一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法
【專利摘要】一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，屬于酶制劑、發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明將培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵過程控制組合優(yōu)化，得出適合重組枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法；將重組枯草芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)基后，搖床培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種一定量的種子液到調(diào)整后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每3h取樣測(cè)定酶活力等參數(shù)。本發(fā)明采用組合優(yōu)化的策略對(duì)重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，將發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件組合起來優(yōu)化，使得重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的能力得到了大幅度的提高，亮氨酸氨肽酶的酶活力達(dá)到605U/mL。
【專利說明】一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，屬于酶制 齊IJ、發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 氨肽酶是一類外肽酶，從蛋白質(zhì)或肽鏈的N末端選擇性切割氨基酸殘基，作用范 圍較廣。由氨肽酶的切割特性可知，氨肽酶的酶解產(chǎn)物為小肽和游離氨基酸。因此，氨肽酶 具有非常重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，能夠既有效又環(huán)保地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行相關(guān)的水解反應(yīng)，氨肽 酶的應(yīng)用廣泛，可協(xié)助切掉肽鏈末端疏水性氨基酸，脫除蛋白水解物的苦味；與不同的內(nèi)切 酶復(fù)配，參與蛋白質(zhì)的深度水解；制備多功能活性肽；還可以作為N端測(cè)序工具酶和醫(yī)療診 斷用酶。蛋白序列測(cè)定的工具可以用到亮氨酰氨肽酶，作為融合產(chǎn)物或重組蛋白的固定劑。 氨肽酶在醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，其有助于許多疾病的治療，可以用于從分子水平來研究許多生 理現(xiàn)象。脯氨肽酶可以用于清除神經(jīng)毒性的化學(xué)毒劑和有機(jī)磷農(nóng)藥，一方面可以用作解毒 齊U，另一方面可以用作環(huán)境的消毒劑。
[0003] 微生物的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化策略往往從培養(yǎng)基的優(yōu)化和發(fā)酵過程控制兩方面入手，目 前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計(jì)算出適合某種微生物的培養(yǎng)基配方和發(fā) 酵過程控制策略，且不同的微生物所適合的培養(yǎng)基和發(fā)酵過程控制策略都不盡相同，沒有 一種培養(yǎng)方法能夠適合多種微生物的發(fā)酵培養(yǎng)，所以對(duì)某一特定微生物需要采用搖瓶、玻 璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方法將培養(yǎng)基組成和發(fā)酵過程控制等發(fā) 酵策略組合優(yōu)化才能選擇出最適合的培養(yǎng)方法。
[0004] 氨肽酶在食品、工業(yè)、醫(yī)藥等方面具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，但目前氨肽酶 的發(fā)酵生產(chǎn)存在產(chǎn)量低的問題，如何提高產(chǎn)量成為迫切需要解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的組合 優(yōu)化策略，解決現(xiàn)有發(fā)酵工藝中產(chǎn)量低，難以工業(yè)化應(yīng)用的問題。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法， 步驟為：以重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600為出發(fā)菌株，將培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵 過程控制組合優(yōu)化，得出適合重組枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法；將重組枯草芽孢桿菌接入種子 培養(yǎng)基后，搖床培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種一定量的種子液到調(diào)整后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用發(fā)酵 罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每3h取樣測(cè)定酶活力等參數(shù)。
[0007] 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化： (1) 種子液的制備：將-40°c甘油管保存的重組枯草芽孢桿菌菌種Bacillus subtilis WB600接入到種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，控制搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng) 溫度為37°C，培養(yǎng)10h，得到種子液； (2) 搖床發(fā)酵培養(yǎng)：將產(chǎn)酶促進(jìn)劑加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將種子液以5%的量接種到 上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，控制搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)溫度為 37°C，培養(yǎng) 36h ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6g/L、豆柏20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸 氫二鉀6 g/L，氯化鈷0. 6 mmol/L、用去離子水配制； 所述產(chǎn)酶促進(jìn)劑包括滲透壓調(diào)節(jié)劑，有機(jī)酸鹽，表面活性劑； (3)將所得發(fā)酵液離心后取上清液，測(cè)定酶活力，確定產(chǎn)酶促進(jìn)劑加入的種類和用量； 所述產(chǎn)酶促進(jìn)劑包括滲透壓調(diào)節(jié)劑(如氯化鉀)、表面活活性劑(如吐溫80)、有機(jī)酸鹽 (如谷氨酸鈉、酒石酸鉀）等。
