)蛋白V/FITC/碘化丙啶染色和流式細胞儀分析。碘化丙啶和膜聯(lián)蛋白V陽性細胞被認為是凋亡的。各圖下方給出誘導時間。對于每個時間點，框旁邊的數(shù)字表示碘化丙啶(PD-膜聯(lián)蛋白V+細胞(右下象限)，以及PI+膜聯(lián)蛋白V+細胞(右上象限)的百分比。數(shù)據(jù)來自代表三個獨立試驗的單次試驗。圖5給出DEFBl誘導之后的泛-半胱天冬酶(pan-caspase)分析。DU145和PC3細胞用FAM-VAD-FMK-標記的氟甲基酮染色來檢測半胱天冬酶活性。DIC下可見每種條件下的細胞。共聚焦顯微鏡分析顯示對照DU145(B)、PC3細胞(F)和LNCaP細胞(J)中沒有半胱天冬酶染色。用PonA處理細胞24小時誘導DEFBl顯示DU145 (D)和PC3 (H)中的半胱天冬酶活性。LNCaP(L)中未檢測到半胱天冬酶活性。圖6給出PAX2 siRNA處理之后配對盒同源基因2 (PAX2)蛋白表達的沉默。圖6A給出用PAX2 siRNA雙螺旋轉染的PC3和DU145細胞在第O日(泳道I)、第2日(泳道2) 和第4日(泳道3)的Western印跡分析。圖6B給出用PAX2 siRNA雙螺旋轉染的PC3和DU145細胞在第O日(泳道I)、第2日(泳道2)、第4日(泳道3)和第6日(泳道4)的Western印跡分析。早在處理4日(泳道3)之后DU145細胞中不能檢測到PAX2蛋白，處理6日之后PC3細胞中不能檢測到PAX2蛋白。將印跡清除并重新探測作為內(nèi)參的β-肌動蛋白。圖7給出對用ΡΑΧ2 siRNA處理之后的前列腺癌細胞生長的分析。于第6日通過相差顯微鏡分析存在于正常生長培養(yǎng)基中的DU145、PC3和LNCaP。用陰性對照siRNA處理對細胞沒有影響。然而，用PAX2 siRNA處理之后顯著減少全部三種細胞系的細胞數(shù)量。圖8給出對siRNA沉默PAX2之后的細胞死亡的分析。用O. 5μ g的四種PAX2 siRNA或四種非特異的對照siRNA池處理前列腺癌細胞系PC3、DU145和LNCaP 2、4或6天之后，進行MTT檢測以測定細胞活力。結果表示為平均值土標準偏差，η = 9。圖9給出對半胱天冬酶活性的分析。用ΡΑΧ2 siRNA處理之后，用羧基熒光素標記的氟甲基酮染色DU145、PC3和LNCaP細胞來檢測半胱天冬酶活性。未處理和處理的細胞的共聚焦顯微鏡分析顯示，細胞用DIC可見。熒光下分析顯示，對照DU145(B)、PC3細胞(F)和LNCaP細胞(J)無半胱天冬酶染色。然而，用PAX2 siRNA處理的細胞誘導DU145⑶、PC3⑶和LNCaP (L)中的半胱天冬酶活性。

圖10給出對PAX2 siRNA處理之后的凋亡因子的分析。比較未處理對照細胞和用PAX2 siRNA處理6日的細胞中促凋亡因子表達的變化。圖IOA顯示Bcl_2_相關X蛋白(BAX)表達水平在DU145、PC3和LNCaP中增加。圖IOB顯示BH3結構域凋亡誘導蛋白(BID)表達在DU145和LNCaP中增加，但在PC3中改變。圖IOC顯示Bcl_2_相關死亡促進因子(BAD)表達水平在全部三種細胞系中均增加。圖11給出PAX2與DNA識別序列結合的模型。PAX2轉錄阻遏物結合到直接鄰近DEFBl TATA盒的CCTTG (SEQ ID NO : I)識別位點，從而阻止轉錄和DEFBl蛋白表達。PAX2蛋白表達的抑制允許正常DEFBl表達。圖12顯示DEFBl報告構建體。將來自DU145細胞的由mRNA起始位點上游前160個堿基組成的DEFBl啟動子進行PCR擴增，并連接到pGL3熒光素酶報告質(zhì)粒。圖13 給出抑制 PAX2 導致 DEFBl 表達。用 PAX2 siRNA 處理 DU145、PC3、LNCaP 和HPrEC 48小時。處理之前的QRT-PCR分析顯示DU145、PC3和LNCaP中沒有DEFBl表達。然而，處理之后全部細胞系中的DEFBl表達恢復。siRNA處理之后PAX2-缺失的HprEC中的DEFBl表達沒有變化。圖14給出抑制PAX2導致DEFBl啟動子活性增強。產(chǎn)生PC3啟動子/pGL3和DU145啟動子/PGL3構建體，并分別轉染至PC3和DU145細胞。比較由siRNA處理抑制PAX2之前和之后的啟動子活性。處理之后，DU145中的DEFBl啟動子活性增強2. 65倍，PC3中增強
