專利名稱：雙酶體系制備l-叔亮氨酸類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于采用生物酶制劑拆分制備手性化合物的方法，尤其是指一種雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法。
背景技術(shù)：
L-叔亮氨酸(III)主要用作營養(yǎng)強(qiáng)化劑、動(dòng)物飼用添加劑，合成藥物。作為合成藥物中間體主要用于合成抗艾滋病(HIV)藥物阿扎那韋(Atazanavir)和山德士(Sandoz)，以及一些抗癌藥物、生物抑制劑及生物活性肽等。

抗HIV作用的蛋白酶抑制劑阿扎那韋是目前世界上主要的抗艾滋病藥物，僅在美國就已有約13萬名患者接受這種藥物的治療，該藥物的有效成分--“C-末端中間體”是合成強(qiáng)效的蛋白酶抑制劑阿扎那韋的重要中間體，具有持續(xù)強(qiáng)效抑制艾滋病病毒、低耐藥、用藥方便、對(duì)脂肪代謝副作用小的特點(diǎn)，2006年全球銷售額達(dá)到32. 26億美元。
阿扎那韋藥品目前仍屬于專利保護(hù)藥品，專利由施貴寶公司掌握，只授權(quán)少數(shù)幾家制藥公司生產(chǎn)。根據(jù)L-叔亮氨酸用于生產(chǎn)阿扎那韋的用量估計(jì)，預(yù)計(jì)今后幾年醫(yī)藥行業(yè)對(duì)該中間體的需求將迅速增加，阿扎那韋的專利將于2011年到期，屆時(shí)隨著藥品專利的失效，仿制藥生產(chǎn)廠家將大量出現(xiàn)，對(duì)L-叔亮氨酸的需求也將成倍增長。目前每年國內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)L-叔亮氨酸的需求量為10-15噸，預(yù)計(jì)5年后可增加至百噸。該產(chǎn)品今年預(yù)計(jì)可實(shí)現(xiàn)銷售收入1. 3億元，實(shí)現(xiàn)利稅2400-3600萬元。預(yù)計(jì)2011年將實(shí)現(xiàn)銷售收入3. 2億元，利稅約0. 9億元。
目前國內(nèi)外生產(chǎn)L-叔亮氨酸的生產(chǎn)方法主要有 (1)以3，3- 二甲基丁酸利用類似Leuckart反應(yīng)合成消旋產(chǎn)物，再用S-苯乙胺拆分得到(R)和(S)-叔完氨酸，收率較低(23% ),e. e.值為 95% (TetrahedronLett. 1997， 38,2153-2154)。(2)由光學(xué)活性的(R) _叔丁基甘氨醇出發(fā)，經(jīng)過氨基保護(hù)、氧化、氫化脫保護(hù)，得到L-叔亮氨酸·收率可達(dá)到64%, e. e.值大于99% (Pat. Appl，DE 19524338. 2)。 (3)在催化劑鄰羥苯亞甲基亞胺衍生物非金屬催化劑的存在下，HCN對(duì)亞胺的加成，得到的加成化合物，收率為88%，e. e.值為96%，重結(jié)晶后(e. e.值大于99% )，再經(jīng)過水解、脫甲酰化制得L-叔亮氨酸，收率可達(dá)84%, e. e.值大于99% (Org,Lett. 2000，2 (6)，867-870)。 通過不對(duì)稱合成方法可以得到好的光學(xué)產(chǎn)率，但因所用的催化劑價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。(4)在BuOH存在下，脂肪酶(Lipase)選擇性催化水解4-叔丁基-2-苯基吖內(nèi)酯， 生成的酯，先用蛋白酶(Alcalase)水解，以防逆反應(yīng)發(fā)生，再用酸水解斷鍵，得到L-叔亮氨酸，收率為 69%，e. e.值為 97% (Tetrahedron Lett. 1995，7，1113-1116)。(5)用 HC00NH4 作為NAD+的還原劑，在甲酯脫氫酶不可逆的氧化作用下，使NAD+轉(zhuǎn)變成NADH繼續(xù)循環(huán)使用岡，并且生成C02，得到L-叔亮氨酸的收率為85%，e. e值為99% (Meth. Enzymol, 1988， 136，34-45)。
目前德國Degussa公司采用生產(chǎn)工藝(5)，得到e. e.值達(dá)99%的L_叔亮氨酸，該工藝成熟，反映條件溫和。但是所使用的輔酶價(jià)格較貴，并且不易保存和回收，比較容易失活。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上問題，本發(fā)明提供一種基于采用生物酶制劑的雙酶體系動(dòng)力學(xué)拆分 N-?；辶涟彼犷惢衔镏苽涫中曰衔風(fēng)-叔亮氨酸類化合物的方法。該方法反應(yīng)條件溫和、收率高、環(huán)境友好、成本低。
一種雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，所述的方法為以式II所示的 N-?；辶涟彼犷惢衔镌陔p酶體系下，于水或緩沖溶劑中15-60°C下反應(yīng)制備式III所示手性L-叔亮氨酸類化合物，所述生物酶為?；被嵯?丙氨酸消旋酶)和水解酶的混合酶，其制備反應(yīng)方程式為
其中，X = (^，朋^殿風(fēng)力！^其中禮，&，民= (5直鏈，支鏈，一、二或者三鹵素取代的烷烴)的任一基團(tuán)。
所述水解酶為脂肪酶或酯酶。其中脂肪酶為lipase from Thermomyceslanuginosus, Lipase B from Candida antarctica, Lipase from Candide Rugosa (CRL) , Lipase PS "Amano " SD, Lipase AS "Amano，，，Lipase AK "Amano，，， LipaseAYS "Amano，，的一種或多種；酉旨醇為 Esterase from Escherichia coli. K12 (esterasefrom locus tag b3412)的一種或多種；所述的?；被嵯笧?Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus
