專利名稱：富含亮氨酸的肽組合物和分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及用于刺激蛋白合成、減少蛋白降解、產(chǎn)生血管舒張、增加一氧化氮產(chǎn)生、和減少血流量的膳食性肽組合物。更具體地，本發(fā)明涉及富含亮氨酸的肽組合物 和從蛋白中分離它們的方法。
背景技術(shù)：
肌肉組織損失通常作為衰老、營(yíng)養(yǎng)不良、和分解代謝性疾病諸如燒傷、膿毒癥 和癌癥的結(jié)果發(fā)生。膳食性蛋白補(bǔ)充可能是有益的，但補(bǔ)充必需氨基酸亮氨酸已經(jīng)顯示 是特別有益的。例如，近年來(lái)已經(jīng)顯示膳食性亮氨酸抑制大鼠中肌原纖維蛋白降解和肌 肉重量損失的速率。亮氨酸還刺激肌肉蛋白合成并調(diào)控參與控制mRNA翻譯的各種蛋白 的活性。亮氨酸可以直接或通過(guò)其代謝物，α-酮異己酸來(lái)刺激蛋白合成。亮氨酸可以 獨(dú)立地或通過(guò)與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)mTOR)的相互作用來(lái)刺激翻譯。亮氨酸是支鏈氨基酸之一并且是一種必需氨基酸。其是轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A和 α-酮酸的唯一氨基酸，并且其是谷氨酰胺合成的重要氮源。除了其對(duì)蛋白合成和降解的 作用以外，亮氨酸還通過(guò)蛋白激酶C(PKC)刺激葡萄糖攝取，而胰島素經(jīng)蛋白激酶B調(diào) 控葡萄糖攝取。乳來(lái)源的乳清是增肌蛋白(muscle-building protein)的一個(gè)良好來(lái)源。乳清分離
蛋白和乳清蛋白濃縮物用于增加蛋白的膳食補(bǔ)充劑中。乳清蛋白是亮氨酸的良好來(lái)源， 但對(duì)于需要膳食性蛋白可以提供的增肌氨基酸的許多個(gè)體，其難以消化和/或吸收蛋 白。因此找到提供這樣的含有亮氨酸的氨基酸組合物的方法是很重要的，所述組合物提 供更高生物利用度的形式的氨基酸以改善肌肉蛋白合成。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有約12-約40%的亮氨酸含量的肽(“富含亮氨酸的肽”)，那 些肽通過(guò)包括下列步驟的方法分離自蛋白源在一種或多種亮氨酰氨基肽酶，任選地與 附加的蛋白酶組合的存在下水解蛋白以產(chǎn)生蛋白水解產(chǎn)物，使所述酶失活，以及將所述 蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以提供透過(guò)物，所述透過(guò)物含有具有約200-約4,000的分子量，包括 其間的子范圍，諸如，例如，約200-約1,000的分子量，或約400-約1,000的分子量的 肽。任選地，可以加入通過(guò)從所述透過(guò)物去除水性流體來(lái)濃縮所述富含亮氨酸的肽的步 驟。還公開(kāi)了使用這些肽用于多種有益效果的方法，諸如產(chǎn)生血管舒張、增加一氧化氮 的產(chǎn)生、降低血壓、增加血流量、增加肌肉組織、改善創(chuàng)傷愈合、和改善認(rèn)知功能。本發(fā)明還涉及從蛋白源分離富含亮氨酸的肽的方法，該方法包括以下的步驟 在一種或多種亮氨酰氨基肽酶，任選地與附加的蛋白酶組合的存在下水解蛋白以產(chǎn)生蛋 白水解產(chǎn)物，使所述酶失活，以及將所述蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以提供透過(guò)物，并且濃縮含有富含亮氨酸的肽的透過(guò)物。在各個(gè)實(shí)施方案中，蛋白可以來(lái)自動(dòng)物或植物來(lái)源，包括，例如，豆科作物諸 如大豆或豌豆、魚、肉、乳、血液、蛋、谷物、面筋(wheat gluten)、玉米或其組合。在 一些實(shí)施方案中，蛋白源可以是牛乳、牛乳清、乳清蛋白濃縮物和/或乳清分離蛋白。在各個(gè)實(shí)施方案中，富含亮氨酸的肽的亮氨酸含量可以在約12-約40%范圍的 多種子范圍內(nèi)，例如，約12-約30重量％亮氨酸，約15-約20重量％亮氨酸，約15-約 25重量％亮氨酸，和約20-約25重量％亮氨酸。