專利名稱：一種減少l-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法
一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法，本發(fā)明屬于 生化工程領(lǐng)域。背景技術(shù)：
黃色短桿菌是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的常用菌株。在L-亮氨酸生 產(chǎn)過程中HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸是主要的副酸，這些副酸的大量積累嚴(yán)重抑制菌體活 力，使亮氨酸產(chǎn)量下降，同時(shí)這些副酸的存在也對(duì)亮氨酸的分離提取造成不利影響。近年來，代謝工程領(lǐng)域的研究結(jié)果表明，丙酮酸和乙酰輔酶A是黃色短桿菌合成 L-亮氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，另外HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸是L-亮氨酸分批發(fā)酵過 程的主要副產(chǎn)物。當(dāng)EMP流量超出TCA及L-亮氨酸生物合成途徑的代謝能力時(shí)，丙酮酸代 謝受阻，從而通過其它途徑進(jìn)一步代謝，導(dǎo)致副產(chǎn)物的生成。因此分批發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸 的過程中，減弱EMP途徑代謝流量，降低副產(chǎn)物HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸的生成以及控制 TCA循環(huán)流量是提高L-亮氨酸得率的關(guān)鍵。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用在培養(yǎng)基中添加一定量的檸檬酸或其鹽的方法來減少黃 色短桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸過程中副產(chǎn)物HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸的生成。檸檬酸或其鹽能夠抑制丙酮酸激酶活性，導(dǎo)致磷酸烯醇式丙酮酸積累，而磷酸烯 醇式丙酮酸又會(huì)強(qiáng)烈抑制磷酸果糖激酶，同時(shí)檸檬酸可以通過加強(qiáng)ATP的抑制效應(yīng)抑制磷 酸果糖激酶的活力。由于丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途徑的關(guān)鍵酶，所以發(fā)酵培養(yǎng) 基中添加適量檸檬酸鈉可以使得EMP途徑代謝流量減弱，從而減少副產(chǎn)物的生成。另外發(fā) 酵中后期菌體處于穩(wěn)定期，HMP途徑的主要作用是為L(zhǎng)-亮氨酸合成途徑的乙酰羥基酸還原 異構(gòu)酶催化的反應(yīng)提供還原力NADPH，因此進(jìn)入HMP途徑的碳架最終在GAP節(jié)點(diǎn)重新進(jìn)入 EMP途徑。HMP途徑流量增加，從而還原力NADPH生成量增加，有利于L-亮氨酸的生成。適 當(dāng)控制TCA循環(huán)流量對(duì)于增加L-亮氨酸的合成是必要的。因?yàn)闄幟仕岷铣擅甘荰CA循環(huán) 的限速酶，添加檸檬酸鈉會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制檸檬酸合成酶的活性。所以添加適量檸檬酸鈉可以 限制TCA代謝流量，減少碳架的浪費(fèi)，從而提高乙酰輔酶A進(jìn)入L-亮氨酸生物合成的代謝 流，提高了 L-亮氨酸的產(chǎn)量。此方法在不增加額外設(shè)備和人力投入的情況下，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵過程中副酸的減少和 L-亮氨酸產(chǎn)量的提高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法，其特征是在發(fā)酵培養(yǎng) 基中添加檸檬酸或其鹽，使其在培養(yǎng)基中的濃度均為0. 01 16g/L，優(yōu)選0. 05 10g/L，更 優(yōu)選0. 1 5g/L。其中所說的檸檬酸鹽為檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。本發(fā)明根據(jù)調(diào)整代謝流分配的原理提出了減少黃色短桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸過程中 副產(chǎn)物HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸的生成的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量檸檬酸鈉可以 抑制EMP途徑關(guān)鍵酶丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，使得EMP途徑代謝流量減弱，從而 減少副產(chǎn)物的生成。
具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍實(shí)施例1:采用的菌株為黃色短桿菌；種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖30，玉米漿IOmL,豆餅水解液20mL,尿素2. 0，KH2PO4 1. 0，MgSO4 0. 4，MnSO4 0. 01，Met 0. 4，VB1 300 μ g，VH 200 μ g。ρΗ 7· 0 7. 2,0. 075MPa, 20min發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖80，玉米漿 43. 5mL，NH4Ac 16. 7，(NH4)2S0417，KH2PO4
1.25，MgSO4 0. 5，MnSO4 0. 01，F(xiàn)eSO4 0. 01，Met 0. 7，Glu 0. 42，lie 0. 06，VB1 160 μ g, VH 50 μ g, CaCO3 20 (分消)，ρΗ 7· 0 7· 2，0. 075MPa, 20min培養(yǎng)方法從生長(zhǎng)良好的活化斜面刮一滿環(huán)菌苔轉(zhuǎn)入裝有40mL種子培養(yǎng)基的 500mL無擋板三角瓶中，9層紗布封口，置巡回式搖床(180r/min)上，28°C下振蕩培養(yǎng)20h。 按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基(含有0. lg/L檸檬酸鈉)的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控 制發(fā)酵液溫度為28°C，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式控制溶氧 0 30h為30 %，30h以后為20 %，通過自動(dòng)流加液氨控制ρΗ在7. 0，通過流加適量泡敵消 泡，并通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?. 0 2. 0%，發(fā)酵至64h停止。 在44h和64h測(cè)得L-丙氨酸含量分別為0. 76g/L，3. 94g/L，分別比對(duì)照實(shí)驗(yàn)(44hL_丙氨酸 含量 0.86g/L，64hL-丙氨酸含量 4. 75g/L)降低了 11. 6%和 17. 1%。實(shí)施例2:采用的菌株為黃色短桿菌；種子、發(fā)酵培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)，發(fā)酵培養(yǎng)基中中添加 5. Og/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。在44h和64h測(cè)得L-纈氨酸含量分別為1. OOg/ L，4. 36g/L，分別比對(duì)照實(shí)驗(yàn)(44hL-纈氨酸含量1. 58g/L，64hL_纈氨酸含量7. 46g/L)降低 了 36. 7%和 41. 6%。實(shí)施例3:采用的菌株為黃色短桿菌；種子、發(fā)酵培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)，發(fā)酵培養(yǎng)基中中添 加5. Og/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。在44h和64h測(cè)得HAc含量分別為0. 84g/L，
2.62g/L，分別比對(duì)照實(shí)驗(yàn)(44hHAc 含量 2. 16g/L,64hHAc 含量 10. 09g/L)降低了 61. 和 74. 0%。
權(quán)利要求
一種減少L 亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法，其主要步驟為采用黃色短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L 亮氨酸過程中在培養(yǎng)基中加入檸檬酸或其鹽來減少副酸的產(chǎn)生，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽使其在培養(yǎng)基中的濃度為0.01～16g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸鹽為檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸或其鹽的濃度為0.05 10g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸或其鹽的濃度為0.1 5g/L。
全文摘要
一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法。本發(fā)明涉及一種減少發(fā)酵法制備L-亮氨酸過程中的副酸的方法。本發(fā)明根據(jù)調(diào)整細(xì)胞代謝流分配的原理，采用在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽的方法，來有效減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸等副酸的形成。
文檔編號(hào)C12P13/06GK101962662SQ201010527450
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日 公開號(hào)201010527450.8
發(fā)明者劉淑云, 史建明, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)