專利名稱：一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，本發(fā)明涉及ー種以陰離子交換層析為主要手段的重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨肽酶(aminopeptidases,——APs,EC 3. 4. 11)是ー類能夠水解蛋白質(zhì)和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物中。氨肽酶根據(jù)最易反應(yīng)底物的不同可以分為亮氨酸氨肽酶、賴氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶等。氨肽酶在蛋白水解液脫苦和蛋白質(zhì)的深度水解中有著重要作用，目前主要用于食品エ業(yè)中，包括魚肉類加工エ業(yè)、植物類加工エ業(yè)以及以微生物為原料的加工エ業(yè)等，它可以増加游離氨基酸的量，改善風(fēng)味，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可以作為醬油醬料等調(diào)味品的添加剤。 目前國(guó)內(nèi)的氨肽酶產(chǎn)品生產(chǎn)尚屬空白，所用氨肽酶基本為國(guó)際產(chǎn)品，純度較高，價(jià)格也較為昂貴，而本發(fā)明g在開發(fā)出ー種從分泌表達(dá)亮氨酸氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分離純化出高純度、高得率的電泳級(jí)氨肽酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法。本發(fā)明的具體步驟如下I)將發(fā)酵液離心去除菌體，收集發(fā)酵上清液；2)將發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后進(jìn)行透析；3)將透析后的酶液加入到用Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L Tris, pH 8. 5)平衡好的DEAE陰離子交換柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow中，用Tris-HCl緩沖液B(含50mmol/L Tris, lmol/L NaCl’pH 8. 5)梯度(0-60% )洗脫4個(gè)柱體積,流速為 2. 5ml/min,收集各個(gè)出峰蛋白；4)分光光度法檢測(cè)亮氨酸氨肽酶酶活，確定活性蛋白部分。本發(fā)明所述發(fā)酵液是指出發(fā)菌株為重組枯草芽孢桿菌(含連接了來(lái)源于枯草芽抱桿菌Zj016氨妝酶基因全序列的PMA5質(zhì)粒，宿主菌為Bacillus subtilis WB600)。TB發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件37°C，200rpm培養(yǎng)32h。所述枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶基因全序列中開放閱讀框序列如SEQ ID NO. I所
/Jn ο本發(fā)明的詳細(xì)的步驟為(I)將重組枯草芽孢桿菌(含連接了來(lái)源于枯草芽孢桿菌ZjOie氨肽酶基因全序列的PMA5質(zhì)粒，宿主菌為Bacillus subtilis WB600)發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)條件為37°C，200rpm培養(yǎng)32h ；(2)將發(fā)酵液離心去除菌體，收集發(fā)酵上清液；(3)硫酸銨沉淀
向發(fā)酵上清液中加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，至飽和度為60%，緩慢攪拌至其完全溶解。調(diào)節(jié)PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時(shí)后10000 Xg低溫離心IOminJg溫離心去除蛋白沉淀收集上清液。再向上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為70%，緩慢攪拌至其完全溶解。調(diào)節(jié)PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時(shí)后10000 Xg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉淀溶解在Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)中并且4°C透析數(shù)小時(shí)；(4) DEAE離子交換層析將透析后的酶液加入到用Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)平衡好的 DEAE 陰離子交換柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow 中，用 Tris-HCl 緩沖液B(含 50mmol/L Tris, lmol/L NaCl，pH 8. 5)進(jìn)行梯度洗脫，0-60%洗脫4個(gè)柱體積，流速為2. 5ml/min，收集各個(gè)出峰蛋白；(5)分光光度計(jì)法檢測(cè)出峰蛋白酶活
酶活測(cè)定條件以L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺為底物，在50mM pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液中加入稀釋一定倍數(shù)的酶液和底物(lmM)，50°C水浴反應(yīng)lOmin，在405nm下測(cè)定吸光度；酶活定義在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生ΙμΜ對(duì)硝基苯胺所需的酶量為ー個(gè)酶活單位(IU)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，該方法エ藝簡(jiǎn)單，得率高，能得到純度較高的重組亮氨酸氨肽酶。


圖I. DEAE離子交換層析色譜圖；圖2.重組亮氨酸氨肽酶表達(dá)SDS-PAGE圖(I、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、發(fā)酵上清液；3、分離純化的重組亮氨酸氨肽酶)。