詳述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有約12-約40%的亮氨酸含量的肽(“富含亮氨酸的肽”) 可以通過(guò)包括下列步驟的方法分離自蛋白源在一種或多種亮氨酰氨基肽酶，任選地與 附加的蛋白酶組合的存在下水解蛋白以形成蛋白水解產(chǎn)物，使所述酶失活，以及將所述 蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以分離富含亮氨酸的肽，并濃縮所述富含亮氨酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方 案中，該方法包括在一種或多種可用作亮氨酰氨基肽酶(亮氨酸氨基肽酶)的氨基肽酶， 任選地補(bǔ)充以附加的蛋白酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解產(chǎn)物，使所述酶失活，使 用超濾、納米過(guò)濾或其他適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾方法過(guò)濾所述蛋白水解產(chǎn)物，從而得到含有富含亮 氨酸的肽的透過(guò)物，并使用反滲透、蒸發(fā)、或另一種通過(guò)去除來(lái)自過(guò)濾步驟的透過(guò)物的 水性部分來(lái)濃縮所述肽的合適方法，來(lái)濃縮所述透過(guò)物中的富含亮氨酸的肽。本發(fā)明還 提供了包含通過(guò)所述方法制備的富含亮氨酸的肽的組合物。膳食性亮氨酸似乎具有許多有益效果，包括刺激肌肉蛋白合成和抑制肌原纖維 蛋白降解和肌肉重量損失的速率。亮氨酸還增加下丘腦mTOR信號(hào)傳導(dǎo)并減少食物攝取 和體重(Cota，D.等，Science (科學(xué))(2006)312 927-930)。亮氨酸給藥增加瘦蛋白水 平，且已知瘦蛋白促進(jìn)脂肪組織中的脂解，但對(duì)無(wú)脂肪(lean)組織沒(méi)有明顯作用。增加 的瘦蛋白水平導(dǎo)致饑餓減少、食物消耗量減少和細(xì)胞能量消耗增加。蛋白源諸如標(biāo)準(zhǔn)乳清蛋白水解產(chǎn)物可以含有多達(dá)10%亮氨酸，但假定該氨基酸 具有多種有益效果并且其不能在體內(nèi)由其他氨基酸合成的事實(shí)，開(kāi)發(fā)增加亮氨酸水平的 方法以便促進(jìn)其有益效果，特別是其對(duì)增加肌肉和抑制肌肉萎縮的效果已經(jīng)成為了食品 和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑工業(yè)的一個(gè)目標(biāo)。本發(fā)明提供富含亮氨酸的氨基酸組合物，并且所述組合 物可以使用本發(fā)明的方法分離自容易獲得的蛋白來(lái)源。
本發(fā)明人建議使用亮氨酸氨基肽酶來(lái)加工乳清蛋白以產(chǎn)生生物活性/生物可利 用的含有亮氨酸的肽，他們已經(jīng)證明所述肽具有多種所需的作用。亮氨酸殘基似乎在非 常類似的蛋白之間的作用差異方面具有重要作用。例如，血管緊張肽I通過(guò)兩個(gè)附加的 羧基末端氨基酸-組氨酸和亮氨酸與血管緊張肽II相區(qū)別。甲硫氨酸-腦啡肽，一種神 經(jīng)肽，其具有許多類似于亮氨酸-腦啡肽的作用，其似乎是由肽中的氨基酸的芳族側(cè)鏈 所介導(dǎo)的。兩種肽均由5個(gè)氨基酸殘基組成。然而，甲硫氨酸-腦啡肽和亮氨酸-腦 啡肽的不同之處是羧基末端的第五個(gè)氨基酸殘基。在甲硫氨酸-腦啡肽中，其為甲硫 氨酸。在亮氨酸-腦啡肽中，其為亮氨酸。兩者似乎對(duì)動(dòng)脈血壓和血管舒張有作用， 但在此區(qū)域氨基酸差異似乎較為明顯，亮氨酸_腦啡肽似乎具有較強(qiáng)的作用(Moore， R.H.禾口 D.Dowling， “ Effects onlntravenously Administered Leu~or Met-Enkephalin on Arterial BloodPressure (靜脈內(nèi)施用亮氨酸-或甲硫氨酸-腦啡肽對(duì)動(dòng)脈血壓的作用)，“Regulatory Peptides (調(diào)節(jié)肽)(1980) 1 (2) 77-87)。盡管其他人已經(jīng)提供了含