3.78 倍。圖15給出PAX2與DEFBl啟動子結合的ChIP分析。對DUI45和PC3細胞進行ChIP分析。用抗-PAX2抗體免疫沉淀之后，進行PCR以檢測含有GTTCC (SEQ ID NO 2) PAX2識別位點的DEFBl啟動子區(qū)。這證實前列腺癌細胞系中的PAX2轉錄阻遏物與DEFBl啟動子結 八
口 ο圖16給出PrdPD和PrdHD與DNA的預測結構。將PrdPD結合至DNA (Xu et al.，1995)和PrdHD結合至DNA (Wi I son et al.，1995)的結構的協(xié)同用于構建兩個結構域結合至PHO位點的模型。各結合位點以所示的特定的方向彼此鄰接。RED結構域基于PrcPD晶體結構定向。圖17給出不同配對結構域共有序列的比較。在圖頂部示出Prd-配對-結構域土DNA復合物晶體學分析中所描述的蛋白土DNA接觸的示意圖?？湛蛑甘睛?螺旋，陰影框指示折疊，以及粗線指示轉角。接觸的氨基酸由單字母代碼給出。僅給出直接接觸的氨基酸土堿基?？杖χ甘敬鬁辖佑|，而紅箭頭指示小溝接觸。該示意圖是配對結構域蛋白所有已知共有序列的比對(僅給出正義鏈)。共有序列之間的垂直線指示保守的堿基對。位置編號在圖底部給出。圖18給出靶向ΡΑΧ2作為化學預防性策略。異常的ΡΑΧ2表達是癌癥開始和發(fā)展的早期事件。發(fā)育異常過程中或其它癌前階段抑制ΡΑΧ2可以用于癌癥預防。圖19給出血管緊張素II (Ang II)對DU145細胞中ΡΑΧ2表達的影響。為測定AngII對ΡΑΧ2表達的影響，處理之后監(jiān)測DEFBl蛋白水平。此時ΡΑΧ2表達水平早在4小時就增加并且持續(xù)到48小時。圖20Α給出洛沙坦(Los)對DU145細胞中ΡΑΧ2表達的影響。用血管緊張素11_1型受體(ATRl)阻斷劑洛沙坦處理DU145細胞。QRT-PCR顯示處理之后ΡΑΧ2信息水平降低至少一半。圖20Β給出血管緊張素ΙΙ-2型受體(ATR2)阻斷劑對DU145細胞中ΡΑΧ2表達的影響。為測定ATR2受體對ΡΑΧ2表達的影響，用ATR2受體阻斷劑TO123319處理DU145細胞。此時，ΡΑΧ2表達增加7至8倍。圖21給出Los阻斷AngII對DU145細胞中ΡΑΧ2表達的影響。用5 μ M AngII處理DU145細胞72小時導致ΡΑΧ2表達增加2倍。此外，用10 μ M處理72小時導致表達增加超過3倍。用5 μ M洛沙坦處理細胞阻抑增殖50%。此外，在用AngII處理之前用洛沙坦處理30分鐘阻斷AngII對增殖的影響。圖22給出AngII增加DU145細胞增殖。用5 μ M AngII處理DU145細胞72小時導致增殖增加2倍。此外，用10 μ M處理72小時導致增殖增加超過3倍。圖23給出Los和MAP激酶抑制劑對DU145細胞中ΡΑΧ2表達的影響。圖23Α顯示用洛沙坦處理DU145細胞阻抑磷酸化-ERK1/2和ΡΑΧ2表達；圖23Β顯示MEK激酶抑制劑和AICAR阻抑PAX2蛋白表達；圖23C給出MEK激酶抑制劑和洛沙坦阻抑磷酸化-STAT3蛋白表達。圖24給出Los和MEK激酶抑制劑對DU145細胞中PAX2活化的影響。圖24A顯示用ATlR信號轉導抑制劑處理DU145細胞導致磷酸化-PAX2蛋白(其為PAX2的活化形式)水平降低。