tagNC00294I)。
進(jìn)一步的，所述式I化合物與混合酶的質(zhì)量之比為1 0. 005 0. 1。
進(jìn)一步的，所述緩沖溶劑為Tris鹽酸緩沖液、PBS磷酸緩沖溶液或者混合溶液，所述混合溶液為叔丁醇、乙醇、甲醇、丙酮或丁酮與水、Tris鹽酸緩沖液、PBS磷酸緩沖溶液任一種的混合液，體積比為1 20-1 2。
進(jìn)一步的，所述反應(yīng)溫度為15-60°C，控制反應(yīng)溫度波動(dòng)幅度為士5°C;所述反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為2-15小時(shí)。
5 進(jìn)一步的，所述反應(yīng)是以TLC小板跟蹤監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開劑是乙酸乙酯與石油醚體積比為1 2 5的混合試劑；通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)中新產(chǎn)生的點(diǎn)的濃度和剩下的點(diǎn)的濃度來判斷反應(yīng)終點(diǎn)。
進(jìn)一步的，所述反應(yīng)用液相監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，通過監(jiān)測(cè)液相色譜中式II化合物的形成和式I化合物的消失來判斷反應(yīng)終點(diǎn)。
進(jìn)一步的，所述反應(yīng)完畢后，用有機(jī)溶劑萃取產(chǎn)物，所使用的有機(jī)溶劑為乙醚、甲苯、氯苯、乙酸乙酯，異丙醚，正己烷，甲酸乙酯，環(huán)己烷之中的任一種。并且溶劑經(jīng)簡單處理后可以重復(fù)套用。
進(jìn)一步的，所述反應(yīng)體系中所使用的混合酶為消旋酶與酯(脂肪)酶的質(zhì)量之比為1 3-2 1 ；反應(yīng)完畢后，將緩沖溶液的pH值調(diào)節(jié)到前相同值，酶體系可重復(fù)使用。
進(jìn)一步的，所述反應(yīng)的是按照以下步驟進(jìn)行 a.將化合物(I)投放到水溶液中，然后加入助溶劑。再加入按照一定比例組成雙酶制劑。于搖床中或者動(dòng)力攪拌裝置中充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)。
b.按照化合物(I)混合酶制劑，質(zhì)量之比為1 0.0001-1 1進(jìn)行投料。
c.控制溫度于15 60°C進(jìn)行反應(yīng)，期間用TLC硅膠板或液相色譜進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)， 直至反應(yīng)基本進(jìn)行完畢；反應(yīng)完畢，用有機(jī)溶劑萃取反應(yīng)液。然后減壓除去有機(jī)溶劑，即可得到粗化合物(II)。
d.將反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)pH值于一定的值，可重復(fù)利用該反應(yīng)溶液。
本發(fā)明利用雙酶體系進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分叔亮氨酸得到單一手性L-叔亮氨酸的生產(chǎn)工藝，理論收率是100 %，S卩消旋叔亮氨酸可完全轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物。該工業(yè)能在室溫下進(jìn)行， 并且操作簡單，無污染，能顯著降低生產(chǎn)成本。該生產(chǎn)方法革除了原有工藝中使用有毒，有污染性的化學(xué)原料。基本無污染。通過酶工程技術(shù)可以改造酶制劑，使之能更加適合對(duì)特定底物的拆分。從而達(dá)到預(yù)計(jì)目標(biāo)。具有良好的技術(shù)應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化前景。
具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但保護(hù)的范圍并不僅限于此。
本專利所涉及到的脂肪酶購于天野酶制品公司(Amano Enzyme Inc. China)，酯酶和酰化氨基酸消旋酶由本申請(qǐng)單位實(shí)驗(yàn)室制備。其余反應(yīng)物及試劑均為市場(chǎng)購買所得。如未加特別說明，該方法所使用的生物酶均為游離酶粉末。
實(shí)施例1 將20mL PBS磷酸緩沖溶液(5mM，Ph = 8. 5)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料(I)(此處X = NH2) 3. 44g加入到錐形瓶中。繼續(xù)加入消旋酶Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus tag NC002947)禾口 CRL 共 0. 13g (二者質(zhì)量之比為2 1)，加入完畢，將溫度固定在35°C，搖床中反應(yīng)12小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完畢后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后將溶劑減壓出去，即可得到白色固體L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3_ 二甲基丁酰胺，收率 74%，純度 98%，e.e.值 96%。