有相當(dāng)大百分比的作為游離氨基酸存在的亮氨酸的水解產(chǎn)物(參見(jiàn)，例如，Delest，V.等 的美國(guó)專利號(hào)6,875,456)，但本發(fā)明提供了小肽(例如，含有相當(dāng)大百分比的二肽和三肽 的水解產(chǎn)物)，從而將亮氨酸以更高生物利用度/生物活性的形式遞送。這些肽已經(jīng)證 明具有令人驚奇的有益結(jié)果，諸如有效抑制血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶(ACE)抑制作用、血管舒 張和刺激一氧化氮的產(chǎn)生增加。試驗(yàn)證明本發(fā)明的肽提供生物可利用/生物活性的亮氨 酸，補(bǔ)充所述肽證明與由補(bǔ)充亮氨酸所提供的那些相同的有益效果中的許多效果，還提 供了以前沒(méi)有作為補(bǔ)充亮氨酸的結(jié)果所描述的附加益處。本發(fā)明的富含亮氨酸的肽組合物提供與其他氨基酸組合的亮氨酸，但提供了與 其他氨基酸相比增加的亮氨酸量。例如，這些組合物可以容易地作為粉末加入至飲料制 齊U、加入至食品、加入至營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑組合物諸如片劑、膠囊或其他制劑中，或加入至藥 物制劑中。附加的調(diào)味劑、碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和其他適當(dāng)?shù)?食品或補(bǔ)充劑成分可以包含在所述組合物中。本發(fā)明的肽可以用來(lái)提供這樣的組合物，該組合物對(duì)人或動(dòng)物在包括但不限 于，心臟健康、少肌癥(sarcopenia)、內(nèi)皮功能、保持健康血壓或降低血壓、血管舒張、 肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)、嬰兒營(yíng)養(yǎng)、預(yù)防或治療代謝綜合征、認(rèn)知功能、眼部健 康、糖尿病、改善血糖生成指數(shù)(glycemicindex)、mTOR活化、傷口愈合、和皮膚護(hù)理/ 治療皮膚病癥的領(lǐng)域提供益處。研究已經(jīng)顯示在運(yùn)動(dòng)之前和期間給藥支鏈氨基酸(BCAA)的人類運(yùn)動(dòng)員在運(yùn)動(dòng) 后的復(fù)雜認(rèn)知試驗(yàn)中表現(xiàn)較好(Hassmen，P.等，Nutrition(營(yíng)養(yǎng))(1994) 10 405-10)。 當(dāng)在犬中測(cè)試時(shí)，在老年犬中補(bǔ)充BCAA似乎在改善運(yùn)動(dòng)期間的認(rèn)知行為表現(xiàn)方面特別 有效(Fretwell，L.等，J.Nutr.(營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志)(2006) 136 2069S-2071S)。本發(fā)明的組合 物提供增加的支鏈氨基酸(BCAA)亮氨酸水平，以及其他氨基酸，其采取可以容易地加 入至片劑、膠囊、食品諸如，例如，營(yíng)養(yǎng)棒(nutrition bar)、粉末形式的補(bǔ)充劑、混合飲 料、和用于人和/或動(dòng)物消費(fèi)的其他組合物的形式。這些組合物可以對(duì)那些期望改善其 認(rèn)知行為表現(xiàn)的個(gè)體提供益處。采用本發(fā)明的肽進(jìn)行的研究已經(jīng)證明補(bǔ)充富含亮氨酸的 肽促進(jìn)血管舒張并增加血流量，以及增加葡萄糖遞送至組織的速率。年長(zhǎng)的個(gè)體、學(xué)生 和其他個(gè)體可以從包含本發(fā)明的富含亮氨酸的肽的食品、飲料和/或補(bǔ)充劑中得到特殊 的益處。代謝綜合征(X綜合征)是一種慢性疾病，其影響美國(guó)每5個(gè)成人中的至少一 個(gè)。其經(jīng)常與肥胖癥相關(guān)，但明確的特征是異常的血糖控制(葡萄糖不耐癥(glucose intolerance) >胰島素抗性)。富蛋白質(zhì)飲食，特別是包含顯著量的亮氨酸的那些，對(duì)于 治療肥胖癥和治療代謝綜合征是有益的(Layman，D.K.和D.A.Walker，J.Nutr.(營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜 志)(2006) 136: 319S-323S)。本發(fā)明的組合物提供了一種優(yōu)秀的手段，采用該手段影響 體重管理和代謝綜合征所需的必需氨基酸和較高量的亮氨酸可以提供給人或動(dòng)物。如果 本發(fā)明的肽用作蛋白組分，則產(chǎn)品例如，諸如“蛋白質(zhì)水”(含有乳清分離蛋白以及增甜 劑和調(diào)味劑的水)可以提供附 加的益處。點(diǎn)心、營(yíng)養(yǎng)棒、飲料、混合飲料和其他產(chǎn)品也 可以與富含亮氨酸的肽一起配制，從而提供用于體重管理和減少脂肪的組合物。