專(zhuān)利名稱(chēng)：生物發(fā)光檢測(cè)特種致病菌使用的檢測(cè)方法和檢測(cè)用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物發(fā)光檢測(cè)特種致病菌使用的檢測(cè)方法和檢測(cè)用試劑盒，更確切地說(shuō)本發(fā)明利用生物發(fā)光法快速檢測(cè)微生物總量或者特定微生物數(shù)量的方法及檢測(cè)試劑盒，屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
快速檢測(cè)和識(shí)別致病菌不管是在臨床診斷方面，還是在食源性致病菌監(jiān)測(cè)方面， 甚至生物武器防察方面都是當(dāng)今社會(huì)的一個(gè)重要議題。食源性致病微生物種類(lèi)繁多，缺乏靈敏、便捷、特異的快速檢測(cè)技術(shù)，是食品安全和人民健康無(wú)法得到有效保障的主要原因之一。由于缺乏有力的監(jiān)測(cè)技術(shù)，據(jù)WHO報(bào)告，世界各國(guó)食源性疾病報(bào)告的發(fā)病率不到實(shí)際發(fā)病率的10%。因此開(kāi)發(fā)針對(duì)致病菌的快速、靈敏、可靠的檢測(cè)方法和現(xiàn)場(chǎng)、便攜的檢測(cè)儀器和配套試劑，是食品安全、人民健康和國(guó)家安全保障的迫切需要。水和食品中細(xì)菌的檢測(cè)，特別是致病性細(xì)菌的檢測(cè)，對(duì)于控制傳染病、保護(hù)環(huán)境衛(wèi)生和人民群眾身體健康都有著重要的意義。目前水體菌落總數(shù)測(cè)定采用國(guó)標(biāo)平板計(jì)數(shù)法即 37°C恒溫培養(yǎng)Mh，因?yàn)檫@種方法結(jié)果可靠，被視為微生物檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣、需要多種培養(yǎng)基和試劑，無(wú)法滿足當(dāng)今社會(huì)一些突發(fā)事件對(duì)微生物現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的迫切需求。ATP生物發(fā)光法是近年來(lái)發(fā)展最快的定量微生物檢測(cè)分析技術(shù)之一，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)，主要是通過(guò)間接測(cè)定活菌總數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)樣品清潔度或衛(wèi)生狀況。生物發(fā)光計(jì)數(shù)法利用ATP與蟲(chóng)熒光素-熒光素酶(Luciferin-Luciferase)復(fù)合物的反應(yīng)來(lái)測(cè)定是否存在三磷酸腺苷(ATP)。熒光素酶在鎂離子存在的條件下，與還原熒光素和ATP結(jié)合形成熒光素酶-熒光素-單磷酸腺苷的復(fù)合物，該復(fù)合物與氧結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光D-Luciferln + ATP + Oz^Oxy-Lncifeiin 4 AMP + ppi + H2O + hw實(shí)質(zhì)上，蟲(chóng)熒光素酶促進(jìn)的生物發(fā)光反應(yīng)，使用了 ATP分子內(nèi)的化學(xué)能，激發(fā)了熒光素氧化脫羧作用，然后產(chǎn)生發(fā)光。螢火蟲(chóng)熒光素酶幾乎唯一以ATP為特異的底物，來(lái)自自然界其它核苷的影響可被忽略發(fā)光試劑于飽和量下，每一 ATP分子能釋放出一個(gè)光子，因此光子的數(shù)量與ATP含量成正比。發(fā)出的光及ATP含量可使用相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLUs)來(lái)衡量，這些單位均可直接使用，而不必計(jì)算具體的ATP量或菌落形成單位(CFUs)。光子的數(shù)量可采用ATP熒光儀進(jìn)行測(cè)量。ATP生物發(fā)光法存在的首要問(wèn)題是靈敏度有時(shí)達(dá)不到衛(wèi)生學(xué)要求。從靈敏度角度講，ATP生物發(fā)光法要求樣品中細(xì)菌濃度最低不少于1000CFU/ml，但這種靈敏度有時(shí)達(dá)不到衛(wèi)生學(xué)要求，需要一定時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)。而免疫磁分離技術(shù)是一種行之有效的濃縮方法，可以將細(xì)菌數(shù)濃度提高10倍甚至100倍，從而節(jié)省了預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。因此將ATP生物發(fā)光法與免疫磁分離技術(shù)結(jié)合起來(lái)，檢測(cè)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等致病菌，將具有快速、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)，在食品、環(huán)境、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的發(fā)展前景。