此外，用AMP激酶誘導劑AICAR處理導致阻抑PAX2表達。圖24B顯示用Los抑制ATlR信號轉導降低磷酸化-JNK水平。然而，AngII增加磷酸化-JNK蛋白水平。圖25給出AngII在hPrEC細胞中增加PAX2表達而降低DEFBl表達。為測定AngII對hPrEC中PAX2水平的影響，處理細胞72和96小時，并通過QRT-PCR檢測PAX2和DEFBl表達。此時，AngII處理導致PAX2顯著增加至與PC3前列腺癌細胞相似的水平。相反地，AngII處理之后顯著降低DEFBl表達。圖26給出AngII信號轉導和PAX2前列腺癌的示意圖。前列腺癌細胞中的PAX2表達由ATlR信號轉導通路調(diào)控。具體地，MEK激酶信號轉導級聯(lián)致使PAX2表達增加。此夕卜，ATlR和AngII通過JNK上調(diào)PAX2活化作用。圖27給出阻斷PAX2表達作為前列腺癌療法的示意圖。圖27A給出PAX2表達由ATlR信號轉導通路調(diào)控。抑制PAX2表達導致DEFBl重新表達和癌細胞死亡。圖27B給出阻斷AT1R，下游激酶或直接抑制PAX2的化合物提供治療前列腺癌的新方法。圖28給出用Gleason評分對DEFBl和PAX2表達的比較。比較來自經(jīng)過根治性前列腺切除術的6名患者的良性臨床樣品中DEFBl相對表達水平。此時Gleason評分與鄰近良性前列腺組織中DEFBl表達水平負相關。相對DEFBl表達水平大于O. 005的患者的Gleason評分為6。然而,表達水平小于O. 005的患者的Gleason評分為7。圖29給出PAX2-DEFB1比值作為前列腺癌發(fā)展的預測因子。對激光捕獲顯微切割(LCM)的前列腺組織切片進行QRT-PCR以測定相對DEFBl和PAX2表達水平。從正常到PIN到癌癥，DEFBl表達水平降低。然而，從正常到PIN到癌癥，PAX2表達增加。此外，Gleason評分為6的癌癥患者#1457的正常組織和PIN中相對Gleason評分為7的癌癥患者#1569具有更多的DEFB1。相反地，患者#1569的癌區(qū)域與患者#1457相比具有更高的PAX2水平。圖30給出Donald預測因子(DPF)是基于相對PAX2-DEFB1表達比值。提高前列腺組織的DPF增加了發(fā)展前列腺癌的機會?；贒PF，PAX2-DEFB1比值為O至39的組織是正常的(良性)?；贒PF量表，PAX2-DEFB1比值為40至99的組織代表PIN(癌前)。最后，PAX2-DEFB1比值為100至500的組織是惡性的(低于高級別癌癥)。圖31給出對人前列腺組織中hBD-Ι表達的分析。將來自經(jīng)過根治性前列腺切除 術的患者的正常臨床樣品中的hBD-Ι相對表達水平進行比較。虛線用作比較從粗略切割和LCM的樣本獲得的值的參考點，并且相應的Gleason評分在各誤差棒上方示出。圖31A給出比較由粗略切割獲得的組織中的hBD-Ι表達水平。圖31B給出比較由激光捕獲顯微切割獲得的組織中的hBD-Ι表達水平。圖32給出對前列腺細胞系中hBD-Ι表達的分析。圖32A給出與hPrEC細胞相比，在hBD-Ι誘導之前和之后前列腺癌細胞系中的hBD-Ι表達水平。一個星號代表相比hPrEC統(tǒng)計學更高的表達水平。兩個星號代表相比hBD-Ι誘導之前的細胞系統(tǒng)計學顯著的表達水平(學生t-檢驗，P < O. 05)。圖32B給出通過免疫細胞化學證實前列腺癌細胞系DU145中的異常hBD-Ι表達。將hPrEC細胞對hBD-1進行染色作為陽性對照(a :DIC和b :熒光)。用hBD-Ι轉染DU145細胞并誘導18小時(c =DIC和d :熒光)。比例尺=20 μ M0圖33給出前列腺癌細胞中hBD-Ι的細胞毒性分析。