富含亮 氨酸的肽組合物可以用于通過(guò)將這些組合物加入至一種或多種食品來(lái)促進(jìn)體重減輕，或可以通過(guò)將它們加入至用于在進(jìn)餐時(shí)攝入的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或營(yíng)養(yǎng)飲料中來(lái)類似地使用。餐 間點(diǎn)心也可以與富含亮氨酸的肽組合物一起配制以減少饑餓和食物消耗。本發(fā)明的富含亮氨酸的肽可以加入至乳清組合物、乳清分離蛋白、乳清蛋白濃 縮物、和其他蛋白源中，從而例如，改善肌肉合成、減少肌肉分解、減少饑餓和食物消 耗、改善血流量和增加血管中的一氧化氮產(chǎn)生。這些作用可以對(duì)很大的個(gè)體群體是有 益的，這些群體包括那些自愿希望增加額外的肌肉質(zhì)量的個(gè)體，那些通過(guò)衰老和/或損 傷、疾病(例如，膿毒癥、癌癥)或營(yíng)養(yǎng)不良而正在減少肌肉質(zhì)量的個(gè)體，和那些希望減 少體內(nèi)脂肪組織與肌肉質(zhì)量的百分比的個(gè)體。本發(fā)明的富含亮氨酸的肽組合物對(duì)正在衰老的個(gè)體或其他患有少肌癥的個(gè)體是 特別有益的。在衰老過(guò)程中和從約45歲開(kāi)始，人的肌肉質(zhì)量減少。與老年個(gè)體有關(guān)的 虛弱性可能很大程度歸因于這種肌肉質(zhì)量的減少，并且使那些個(gè)體易于發(fā)生更多的疾病 或損傷。在老年個(gè)體中一些肌肉組織的減少也可以是營(yíng)養(yǎng)不良的結(jié)果，特別是就蛋白攝 入而言，因?yàn)楦缓鞍椎氖澄飳?duì)于固定收入的個(gè)體來(lái)說(shuō)可能往往較為昂貴并且不太容易 獲得。本發(fā)明的組合物提供了營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，采用該營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑解決了其中衰老或營(yíng)養(yǎng)不 良已經(jīng)引起肌肉減少的個(gè)體的需求。健身包括營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和運(yùn)動(dòng)的組合以增加肌肉質(zhì)量。本發(fā)明的組合物理想地適 合于健身營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。富含亮氨酸的組合物刺激肌肉合成，同時(shí)通常減少過(guò)量進(jìn)食的 需要和脂肪組織增加。此外，膳食性亮氨酸補(bǔ)充已經(jīng)顯示能顯著地改善耐力行為表現(xiàn) (endurance performance) (Crowe，Μ.J.等，Eur.J.Appl.Phvsiol.(歐洲應(yīng)用生理學(xué)雜志) (2006)97(6) 664-72)。除了其許多其他的有益作用以外，亮氨酸已經(jīng)證明具有心臟保護(hù)作用。例 如，亮氨酸保護(hù)心肌免受心肌缺血，并且一些研究者認(rèn)為其也是一種抗心律失常因 子(Gabrys，J.等，(2002)Pharmacology Reviews andCommunications(藥理學(xué)綜述和通 訊)12: 101-108)。本發(fā)明的肽已經(jīng)顯示用作有效的血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶(ACE)抑制 齊U。例如，歐洲專利號(hào)1794189Bl(DeSlegte，J等)提出迄今為止證明具有最高效力的 ACE-抑制性肽是含有相當(dāng)大百分比的脯氨酸殘基的那些。那些發(fā)明人討論了一些公司諸 如Calpis和Valio的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品提供了每個(gè)三肽具有兩個(gè)脯氨酸殘基的三肽。報(bào)告了 他們自己的肽制劑針對(duì)ACE抑制的結(jié)果(其表示為IC50值，S卩，減少ACE活性50%所需 的肽或水解產(chǎn)物的濃度)，他們指出他們的水解產(chǎn)物產(chǎn)生的IC50(表示為yg/ml)為7.2。 然而，本發(fā)明的富含亮氨酸的肽具有的已確定的IC50值為約4.0 μ g/ml至約9.6 μ grams/ ml,用于大規(guī)模生產(chǎn)批次的規(guī)格的ACE-抑制值為4.0-4.7。