L-2-氨基-3，3_ 二甲基丁酰胺[a ]D2。，+6. 4(c = 5 % in 5M HC1) ；1H NMR (400MHz, CDC13) 8 1. 03(9H) ,3. 24 (S, 1H)，5. 40(S，2H)，6. 98(S，2H). 13C NMR(100MHz,CDC13) 6 29. 6,40. 3,81. 0，170. 3. 實(shí)施例2 將20mL PBS磷酸緩沖溶液(5mM，Ph = 8. 5)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料⑴(此處X = NH2) 3. 44g加入到錐形瓶中。加入2mL甲醇后繼續(xù)加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase from locustag NC002947)禾口 CRL 共 0.3g(二者質(zhì)量之比為2 1)，加入完畢，將溫度固定在35°C，搖床中反應(yīng)10小時(shí)。期間 TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完畢后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后將溶劑減壓出去，即可得到白色固體L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基 _3，3-二甲基丁酰胺，收率79%，純度98%，6.6.值 98%。
實(shí)施例3 將20mL PBS磷酸緩沖溶液(10mM，pH = 9. 0)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料(I)(此處x = NH2) 3. 44g加入到錐形瓶中。繼續(xù)加入Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus tag NC002947)禾口 CRL共(X 5g (二者質(zhì)量之比為1 1)，加入完畢，將溫度固定在40°C，搖床中反應(yīng)8小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完畢后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后將溶劑減壓出去，即可得到白色固體L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基 _3，3-二甲基丁酰胺，收率69%，純度92%，6.6.值 94%。
實(shí)施例4 將20mL普通水(pH = 8. 5)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料(I)(此處X =NH2)3. 44g加入到錐形瓶中。再加入叔丁醇3mL后繼續(xù)加入Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus tag NC002947)禾口 CRL共(X 2r (二者質(zhì)量之比為1 2)，加入完畢，將溫度固定在25°C，搖床中反應(yīng)8小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完畢后，加入20mL乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相然后將溶劑減壓除去，即可得到白色固體L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3_ 二甲基丁酰胺，收率 73%，純度 95%，e.e.值 94%。
實(shí)施例5 將20mL PBS磷酸緩沖溶液(5mM，pH = 9. 0)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料(I)(此處X = 0H)3.44g加入到錐形瓶中。再加入叔丁醇2mL后繼續(xù)加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase fromlocus tag NC002947)禾口 CRL 共0.5g(二者質(zhì)量之比為1 3)，加入完畢，將溫度固定在35°C，搖床中反應(yīng)10小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完畢后，加入20mL乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相然后將溶劑減壓除去，即可得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率83%，純度95%，e.e.值97%。
L-叔亮氨酸:[a ]D20, +7. 3(c = 5 % in 5M HC1) ；1H NMR(400MHz, CDC13) 8 0. 97(9H) ,3. 41 (S, 1H) ,5. 18(S，2H)，10. 91 (S, 1H) 13C NMR(100MHz, CDC13) 8 26. 3， 39. 1,76. 0，176. 5. 實(shí)施例6 將20mL PBS磷酸緩沖溶液(5mM，pH = 8. 5)加入到lOOmL的錐形瓶中，然后將原料 (I)(此處X = 0H) 3. 44g加入到錐形瓶中。再加入叔丁醇3mL后繼續(xù)加入生物酶Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemasefrom locus tag NC002947)禾口 Lipase AS “Amano”共0. 4g(二者質(zhì)量之比為1 1)，加入完畢，將溫度固定在35°C，搖床中反應(yīng)10小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。
其他操作如同實(shí)施例6純化處理得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率89%，純度97%，e. e.值98%。