用Pon A處理前列腺細胞系DU145、PC3、PC3/AR+和LNCaP來誘導hBD-Ι表達1_3天，之后進行MTT測定以確定細胞活力。每個誤差棒代表一式三份進行三個獨立試驗的平均值土標準誤。圖34給出正常、PIN和腫瘤的LCM人前列腺組織切片中hBD_l和cMYC表達的QRT-PCR分析。每種基因的表達表示為與β-肌動蛋白相比的表達率。圖34Α給出正常、PIN和腫瘤切片中hBD-Ι表達水平的比較。圖34Β給出正常、PIN和腫瘤切片中cMYC表達水平的比較。圖35給出用siRNA敲低PAX2之后的hBDl表達的QRT-PCR分析。hBD-Ι表達水平表示為與肌動蛋白相比的表達率。星號代表與PAX2siRNA處理之前的細胞系相比統(tǒng)計學更高的表達水平(學生t-檢驗，P < O. 05)。圖36給出PAX2 siRNA處理之后的PAX2蛋白表達的沉默。圖36A給出通過Western印跡分析檢測HPrEC前列腺原代細胞(泳道I)以及DU145 (泳道2)、PC3 (泳道3)和LNCaP (泳道4)前列腺癌細胞中的PAX2表達。將印跡清除并重新探測作為內(nèi)參的β -肌動蛋白，以確保等量上樣。圖36Β給出用ΡΑΧ2 siRNA雙螺旋感染之后DU145、PC3和LNCaP的Western印跡分析,全部證實PAX2表達敲低。同樣地，將印跡清除并重新探測作為內(nèi)參的肌動蛋白。圖37給出對用ΡΑΧ2 siRNA處理之后的前列腺癌細胞生長的分析。在陰性對照非特異siRNA存在下，于第6日通過相差顯微鏡分析HprEC(A)、LNCaP(C)、DU145 (E)和PC3 (G) ο用PAX2 siRNA處理之后，DU145 00、PC3 (F)和LNCaP(H)的細胞數(shù)量顯著減少。然而，似乎對HprEC(B)沒有影響。比例尺=20 μ m。圖38給出對siRNA沉默PAX2之后的細胞死亡的分析。用PAX2siRNA或非特異的陰性對照siRNA處理前列腺癌細胞系PC3、DU145和LNCaP 2、4或6日之后，進行MTT測定。PAX2的敲低導致全部三種細胞系中的相對細胞活力降低。結果表示為平均值土標準偏差，η = 9。圖39給出對半胱天冬酶活性的分析。用ΡΑΧ2 siRNA處理之后，DU145、PC3和LNCaP細胞用羧基熒光素標記的氟甲基酮染色來檢測半胱天冬酶活性。熒光下分析顯示對照DU145(A)、PC3細胞(C)和LNCaP細胞(E)中沒有半胱天冬酶染色。然而，用PAX2 siRNA處理的細胞中，在DU145(B)、PC3(D)和LNCaP(F)中誘導半胱天冬酶活性。比例尺=20μπι。圖40給出對ΡΑΧ2 siRNA處理之后的凋亡因子的分析。比較未處理的對照細胞和用PAX2 siRNA處理6天的細胞中促凋亡因子表達的變化。圖40A顯示在PAX2敲低之后的DU145、PC3和LNCaP中，BAD表達增加。圖40B顯示BID表達水平在LNCaP和DU145中增力口，但在PC3細胞中未增加。圖40C顯示AKT表達在LNCaP和DU145中降低。然而，PAX2敲低之后的PC3細胞中的AKT表達沒有變化。結果表示為平均值土標準偏差，η = 9。星號代表統(tǒng)計學差異(P < O. 05)。詳述除非另外限定，本文所使用的全部技術和科學術語具有與所公開的方法和組合物所屬領域的技術人員通常的理解相同的含義。必須注意的是，除非上下文清楚地另外指明， 本文和所附權利要求書所使用的“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括復數(shù)。因此，例如對于“一肽(a P印tide)”包括多種這樣的肽，對于“所述肽”是指一種或多種肽及本領域技術人員所了解的其等同物等。本發(fā)明一方面涉及監(jiān)測癌癥發(fā)展的方法。在某些實施方案中，所述方法涉及監(jiān)測個體前列腺或乳腺的癌前狀態(tài)(如上皮內(nèi)瘤變)及癌癥狀態(tài)。