本發(fā)明的肽還已經(jīng)證明了在產(chǎn)生血管舒張、增加血流量和增加血管中一氧化氮 (NO)的產(chǎn)生方面的效力(見(jiàn)實(shí)施例1)。這種作用組合清楚地證明了本發(fā)明的肽對(duì)心血 管系統(tǒng)的正向作用，并且因此舉例說(shuō)明了本發(fā)明的肽作為心臟保護(hù)性組合物和用于改善 血管功能、增加血流量、降低血壓、增加耐力等的組合物的益處。本發(fā)明的組合物可以 作為用于在具有或易于發(fā)生升高的血壓水平的個(gè)體中維持健康血壓水平和降低血壓的膳 食補(bǔ)充劑和/或藥物組合物來(lái)提供或消費(fèi)。所述組合物可以特 別有益于患有糖尿病的個(gè) 體，例如，可能具有或易于發(fā)生高血壓的個(gè)體和還可能需要增加到達(dá)組織的血流量以便 減少組織損害，尤其在四肢中的個(gè)體。
已經(jīng)確定補(bǔ)充亮氨酸對(duì)于燒傷、創(chuàng)傷和膿毒癥患者比一般性補(bǔ)充BCAA更為有 益(DeBandt，J.和 L Cynober，J.Nutr.(營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志)(2006) 136 308S-313S)。此外，
亮氨酸對(duì)皮膚傷口和肌肉中的蛋白質(zhì)有合成作用，條件是獲得足夠的額外的氨基酸。當(dāng) 與單獨(dú)補(bǔ)充亮氨酸比較時(shí)，補(bǔ)充亮氨酸與補(bǔ)充蛋白相結(jié)合對(duì)傷口愈合提供更大的益處 (Zhang, X.等，J.Nutr.(營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志)(2004) 134 = 3313-8)。本發(fā)明的組合物提供具有增 加的亮氨酸含量的肽，并且因此是用于對(duì)具有燒傷或其他皮膚傷口、肌肉損傷、創(chuàng)傷、 膿毒癥、或其中通過(guò)提供亮氨酸與肽或蛋白的組合而可以增加亮氨酸的有益作用的其他 病癥的患者施用的優(yōu)異的食品、藥物或營(yíng)養(yǎng)組合物。這些組合物可以口服形式、經(jīng)靜脈 內(nèi)方式，或通過(guò)注射提供。富含亮氨酸的肽組合物還可以經(jīng)口服或局部使用以增加膚色 和柔軟性，并且促進(jìn)整體的皮膚健康。富含亮氨酸的肽還可以對(duì)血壓調(diào)節(jié)和血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶(ACE)的抑制提供益 處。對(duì)于需要更好地管理血壓并增加到達(dá)組織的血流量的個(gè)體，本發(fā)明的富含亮氨酸的 肽可以作為食品補(bǔ)充劑諸如片劑、膠囊、粉末和可以容易在進(jìn)餐時(shí)或餐間自行施用的其 他制劑在食品、飲料和混合飲料中被消耗。通過(guò)增加血流量和促進(jìn)血管舒張和一氧化氮 的產(chǎn)生，本發(fā)明的組合物可以通過(guò)增加微循環(huán)，促進(jìn)內(nèi)皮健康，并改善向組織的營(yíng)養(yǎng)素 遞送來(lái)提供益處。這些作用在患有糖尿病、外周動(dòng)脈疾病、和影響循環(huán)的其他疾病的個(gè) 體，以及老年人，運(yùn)動(dòng)員，從手術(shù)、創(chuàng)傷性損傷、燒傷、慢性傷口和其中增加的血流量 和營(yíng)養(yǎng)素遞送可以促進(jìn)健康改善的其他病癥恢復(fù)的個(gè)體中可以是特別重要的。多種有益作用與一氧化氮的產(chǎn)生有關(guān)。NO松弛平滑肌并且抑制血管炎癥，抑制 沿血管排列的內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性物質(zhì)。NO抑制平滑肌細(xì)胞遷移和增殖并減少血小板粘附 和聚集。這些作用在易于形成動(dòng)脈粥樣硬化和易于中風(fēng)、自體免疫病等的那些患者中是 特別有益的。NO似乎部分地通過(guò)抑制Weibel-Palade小體的胞吐作用來(lái)調(diào)節(jié)血管炎癥， 所述Weibel-Palade小體的胞吐作用例如可以通過(guò)凝血酶、組胺、血纖蛋白、補(bǔ)體、白三 烯和 ATP 來(lái)觸發(fā)(Matsushita，K.等，Cell (細(xì)胞)(2003) 115 139-150)。本發(fā)明的富含 亮氨酸的肽已經(jīng)顯示在體內(nèi)能增加一氧化氮的產(chǎn)生和血管舒張。