[0008] 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝具體步驟為： (1) 種子液的制備：將-40°c甘油管保存的重組枯草芽孢桿菌菌種Bacillus subtilis WB600接入到種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，控制搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng) 溫度為37°C，培養(yǎng)10h，得到種子液； 所述種子培養(yǎng)基為氯化鈉l〇g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L ; (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以5%的量接種到7L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的裝液量為 4L，通入無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速250-450rpm，通氣比為1.2 : 1，溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，維持最 低溶氧在30%，發(fā)酵培養(yǎng)30h ; 發(fā)酵培養(yǎng)過程的前12h的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37°C，12h后發(fā)酵培養(yǎng)溫度調(diào)整為30°C ;發(fā) 酵培養(yǎng)到15h時(shí)，一次性補(bǔ)加500g/L的葡萄糖補(bǔ)料液，使得發(fā)酵液中還原糖濃度為5g/L ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉20g/L、豆柏20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸 氫二鉀6 g/L、氯化鈷0. 6 mmol/L、氯化鉀0. I mol/L、谷氨酸鈉0. 6%、酒石酸鉀0. 7%、吐 溫_80 2. 4 mL/L、用去尚子水配制； (3) 參數(shù)測(cè)定：發(fā)酵過程中，每隔3h取樣，測(cè)定亮氨酸氨肽酶酶活力、生物量。
[0009] 亮氨酸氨肽酶酶活力測(cè)定方法為采用紫外分光光度法（LNA法）： 于2mL 50mmol/L pH8. 5的Tris-HCl緩沖液中加入ImL稀釋一定倍數(shù)的酶液，然后加 入ImL的L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺，混合均勻，50°C水浴反應(yīng)IOmin,于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸 光值。計(jì)算公式為：

【權(quán)利要求】
1. 一種重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于：以重組枯 草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600為出發(fā)菌株，將培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵過程控制組合優(yōu) 化，得出適合重組枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法；將重組枯草芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)基后，搖床培 養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種一定量的種子液到調(diào)整后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 每3h取樣測(cè)定酶活力參數(shù)； 重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600詳見中國(guó)專利CN102492645A。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，其特征 在于搖床培養(yǎng)步驟為： (1) 種子液的制備：將_40°C甘油管保存的重組枯草芽孢桿菌菌種Bacillus subtilis WB600接入到種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，控制搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng) 溫度為37°C，培養(yǎng)10h，得到種子液； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：將產(chǎn)酶促進(jìn)劑加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將種子液以5%的量接種到上述 發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，控制搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)溫度為37°C， 培養(yǎng)36h ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉6g/L、豆柏20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸 氫二鉀6 g/L、氯化鈷0. 6 mmol/L，用去離子水配制； 所述產(chǎn)酶促進(jìn)劑包括滲透壓調(diào)節(jié)劑，有機(jī)酸鹽，表面活性劑； (3) 將所得發(fā)酵液離心后取上清液，測(cè)定酶活力，確定產(chǎn)酶促進(jìn)劑加入的種類和用量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，其特征 在于發(fā)酵罐發(fā)酵工藝具體步驟為： (1) 種子液的制備：將_40°C甘油管保存的重組枯草芽孢桿菌菌種Bacillus subtilis WB600接入到種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，控制搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng) 溫度為37°C，培養(yǎng)10h，得到種子液； 所述種子培養(yǎng)基為氯化鈉 l〇g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L ; (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以5%的量接種到7L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的裝液量為 4L，通入無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速250-450rpm，通氣比為1.2 : 1，溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，維持最 低溶氧在30%，發(fā)酵培養(yǎng)30h ; 發(fā)酵培養(yǎng)過程的前12h的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37°C，12h后發(fā)酵培養(yǎng)溫度調(diào)整為30°C ;發(fā) 酵培養(yǎng)到15h時(shí)，一次性補(bǔ)加500g/L的葡萄糖補(bǔ)料液，使得發(fā)酵液中還原糖濃度為5g/L ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉20 g/L、豆柏20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸 氫二鉀6 g/L，氯化鈷0. 6 mmol/L、用去離子水配制；產(chǎn)酶促進(jìn)劑為：氯化鉀0. 1 mol/L、谷 氨酸鈉0.6%、酒石酸鉀0.7%、吐溫-80 2.4 mL/L; (3) 參數(shù)測(cè)定：發(fā)酵過程中，每隔3h取樣，測(cè)定亮氨酸氨肽酶酶活力、生物量。
【文檔編號(hào)】C12N9/48GK104293749SQ201410533027
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】田亞平, 孔峰 申請(qǐng)人:江南大學(xué)