所述方法包括測定獲自個體的前列腺或乳腺細胞中配對盒2基因-比-β -防御素-I基因(ΡΑΧ2-比-DEFB1)表達率，其中所述ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率與前列腺或乳腺疾病相關?；虮磉_率可以在mRNA水平(例如通過RT-PCR或寡核苷酸陣列)測定，或在蛋白水平(例如通過蛋白免疫印跡雜交或抗體陣列)測定。在某些實施方案中，PAX2-比-DEFBl表達率在mRNA水平測定，并且在說明書中被稱為“Donald預測因子”或“DPF”。在某些實施方案中，將前列腺的PAX2-比-DEFBl表達率(在RNA水平側測定)用 于區(qū)別個體中正常、癌前和癌性的前列腺狀態(tài)。在一實施方案中，PAX2-比-DEFBl比值為小于40 : I是正常前列腺狀態(tài)的指征，PAX2-比-DEFBl比值為至少40 I至小于100 I是前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)的指征，而PAX2-比-DEFBl比值為至少100 I是前列腺癌的指征。還提供了用于診斷個體中前列腺癌的方法。所述方法包括檢測來自個體的前列腺細胞中PAX2和β-防御素(DEFBl)的水平，其中所述ΡΑΧ2比DEFBl比值為至少100 I。還提供了診斷個體中前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)的方法。所述方法包括檢測來自個體的前列腺細胞中PAX2和β DEFBl的水平，其中所述PAX2比DEFBl的比值為至少40 I并小于100 I。在某些另外的實施方案中，將乳腺的ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率(在RNA水平)用于區(qū)別個體中非癌(良性和/或癌前)和癌性乳腺疾病。在一實施方案中，ΡΑΧ2-比-DEFBl的比值為小于100 I是非癌(正常)和/或癌前(乳腺上皮內(nèi)瘤變(MIN))的指征，而ΡΑΧ2-比-DEFBl比值為至少100 I是乳腺癌的指征。還提供了用于診斷個體中乳腺癌的方法。所述方法包括檢測來自個體的乳腺細胞中ΡΑΧ2和DEFBl的水平，其中ΡΑΧ2比DEFBl比值為至少100 I是個體中乳腺癌的指征。還提供了用于診斷個體中非癌乳腺疾病(正常和/或MIN)的方法。所述方法包括檢測來自個體的乳腺細胞中ΡΑΧ2和DEFBl的水平，其中ΡΑΧ2-比-DEFBl比值為小于100 I是個體非癌乳腺疾病的指征。在一實施方案中，所述方法還包括測定獲自具有乳腺疾病的乳腺組織的細胞中雌激素受體/孕激素受體(ER/PR)的狀態(tài)。為了確定個體中的乳腺疾病，乳腺組織的ER/PR狀態(tài)可以與同一組織的ΡΑΧ2-比-DEFBl比值組合使用。以下所使用的術語“乳腺上皮內(nèi)瘤變”包括小葉上皮內(nèi)瘤變和乳腺導管上皮內(nèi)瘤變。本發(fā)明的監(jiān)測和診斷方法向臨床醫(yī)生提供了啟動或癌前組織的預示物。該檢測的候選者包括處于癌癥高風險的患者(基于年齡、種族)。作為診斷，陽性或陰性ΡΑΧ2測試之后可以通過用生物標志物的其它篩選來確定癌癥位置。此外，這些患者可以是用ΡΑΧ2/DEFBl調(diào)節(jié)劑治療的候選者。可選擇地，該測試可以用于患者(即那些具有三陰性乳腺癌的患者)，作為她們癌癥治療效果的測量標準，以確定治療進程或監(jiān)測癌癥復發(fā)。