本發(fā)明的組合物因此可 以通過(guò)預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病灶的形成，減少血管炎癥，減少血小板粘附和聚集等來(lái)提供 益處。本發(fā)明的組合物因此可以提供補(bǔ)充劑，所述補(bǔ)充劑在加強(qiáng)心血管系統(tǒng)，減少循環(huán) 系統(tǒng)中的炎癥，預(yù)防血管中斑塊的形成，和通常在血管內(nèi)提供更加“心臟_健康”的環(huán) 境方面提供顯著的益處。所述方法可以用來(lái)從包括含有亮氨酸的蛋白的任何來(lái)源分離富含亮氨酸的肽。 所述來(lái)源可以包括，但不限于，面筋、玉米/谷物分離蛋白、卵蛋白、大豆和其他豆類 蛋白(例如，豌豆)、魚、肉、血液/血液蛋白、和乳蛋白。富含亮氨酸的肽的一種特別 有價(jià)值的來(lái)源是乳來(lái)源的乳清，諸如，例如，牛乳-來(lái)源的乳清、乳清分離蛋白和/或乳 清蛋白濃縮物。乳清分離蛋白通常具有至少約90重量％的蛋白含量，而乳清蛋白濃縮物 可以具有至少約35重量％ -約80重量％的蛋白。用于本發(fā)明的方法的酶來(lái)源可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)鑒定。例如，亮氨 酰氨基肽酶(亮氨酸氨基肽酶)是外肽酶，其水解鄰近游離氨基的肽鍵，并且最迅速地與 含亮氨酸的肽和蛋白反應(yīng)。使用過(guò)濾，分子選擇性地跨膜通過(guò)或運(yùn)送，并且當(dāng)使用壓力梯度時(shí)此方法可以更為有效。在分離富含亮氨酸的肽時(shí)過(guò)濾是特別有效的?；诜肿恿亢推渌匦赃^(guò)濾分 子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且包括例如，通常膜過(guò)濾、超濾和納米過(guò)濾。 就此而言，分離的富含亮氨酸的肽通常包含在透過(guò)物內(nèi)，所述透過(guò)物固體含量非常低。 然后透過(guò)物可以通過(guò)去除液體(水性流體)被濃縮以增加組合物中的固體百分比。這可以通過(guò)本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的方式來(lái)完成，所述方式包括但不限于諸如蒸發(fā)和反滲 透的方法。在整個(gè)本公開(kāi)內(nèi)容中，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“包含”時(shí)，其意在該術(shù)語(yǔ)也可以用 “由......組成”和/或“基本上由......組成”來(lái)代替。本發(fā)明可以進(jìn)一步通過(guò)下面的非
限制性實(shí)施例來(lái)說(shuō)明
實(shí)施例實(shí)施例1-亮氨酸肽的產(chǎn)生使用高蛋白、低脂肪、低乳糖液體乳清分離蛋白產(chǎn)品作為初始底物。此產(chǎn)品以 17%的固體水平泵入至反應(yīng)罐中。溫度升高至45°C，并用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至7.3。然 后以0.35%的固體水平加入蛋白酶和氨基肽酶(例如，亮氨酸氨基肽酶)的摻合物。使 水解進(jìn)行6小時(shí)，每小時(shí)調(diào)節(jié)pH，從而將pH保持在7.3。然后通過(guò)將溶液加熱至65°C 來(lái)使酶滅活。使用過(guò)濾來(lái)進(jìn)行分級(jí)分離，將水解產(chǎn)物通過(guò)濾器以保留分子量大于20,000的分 子。來(lái)自過(guò)濾系統(tǒng)的透過(guò)物含有亮氨酸肽，其具有約52%的在小于1,000的分子量范圍 內(nèi)的肽；41%的在1,000-4,000的分子量范圍內(nèi)的肽；和6%的在4,000-20,000的分子量 范圍內(nèi)的肽。這些肽使用反滲透進(jìn)一步濃縮。然后將最終產(chǎn)物干燥和包裝。本發(fā)明的肽的6個(gè)制劑(批次)的分析顯示在表1中，其中批次06-187、批次 06-257和批次06-259是小規(guī)模批次，并且批次07-041、批次07-046和07-055是大規(guī)模 生產(chǎn)批次。每個(gè)批次的水解程度顯示在最下面的一行中，在這些試驗(yàn)中產(chǎn)生所需的肽的 水解的范圍為約30% -約50%。ACE抑制顯示為產(chǎn)生50% ACE抑制所需的肽的量。表 權(quán)利要求