實(shí)施例7 將20mLPBS緩沖溶液(5mM，pH = 8. 0)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料 (I)(此處X = 0H)3.44g加入到錐形瓶中。再加入乙醇3mL后繼續(xù)加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase fromlocus tag NC002947)禾口 Lipase PS “Amano”共0. 5g(二者質(zhì)量之比為1 1)，加入完畢，將溫度固定在35°C，搖床中反應(yīng)7小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。
其他操作如同實(shí)施例6純化處理得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率82%，純度97%，e. e.值99%。
實(shí)施例8 將20mL PBS磷酸緩沖溶液(10mM，pH= 10. 0)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料(I)(此處X = 0H) 3. 44g加入到錐形瓶中。再加入丙酮2mL后繼續(xù)加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440 禾口 LipasePS“Amano，，共 0. 5g( 二者質(zhì)量之比為1 3)，加入完畢，將溫度固定在35°C，搖床中反應(yīng)9小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。
其他操作如同實(shí)施例6純化處理得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率85%，純度97%，e.e.值99%。
實(shí)施例9 將20mL Tris鹽酸緩沖液(10mM，pH = 8. 0)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料 (I)(此處X = 0H) 3. 44g加入到錐形瓶中。再加入丙酮2mL后繼續(xù)加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440和 Lipase △丫9111^110，，共0.5§(二者質(zhì)量之比為1 2)， 加入完畢，將溫度固定在35°C，搖床中反應(yīng)6小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。
其他操作如同實(shí)施例6純化處理得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率44%，純度97%，e.e.值95%。
實(shí)施例10 將20mL Tris鹽酸緩沖液(10mM，pH = 8. 0)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料(I)(此處X = 0H) 3. 44g加入到錐形瓶中。再加入丙酮2mL后繼續(xù)加入生物酶Lipase AYS“Amano”，加入完畢，將溫度固定在30°C，搖床中反應(yīng)8小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。
其他操作如同實(shí)施例6純化處理得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率92%，純度97%，e.e.值94%。
實(shí)施例11 將20mL20mLTris鹽酸緩沖液(10mM，pH= 10. 0)加入到100mL的錐形瓶中，然后將原料(I)(此處X = 0H)3. 44g加入到錐形瓶中。再加入丙酮2mL后繼續(xù)加入生物酶Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440禾口Esterase from Escherichia coli.K12共 0. lg(二者質(zhì)量之比為1 1)，加入完畢，將溫度固定在45°C，搖床中反應(yīng)8小時(shí)。期間TLC 小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。
其他操作如同實(shí)施例6純化處理得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率82%，純度97%，e. e.值96%。
實(shí)施例12 將20mL20mL Tris鹽酸緩沖液(10mM，pH = 10. 0)加入到100mL的錐形瓶中， 然后將原料(I)(此處X = 0H) 3. 44g加入到錐形瓶中。再加入丁酮2mL后繼續(xù)加入生物酶 Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440 禾口 LipaseB from Candida antarctica共0. lg(二者質(zhì)量之比為1 3)，加入完畢，將溫度固定在40°C，搖床中反應(yīng)8 小時(shí)。期間TLC小板監(jiān)測(cè)或高效液相色譜監(jiān)測(cè)。
其他操作如同實(shí)施例6純化處理得到白色固體L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率70%，純度97%，e.e.值99%。
序列表 <110>浙江大學(xué) <120>雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法 <170>PatentIn version 3. 權(quán)利要求
1.一種雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在于所述的方法為以式I 所示的N-?；辶涟彼犷惢衔镌陔p酶體系下，于水或緩沖溶劑中反應(yīng)制備式II所示的 手性L-叔亮氨酸類化合物，所述生物酶為?；被嵯负退饷傅幕旌厦?，其制備反 應(yīng)方程式為