本發(fā)明針對(duì)目前飲用水和食品監(jiān)測(cè)和控制中缺乏快速、靈敏、可靠檢測(cè)致病菌的現(xiàn)狀，本發(fā)明擬采用生物發(fā)光法結(jié)合免疫磁分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)總菌和目標(biāo)致病菌，為后期開(kāi)發(fā)的便攜式生物傳感器提供配套的試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供生物發(fā)光檢測(cè)特種致病菌使用的檢測(cè)方法和檢測(cè)用試劑盒， 本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)特定食源性致病菌數(shù)量的方法，建立特異性的生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒，為衛(wèi)生監(jiān)督和食品安全提供可靠保障。本發(fā)明提供的快速檢測(cè)微生物數(shù)量的試劑盒，包括包被抗體的免疫磁珠、微生物裂解液、熒光素酶及保護(hù)劑、檢測(cè)緩沖液等試劑。檢測(cè)方法是利用生物發(fā)光法結(jié)合免疫磁珠識(shí)別特種致病菌，具體是利用免疫磁珠上的單克隆抗體或者多克隆抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)捕獲菌懸液或者樣品中的特異性致病菌，然后加入裂解液釋放細(xì)菌內(nèi)的三磷酸腺苷 (ATP)，最后通過(guò)熒光素(D-Luciferin)-熒光素酶(Luciferase)檢測(cè)ATP含量來(lái)判斷樣品中是否存在特定致病菌，并通過(guò)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定來(lái)推測(cè)含有特定致病菌的數(shù)量。(1)本發(fā)明提供的生物發(fā)光檢測(cè)特種致病菌使用的檢測(cè)方法的檢測(cè)步驟是a)先制作標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線，即對(duì)ATP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行等比稀釋?zhuān)瑵舛确秶?0_12-10_7mol/ 1。加入生物發(fā)光劑進(jìn)行檢測(cè)，得到ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其發(fā)光值之間的關(guān)系曲線。b)然后參照國(guó)標(biāo)方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，制備成體積為0. 2-10ml的樣品溶液。c)將一定量的免疫磁珠加入到樣品溶液中，共孵育30-100min，充分反應(yīng)后，磁分離除去上清液。然后加入少許檢測(cè)緩沖液洗滌，磁分離除去上清液，重復(fù)一次，得到濃縮的目標(biāo)微生物溶液。d)在上述濃縮的溶液中加入少量的微生物裂解液(10-100μ 1)，室溫作用 l_5min。e)加入檢測(cè)緩沖液(50-200 μ 1)，在避光的條件下加入生物發(fā)光試劑 (50-100 μ 1)，然后立即置發(fā)光檢測(cè)儀中測(cè)定發(fā)光值。f)樣品中相應(yīng)致病菌ATP含量的計(jì)算根據(jù)測(cè)定的發(fā)光值和a)中所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算樣品中相應(yīng)的ATP濃度和致病菌數(shù)量。(2)本發(fā)明所述的快速檢測(cè)微生物數(shù)量試劑盒，具體由包被抗體的免疫磁珠 (0. l-5ml)、ATP標(biāo)準(zhǔn)品(50-500 μ 1)、微生物裂解液(I-IOOml)、生物發(fā)光試劑(l_50ml)、檢測(cè)緩沖液(10-500ml)等試劑組成。其中包被抗體的免疫磁珠按照Iml計(jì)，含有1-100 μ g的單克隆抗體或者多克隆抗體、 0. I-Img的聚合物修飾的超順磁狗304或者γ -Fe2O3納米顆粒，含有I-IOmg牛血清白蛋白和吐溫80的緩沖液；ATP 標(biāo)準(zhǔn)品含有 1 X l(T7mol/l ATP ；微生物裂解液按照體積百分比計(jì)，含有0. 5-5%的三氯乙酸(TCA)、十二烷基三甲基溴化銨、曲拉通(Triton X-100)、二甲亞砜(DMSO)、苯甲烷胺中至少一種裂解試劑；檢測(cè)緩沖液包含l_20mM可溶性無(wú)機(jī)鎂鹽和三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)緩沖液 (pH = 7. 6-7. 8)
生物發(fā)光劑按照Iml計(jì)，含有0. 01-5mg的熒光素、0. OOl-Img的熒光素酶、 0. 5-10mg的牛血清白蛋白、0. 5-10mg海藻糖、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(pH = 7. 6-7. 8)本發(fā)明提供的特定致病菌快速檢測(cè)方法，無(wú)需增菌或者過(guò)濾，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，在2小時(shí)內(nèi)可完成檢測(cè)，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定中采用的平板計(jì)數(shù)法相比，具有快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有利于構(gòu)建簡(jiǎn)單、快速、靈敏、使用界面友好的分析系統(tǒng)，適合于食品、環(huán)境樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層普及應(yīng)用。