1.一種包含分離的肽的肽組合物，所述分離的肽具有約12重量％ -約40重量％的亮 氨酸含量和約200-約4,000的分子量。
2.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述分離的肽的亮氨酸含量為約12重量％-約30重量％。
3.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述分離的肽的亮氨酸含量為約15重量％-約20重量％。
4.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述分離的肽的亮氨酸含量為約15重量％-約30重量％。
5.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述分離的肽的亮氨酸含量為約20重量％-約30重量％。
6.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述分離的肽的分子量為約200-1,000。
7.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述分離的肽的分子量為約400-1,000。
8.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述蛋白源選自由豆科作物、魚、肉、乳、 蛋、谷物、面筋、玉米及其組合組成的組。
9.如權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述蛋白源選自由牛乳、牛乳清、乳清蛋白濃 縮物、乳清分離蛋白及其組合組成的組。
10.一種肽組合物，其包含具有約12重量％ -約40重量％的亮氨酸含量和約200-約 4,000的分子量的肽，所述肽通過(guò)包括下列步驟的方法分離自蛋白源a)在至少一種亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解產(chǎn)物；b)使所述氨基肽酶失活；以及c)將所述蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以產(chǎn)生含有富含亮氨酸的肽的透過(guò)物。
11.如權(quán)利要求10所述的肽組合物，其中所述方法包括通過(guò)從所述透過(guò)物去除水性流 體來(lái)濃縮所述肽的附加步驟。
12.如權(quán)利要求10所述的肽組合物，其中所述蛋白源選自由豆科作物、魚、肉、乳、 血液、蛋、谷物、面筋、玉米及其組合組成的組。
13.如權(quán)利要求10所述的肽組合物，其中所述蛋白源選自由牛乳、牛乳清、乳清蛋白 濃縮物、乳清分離蛋白及其組合組成的組。
14.一種從蛋白源分離富含亮氨酸的肽的方法，所述方法包括以下的步驟a)在至少一種亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解產(chǎn)物；b)使所述氨基肽酶失活；以及c)將所述蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以產(chǎn)生含有富含亮氨酸的肽的透過(guò)物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，還包括通過(guò)從所述透過(guò)物去除水性流體來(lái)濃縮所述肽 的步驟。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述蛋白源選自由豆科作物、魚、肉、乳、血 液、蛋、谷物、面筋、玉米及其組合組成的組。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中進(jìn)行所述過(guò)濾步驟以在所述透過(guò)物中收集具有約 200-約4,000的分子量的富含亮氨酸的肽。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中進(jìn)行所述過(guò)濾步驟以收集具有約200-約1,000的 分子量的富含亮氨酸的肽。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中進(jìn)行所述過(guò)濾步驟以收集具有約400-約1,000的 分子量的富含亮氨酸的肽。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述蛋白源選自由牛乳、牛乳清、乳清蛋白濃縮 物、乳清分離蛋白及其組合組成的組。