具體實(shí)施例方式材料和檢測(cè)方法重組枯草芽孢桿菌(含連接了來(lái)源于枯草芽孢桿菌ZjOie氨肽酶基因全序列的ΡΜΑ5 質(zhì)粒,宿主菌為 Bacillus subtilis WB600)。表達(dá)培養(yǎng)基I. 2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取物，O. 4%甘油，17mM KH2P04,72mMK2HP04。氨肽酶酶活測(cè)定方法以硝基苯胺為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。恒溫水浴鍋調(diào)到50°C，將底物(L-leucine-p-nitroanilide, 4mmol/L) lmL、適當(dāng)稀釋的待測(cè)樣品 ImL 和 2mLTris-HCl緩沖液(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)混合,放入水浴鍋計(jì)時(shí)IOmin后,在405nm下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。酶活力単位定義在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生I μ M對(duì)硝基苯胺所需的酶量為ー個(gè)酶活單位(IU)。實(shí)施例I重組枯草芽孢桿菌(含連接了來(lái)源于枯草芽孢桿菌ZjOie氨肽酶基因全序列的ΡΜΑ5質(zhì)粒，宿主菌為Bacillus subtilis WB600)種子液按照I %的接種量轉(zhuǎn)接至表達(dá)培養(yǎng)基中，37°C，200rpm 培養(yǎng) 32h。實(shí)施例2
(I)將發(fā)酵液離心去除菌體，收集發(fā)酵上清液；(2)硫酸銨沉淀向發(fā)酵上清液中加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，至飽和度為60 %，緩慢攪拌至其完全溶解。調(diào)節(jié)PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時(shí)后10000 Xg低溫離心IOminJg溫離心去除蛋白沉淀收集上清液。再向上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為70%，緩慢攪拌至其完全溶解。調(diào)節(jié)PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時(shí)后10000 Xg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉 淀溶解在Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)中并且4°C透析數(shù)小時(shí)；(3) DEAE離子交換層析將透析后的酶液加入到用Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)平衡好的 DEAE 陰離子交換柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow 中，用 Tris-HCl 緩沖液B(含 50mmol/L Tris, lmol/L NaCl, pH 8. 5)進(jìn)行梯度洗脫，0-60%洗脫4個(gè)柱體積，流速為2. 5ml/min,收集各個(gè)出峰蛋白；(4)分光光度計(jì)法檢測(cè)出峰蛋白酶活恒溫水浴鍋調(diào)到50°C,將底物(L-leucine-p-nitroanilide,4mmol/L) lmL、適當(dāng)稀釋的待測(cè)樣品ImL和2mL Tris-HCl緩沖液(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)混勻，放入水浴鍋計(jì)時(shí)IOmin后,在405nm下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,并計(jì)算酶活。
權(quán)利要求
1.一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，是采用陰離子交換柱分離純化重組亮氨酸氨肽酶。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換柱是HiprepDEAE16/10Fast Flowο
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述亮氨酸氨肽酶由重組枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法將編碼成熟氨肽酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. I連接大腸-枯草穿梭載體PMA5后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述重組枯草芽孢桿菌的表達(dá)培養(yǎng)基為I.2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取物，O. 4%甘油，17mM KH2P04,72mM K2HP04。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌表達(dá)條件為37°C，200rpm 培養(yǎng) 32h。
7.權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟如下1)將發(fā)酵液離心去除菌體，收集發(fā)酵上清液；2)將發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后進(jìn)行透析；3)將透析后的酶液加入到用pH8. 5的Tris-HCl緩沖液平衡好的陰離子交換柱Hipr印DEAE 16/10Fast Flow中，用含氯化鈉pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫，收集活性部分。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述用于洗脫的含氯化鈉的Tris-HCl緩沖液，流速2. 5ml/min，線性范圍為0-0. 6mol/L，洗脫柱體積為4個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，是采用陰離子交換層析純化重組亮氨酸氨肽酶，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單，得率高，能得到純度較高的重組亮氨酸氨肽酶。
文檔編號(hào)C12N9/48GK102827822SQ201210345248
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者周哲敏, 高新星, 田亞平, 崔文璟, 周麗, 丁寧 申請(qǐng)人:江南大學(xué)