圖1生物發(fā)光快速檢測(cè)特種致病菌的流程圖。圖2生物發(fā)光法ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例的介紹，進(jìn)一步闡明本發(fā)明實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，但本發(fā)明決非僅局限于實(shí)施例。實(shí)施例1 生物發(fā)光法快速檢測(cè)E. coli0157:H7試劑盒的構(gòu)建生物發(fā)光法快速檢測(cè)E. coli0157:H7試劑盒包括包被抗體的免疫磁珠5瓶，每瓶 100 μ 1 ；標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液(1 X 10_7mOl/l) 1瓶，每瓶100 μ 1 ；微生物裂解液1瓶IOml ；檢測(cè)緩沖液5瓶，每瓶20ml ；生物發(fā)光試劑5瓶，每瓶1ml。其中，①試劑的配制包括a)免疫磁珠取500 μ g羧基磁珠于1. 5ml離心管中，加入Iml清洗緩沖液，混合均勻并超聲15min，磁分離洗滌兩遍后，重懸在250 μ 1 2_(Ν_嗎啉基)乙磺酸(MES)中，再分別加入500 μ gl-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和750 μ gN-羥基琥珀酰亞胺(MB)，37°C活化磁珠表面的羧基15min，然后用MES清洗兩次，重懸后加入50ug的抗體，室溫反應(yīng)池，將抗體偶聯(lián)于磁珠表面，得到免疫磁珠。用PBS洗滌偶聯(lián)后磁珠2遍，加入50ul含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，保存于4°C冰箱。b)標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑用檢測(cè)緩沖液10倍倍比稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)樣(1 X I(TmoVl)，獲得不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品。c)微生物裂解液采用三氯乙酸作為ATP提取劑，濃度為0. 5% 2%，經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理(12rC，30min)后在4°C下保存。d)檢測(cè)緩沖液以Tris-Acetate作為緩沖液。稱(chēng)取一定量的Tris堿，使定容后的濃度為0. 1M，定容前需要先調(diào)節(jié)pH值。將pH計(jì)插入Tris溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值為7. 75，然后定容，經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理(12rC，30min)后在4°C下保存。e)生物發(fā)光試劑取5mg的牛血清白蛋白和5mg海藻糖溶解于0. IM的Tris-HAc 緩沖液(PH = 7. 6-7. 8)，然后加入Img的熒光素、0. 5mg的熒光素酶，輕輕搖晃(不能振蕩) 使其溶解。使用前在室溫下放置1小時(shí)，使其溫度恢復(fù)到室溫，不用時(shí)避光儲(chǔ)存于-20°C的冰箱中。實(shí)施例2 采用生物生物發(fā)光法快速檢測(cè)特種致病菌試劑盒檢測(cè)食品中的大腸桿菌 0157:H7采用實(shí)施例1中的檢測(cè)試劑盒用于實(shí)施例2的檢測(cè)CN 102183648 A
說(shuō)明書(shū)
4/4頁(yè)檢測(cè)流程示意圖如圖1所示。具體步驟如下a)先制作標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線，即對(duì)ATP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行等比稀釋?zhuān)瑵舛确秶?0-12-l(T7mOl/ 1。加入生物發(fā)光劑進(jìn)行檢測(cè)，得到ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其發(fā)光值之間的關(guān)系。b)然后對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，制備成合適的樣品溶液。c)將免疫磁珠加入到樣品溶液中，共孵育，充分結(jié)合后除去上清液。d)加入少量的微生物裂解液，室溫作用lmin。e)加入檢測(cè)緩沖液lOOul，加入生物發(fā)光試劑50ul，然后立即置發(fā)光檢測(cè)儀中測(cè)
定發(fā)光值。f)樣品中相應(yīng)致病菌ATP含量的計(jì)算根據(jù)測(cè)定的發(fā)光值和a)中所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算樣品中相應(yīng)的ATP濃度和致病菌數(shù)量。結(jié)果表明該方法檢測(cè)限可達(dá)IO2CFU · πιΓ1.