作為另一實例，存在癌癥的潛在指示物(如臨床醫(yī)生在直腸指診過程中發(fā)現(xiàn)前列腺的節(jié)結)的患者或者那些經(jīng)歷PSA突然增加的患者通常處于“觀察等待(WatchfulWaiting)”狀態(tài)。通常很難確定這些患者是否患有癌癥或?qū)l(fā)展成癌癥。檢測來自這些患者的樣品(如血漿/血清)中PAX2-比-DEFBl比值，可以用于輔助確定獲得疑似患有前列腺癌的男性的活組織檢查，這可以降低不必要的前列腺活組織檢查的數(shù)量減少并且可以更早地干預他們的疾病。前列腺癌前列腺癌篩選目前由直腸檢查和前列腺特異抗原(PSA)水平的測量組成。這些方法缺少特異性，因為直腸指診在檢測者之間有相當大的可變性，而PSA水平可能在良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎和其他疾病中提高。前列腺癌可以利用Gleason系統(tǒng)進行評分(Gleason, et al. 1966)。這利用組織構造而非細胞學特征。使用級別I至5(由好至差來區(qū)分)，并且結合損傷最頻繁和更嚴重區(qū)域的組合評分。除評估腫瘤階段(分期)之外，Gleason評分提供的預測信息可能是有價值的。2至4和8至10的Gleason評分具有良好的預測值，但是大約四分之三的腫瘤具有中間值。兩種主要系統(tǒng)用于前列腺癌分期TNM系統(tǒng)和Jewett系統(tǒng)(Benson&Olsson, etal. 1989)。分期考慮了腫瘤的任何轉移性擴散并且很困難，因為很難評估局部的淋巴結轉移或局部浸潤。腫瘤大小也很難測量，因為不能通過肉眼區(qū)分腫瘤組織與正常前列腺組織，而且因為前列腺沒有明顯的包膜且由纖維脂肪組織層環(huán)繞。前列腺腫瘤的(T)分期描述為從Tl至T4的四類。對于Tl，癌癥是顯微鏡可見的，單側的且不可觸知的。醫(yī)生不能感覺到腫瘤或用成像如經(jīng)直腸超聲看見腫瘤。對BPH的治療可顯露該疾病，或者通過使用穿刺活組織檢查來證實，因為PSA提高。對于T2，醫(yī)生可以用DRE感覺到腫瘤。該疾病似乎限于前列腺的腺體的一側或兩側。對于T3，腫瘤已發(fā)展到腺體外部鄰近的組織。對于T4，腫瘤已擴散到身體的其他部位。因此，目前的篩選方法不能令人滿意；沒有診斷前列腺癌或者預測或防止其可能的轉移性擴散的可靠方法是導致大部分患者死亡的主要原因。乳腺癌普遍用于乳腺癌篩選的方法包括自我和臨床乳腺檢查，X-射線乳腺攝影以及乳腺磁共振成像(MRI)。乳腺癌篩查的最新技術是超聲計算機斷層成像術，其利用聲波形成三維圖像并且乳腺癌在不用X-射線乳腺攝影中所用的危險放射線的情況下檢測乳腺癌。還可以使用基因測試。用于乳腺癌的基因測試一般包括測試BRCA基因中的突變。這除了對那些有提高乳腺癌風險的患者，通常是不推薦的技術。女性死亡的主要原因，乳腺癌的發(fā)生率，在美國過去這三十年逐漸增加。雖然乳腺癌的發(fā)病機理尚不清楚，但是正常乳腺上皮細胞轉化成惡性表型可能是遺傳因素的結果，尤其是 30歲以下的女性(Miki et al.，1994，Science, 266 :66_71)。最近，BRCAl 和 BRCA2的發(fā)現(xiàn)和表征已擴大了我們對能促進家族乳腺癌的遺傳因素的理解。這兩個基因座內(nèi)的生 殖細胞系突變與50-85 %的乳腺癌和/或卵巢癌的終身風險相關(Casey，1997，Curr. Opin.Oncol. 9 88-93 ；Marcus et al，1996，Cancer 77:697-709)。然而，其它非遺傳因素很可能對該疾病的病因也具有重大影響。無論其起因是什么，如果在其進程早期未被檢測到，那么乳腺癌發(fā)病率和死亡率會顯著增加。因而，大量工作已集中于乳腺組織的細胞轉化和腫瘤形成的早期檢測上。目前，鑒定乳腺癌的主要方式是通過檢測致密腫瘤組織的存在。這可以通過直接檢查乳腺外部或通過乳腺攝影或其它X-射線成像方法來實現(xiàn)不同程度的效力(Jatoi，1999，Am. J. Surg. 177 :518_524)。