其中，X = OH，NH2, NR1R2，OR3(其中R1, R2, R3 = C1 C5直鏈，支鏈，一、二或者三鹵素取 代的烷烴)的任一基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在 于所述的?；被嵯笧楸彼嵯窤lanine racemasefrom Pseudomonas putida KT2440 ；所述水解酶為脂肪酶或酯酶，其中脂肪酶為Lipase from Thermomyces lanuginosus, Lipase B from Candidaantarctica,Lipase from Candide Rugosa,Lipase PS "Amano"SD, LipaseAS "AmanoLipase AK "AmanoLipase AYS "Amano" fM^ 種；酯酶為 Esterase from Escherichia coli. K12 的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在 于所述式I化合物與混合酶的質(zhì)量之比為1 0. 005 0. 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在 于所述緩沖溶劑為Tris鹽酸緩沖液、PBS磷酸緩沖溶液或者混合溶液，所述混合溶液為叔 丁醇、乙醇、甲醇、丙酮或丁酮與水、Tris鹽酸緩沖液、PBS磷酸緩沖溶液任一種的混合液， 體積比為1 20-1 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征 在于所述反應(yīng)溫度為15-60°C，控制反應(yīng)溫度波動(dòng)幅度為士5V ；所述反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為 2-15小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在 于所述反應(yīng)是以TLC小板跟蹤監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開劑是乙酸乙酯與石油醚體積比為1 2 5 的混合試劑；通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)中新產(chǎn)生的點(diǎn)的濃度和剩下的點(diǎn)的濃度來判斷反應(yīng)終點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在 于所述反應(yīng)用液相監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，通過監(jiān)測(cè)液相色譜中式II化合物的形成和式I化合物 的消失來判斷反應(yīng)終點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在 于所述反應(yīng)完畢后，用有機(jī)溶劑萃取產(chǎn)物，所使用的有機(jī)溶劑為乙醚、甲苯、氯苯、乙酸 乙酯，異丙醚，正己烷，甲酸乙酯，環(huán)己烷之中的任一種。并且溶劑經(jīng)簡單處理后可以重復(fù)套 用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中所使用的混合酶為酰化氨基酸消旋酶與水解酶的質(zhì)量之比為 1:3-2: 1 ；反應(yīng)完畢后，將緩沖溶液的pH值調(diào)節(jié)到前相同值，酶體系可重復(fù)使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，其特征在于所述反應(yīng)的是按照以下步驟進(jìn)行a.將化合物I投放到水溶液中，然后加入助溶劑。再加入按照一定比例組成雙酶制劑。 于搖床中或者動(dòng)力攪拌裝置中充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)。b.按照化合物I酶制劑，質(zhì)量之比為1 0. 005 0. 1進(jìn)行投料。c.控制溫度于15 60°C進(jìn)行反應(yīng)，期間用TLC硅膠板或液相色譜進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，直至 反應(yīng)基本進(jìn)行完畢；反應(yīng)完畢，用有機(jī)溶劑萃取反應(yīng)液。然后減壓除去有機(jī)溶劑，即可得到 粗化合物II。d.將反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)pH值于一定的值，可重復(fù)利用該反應(yīng)溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于采用生物酶制劑拆分制備手性化合物的方法，尤其是指一種雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法，所述的方法為以式II所示的N-酰化叔亮氨酸類化合物在雙酶體系下，于水或緩沖溶劑中15-60℃下反應(yīng)制備式III所示手性L-叔亮氨酸類化合物，所述生物酶為?；被嵯?丙氨酸消旋酶)和水解酶的混合酶，其制備反應(yīng)方程式為其中，X＝OH，NH2，NR1R2，OR3(其中R1，R2，R3＝C1～C5直鏈，支鏈，一、二或者三鹵素取代的烷烴)的任一基團(tuán)。本發(fā)明能在室溫下進(jìn)行，并且操作簡單，無污染，能顯著降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P13/02GK101845476SQ201010138158
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者于洪巍, 王博, 車大慶, 沈文和 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)