21.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述肽的亮氨酸含量為約12-約30重量％的亮 氨酸。
22.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述肽的亮氨酸含量為約15-約25重量％的亮氨酸。
23.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述肽的亮氨酸含量為約20-約25重量％的亮氨酸。
24.一種增加受試者血管中一氧化氮的產(chǎn)生的方法，所述方法包括向所述受試者施用 有效量的富含亮氨酸的肽組合物，所述組合物包含具有約12-約40重量％的亮氨酸含量 的肽。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述富含亮氨酸的肽通過(guò)包括下列步驟的方法分 離自蛋白源a)在至少一種亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解產(chǎn)物；b)使所述氨基肽酶失活；以及c)將所述蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以產(chǎn)生含有富含亮氨酸的肽的透過(guò)物。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述分離富含亮氨酸的肽的方法還包括通過(guò)從所 述透過(guò)物去除水性流體來(lái)濃縮所述肽的步驟。
27.一種在受試者血管中產(chǎn)生血管舒張的方法，所述方法包括向所述受試者施用有 效量的富含亮氨酸的肽組合物，所述組合物包含具有約12-約40重量％的亮氨酸含量的 肽。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述富含亮氨酸的肽通過(guò)包括下列步驟的方法分 離自蛋白源a)在至少一種亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解產(chǎn)物；b)使所述氨基肽酶失活；以及c)將所述蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以產(chǎn)生含有富含亮氨酸的肽的透過(guò)物。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述分離富含亮氨酸的肽的方法還包括通過(guò)從所 述透過(guò)物去除水性流體來(lái)濃縮所述肽的步驟。
30.一種增加受試者血管中的血流量的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量 的富含亮氨酸的肽組合物，所述組合物包含具有約12-約40重量％的亮氨酸含量的肽。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述富含亮氨酸的肽通過(guò)包括下列步驟的方法分 離自蛋白源a)在至少一種亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解產(chǎn)物；b)使所述氨基肽酶失活；以及c)將所述蛋白水解產(chǎn)物過(guò)濾以產(chǎn)生含有富含亮氨酸的肽的透過(guò)物。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述分離富含亮氨酸的肽的方法還包括通過(guò)從所 述透過(guò)物去除水性流體來(lái)濃縮所述肽的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了包含分離的肽的組合物，所述分離的肽具有約12-約40重量％的亮氨酸含量。還公開(kāi)了從蛋白源諸如牛乳清中分離富含亮氨酸的肽的方法和使用這些肽對(duì)人或動(dòng)物提供有益效果諸如增加血流量、降低血壓、增加肌肉重量、改善認(rèn)知功能、改善心血管功能等的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK102014947SQ200980114782
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日
發(fā)明者勞倫·沃德, 埃里克·巴斯蒂安, 布倫特·彼德森, 斯坦利·羅貝爾 申請(qǐng)人:格蘭比亞營(yíng)養(yǎng)物(愛(ài)爾蘭)有限公司