然而，后面的方法有相當大的代價。每當進行乳腺攝影時，患者承受測試過程中所使用的放射線的電離特性所誘導的較小的患有乳腺腫瘤的風險。此夕卜，該方法昂貴并且技術員的主觀解釋可能導致不精確，例如，一項研究表明，對于由所調(diào)查的一組放射科醫(yī)生單獨解釋的一組乳腺影像，大約三分之一存在主要臨床分歧。此外，許多女性感到進行乳腺攝影是痛苦的經(jīng)歷。因此，國家癌癥研究所并不推薦50歲以下的女性進行乳腺攝影，因為與年紀較大的女性相比，該群體發(fā)展成乳腺癌的可能性較低。然而，引人注意的是，雖然50歲以下的女性僅有約22%發(fā)生乳腺癌，但數(shù)據(jù)顯示絕經(jīng)前女性的乳腺癌更具侵襲性。 PAX2PAX基因是編碼核轉錄因子的九個發(fā)育調(diào)控基因家族。它們在胚胎發(fā)生中起重要作用，并且以非常有序的時空模式表達。它們?nèi)堪幋aDNA結合結構域的384個堿基對區(qū)域的“配對盒”區(qū)，所述“配對盒”區(qū)在整個進化過程中是高度保守的(Stuart，ET, etal. 1994)。通過許多可直接歸因于Pax基因的雜合不足的天然鼠和人類綜合癥已證實Pax基因?qū)Πl(fā)育過程的影響。Dressier等(1990)已給出PAX2序列。人PAX2蛋白及其變體的氨基酸序列，以及編碼這些蛋白的DNA序列列于SEQ ID NOS 58-69 (SEQ ID NO :58，由人PAX2基因的外顯子I編碼的氨基酸序列；SEQ ID NO :59，人PAX2基因啟動子和外顯子I ;SEQ ID NO :60，人PAX2 的氨基酸序列；SEQ ID NO :61，人PAX2 基因；SEQ ID N0:62，人PAX2基因變體b的氨基酸序列；SEQ ID NO :63，人PAX2基因變體b ；SEQ IDNO :64，人PAX2基因變體c的氨基酸序列；SEQ ID NO :65，人PAX2基因變體c ;SEQ ID NO :66，人PAX2基因變體d的氨基酸序列；SEQ IDNO :67，人PAX2基因變體d ；SEQ ID NO :68，人PAX2基因變體e的氨基酸序列；SEQ ID NO :69，人PAX2基因變體e)。已檢測PAX2表達的癌癥的例子列于表I。表I :表達PAX2的癌癥
權利要求
1.用于監(jiān)測個體中乳腺疾病的方法，所述方法包括 測定獲自所述個體乳腺的細胞中配對盒2基因-比-β -防御素-I基因(ΡΑΧ2-比-DEFB1)的表達率， 其中所述ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率與乳腺疾病相關。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率為100 I或更高是個體中存在乳腺癌的指征，而ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率小于100 I是個體中存在非癌或癌前乳腺疾病的指征。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述癌前乳腺疾病是乳腺上皮內(nèi)瘤變。
4.如權利要求I所述的方法，其中所述測定步驟包括 測定相對于對照基因表達水平的ΡΑΧ2基因表達水平； 測定相對于同一對照基因表達水平的DEFBl基因表達水平；以及 基于ΡΑΧ2和DEFBl的表達水平確定ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述ΡΑΧ2、DEFBl和對照基因的表達水平通過定量實時RT-PCR測定。
6.如權利要求4所述的方法，其中所述ΡΑΧ2、DEFBl和對照基因的表達水平通過表達微陣列測定。
7.如權利要求4所述的方法，其中所述對照基因是3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因。
8.如權利要求I所述的方法，其還包括測定獲自乳腺組織的細胞中雌激素受體/孕激素受體/人表皮生長因子受體2 (ER/PR/HER2)的狀態(tài)。
9.用于監(jiān)測個體中乳腺疾病的試劑盒，所述試劑盒包含 用于檢測組織樣品中ΡΑΧ2表達的一對或多對寡核苷酸引物； 用于檢測組織樣品中DEFBl表達的一對或多對寡核苷酸引物；以及 如何利用所述引物測定組織樣品中ΡΑΧ2-比-DEFBl表達率的說明書。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其中所述用于檢測ΡΑΧ2表達的一對或多對寡核苷酸引物包括選自以下的寡核苷酸引物對SEQ ID NOS:43和47，SEQ ID N0S:44和48，以及SEQ ID NOS 45 和 49。
11.如權利要求9所述的試劑盒，其中所述用于檢測DEFBl表達的一對或多對寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS 35和37。
12.權利要求9所述的試劑盒，其還包含一對或多對對照寡核苷酸引物。
13.如權利要求12所述的試劑盒，其中所述一對或多對對照寡核苷酸引物包括用于檢測β_肌動蛋白表達的寡核苷酸引物。
14.如權利要求13所述的試劑盒，其中所述用于檢測β_肌動蛋白表達的寡核苷酸引物包括 SEQ ID NOS 34 和 36。
15.如權利要求12所述的試劑盒，其中所述一對或多對對照寡核苷酸引物包括用于檢測GAPDH表達的寡核苷酸引物。
16.如權利要求15所述的試劑盒，其中所述用于檢測GAPDH表達的寡核苷酸引物包括SEQ ID NOS 42和 46。
17.如權利要求9所述的試劑盒，其還包含用于PCR反應的一種或多種試劑。
18.如權利要求9所述的試劑盒，其還包含用于RNA提取的一種或多種試劑。
19.用于監(jiān)測個體中乳腺疾病的試劑盒，所述試劑盒包含 具有用于檢測PAX2和DEFBl表達的寡核苷酸探針的寡核苷酸微陣列；以及 如何利用所述寡核苷酸微陣列測定組織樣品中PAX2-比-DEFBl表達率的說明書。
20.如權利要求19所述的試劑盒，其還包含用于從組織樣品中提取RNA的試劑。
21.確定用于患有乳腺疾病的個體的治療方案的方法，所述方法包括 測定獲自所述患有乳腺疾病的個體的乳腺組織的細胞中相對于對照基因表達水平的PAX2基因表達水平，以及 基于PAX2基因的相對表達水平確定用于所述個體的治療方案。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述對照基因是肌動蛋白基因或GAPDH基因。
23.如權利要求21所述的方法，其中所述乳腺疾病是雌激素受體陰性乳腺癌，和/或孕激素受體陰性乳腺癌，和/或人表皮生長因子受體2陰性乳腺癌。
24.如權利要求21所述的方法，其中所述乳腺疾病是雌激素受體陽性乳腺癌，和/或孕激素受體陽性乳腺癌，和/或人表皮生長因子受體2陽性乳腺癌。
全文摘要
公開了用于監(jiān)測個體中乳腺疾病的方法。所述方法包括測定獲自個體乳腺的細胞中配對盒2基因-比-β-防御素-1基因(PAX2-比-DEFB1)的表達率(“Donald預測因子”或“DPF”)，其中所述PAX2-比-DEFB1表達率與乳腺疾病相關。還公開了用于監(jiān)測乳腺疾病和測定藥物抗性的試劑盒。
文檔編號C12N15/11GK102648287SQ200980161426
公開日2012年8月22日 申請日期2009年8月25日 優(yōu)先權日2009年8月24日
發(fā)明者卡爾頓·D·唐納德 申請人:菲吉尼克斯公司