權(quán)利要求
1.一種生物發(fā)光快速檢測(cè)特種致病菌使用的檢測(cè)方法，其特征在于利用免疫磁珠上的單克隆抗體或者多克隆抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)捕獲菌懸液或者待測(cè)試樣中的致病菌，然后加入微生物裂解液釋放細(xì)菌內(nèi)的三磷酸腺苷，最后通過(guò)熒光素-熒光素酶檢測(cè)ATP含量， 以判斷樣品中是否存在特定致病菌，并通過(guò)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定來(lái)推測(cè)含有特定致病菌的數(shù)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于按照下述步驟進(jìn)行(1)標(biāo)準(zhǔn)ATP曲線的制作對(duì)ATP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行等比稀釋?zhuān)瑵舛确秶?0_12 10_7mol/L，加入生物發(fā)光劑進(jìn)行檢測(cè)， 獲得ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其發(fā)光值之間的關(guān)系曲線；(2)待測(cè)樣品的預(yù)處理按照不同樣品的性質(zhì)參照國(guó)標(biāo)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理，制備成體積為0. 2-10ml 的樣品溶液；(3)特異性致病菌的磁珠富集將免疫磁珠加入到待測(cè)樣品溶液中，共孵育30-100min，充分反應(yīng)后，磁分離除去上清液；(4)致病菌裂解在步驟(3)所述的待測(cè)樣品中加入10-100 μ 1微生物裂解液，室溫作用l-5min。(5)ATP生物發(fā)光測(cè)試在步驟(4)所述的溶液中加入檢測(cè)緩沖液50-200 μ 1，加入生物發(fā)光試劑50-100μ 1， 然后立即置發(fā)光檢測(cè)儀中測(cè)定發(fā)光值；(6)試樣中相應(yīng)致病菌ATP含量的計(jì)算根據(jù)步驟(5)測(cè)定的發(fā)光值和步驟⑴中所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算樣品中相應(yīng)的ATP濃度和致病菌數(shù)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包被抗體的免疫磁珠按照Iml計(jì)，含有1-100 μ g的單克隆抗體或者多克隆抗體、0. I-Img的聚合物修飾的超順磁!^e3O4或者 Y -Fe2O3納米顆粒和含有I-IOmg牛血清白蛋白和吐溫80的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的微生物裂解液按照體積百分比計(jì)，含有0. 5-5%的三氯乙酸、十二烷基三甲基溴化銨、曲拉通、二甲亞砜、苯甲烷胺中至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于檢測(cè)緩沖液包含l_20mM可溶性無(wú)機(jī)鎂鹽和三羥甲基氨基甲烷，緩沖液的PH = 7. 6-7. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于生物發(fā)光劑按照Iml計(jì)，含有0.01-5mg 的熒光素、0. OOl-Img的熒光素酶、0. 5-10mg的牛血清白蛋白、0. 5-10mg海藻糖和pH為 7. 6-7. 8的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
7.由權(quán)利要求1_3、5或6中任一項(xiàng)所述的方法配套構(gòu)建的試劑盒，其特征在于具體由包被抗體的免疫磁珠0. l-5ml、ATP標(biāo)準(zhǔn)品500-500 μ m、微生物裂解液I-IOOml、生物發(fā)光試劑1-50ml、檢測(cè)緩沖液10-500ml組成。
8.按權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于用于快速檢測(cè)E.coli0157:H7試劑盒包括包被抗體的免疫磁珠5瓶，每瓶100 μ 1 ；標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液(1 X 10_7mol/l) 1瓶，每瓶100 μ 1 ；微生物裂解液1瓶IOml ；檢測(cè)緩沖液5瓶，每瓶20ml ；熒光素酶及保護(hù)劑5瓶，每瓶Iml ；其中①免疫磁珠取500μ g羧基磁珠于1. 5ml離心管中，加入Iml清洗緩沖液，混合均勻并超聲15min，磁分離洗滌兩遍后，重懸在250 μ 1 2-(N-嗎啉基)乙磺酸中，再分別加入 500 μ gl-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和750 μ g N-羥基琥珀酰亞胺，37°C條件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2- (N-嗎啉基)乙磺酸清洗兩次，重懸后加入50ug 的抗體，室溫反應(yīng)池，將抗體偶聯(lián)于磁珠表面，得到免疫磁珠。用PBS洗滌偶聯(lián)后磁珠2遍， 加入50 μ 1磷酸鹽緩沖液中，保存于4°C冰箱。②標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑用檢測(cè)緩沖液10倍的倍比稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)樣，獲得10-12-10-7mol/L 濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品；③微生物裂解液采用三氯乙酸作為ATP提取劑，濃度為0.5% 2%，經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理后在4°C下保存；④檢測(cè)緩沖液以Tris-Acetate作為緩沖液，配制方法是稱(chēng)取一定量的Tris堿，使定容后的濃度為0. 1M，定容前需要先調(diào)節(jié)pH值；將pH計(jì)插入Tris溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值為7. 75，然后定容，經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理后在4°C下保存；⑤生物發(fā)光試劑取5mg的牛血清白蛋白和5mg海藻糖溶解于0.IM的pH為7. 6-7. 8 的Tris-HAc緩沖液，然后加入Img的熒光素、0. 5mg的熒光素酶，輕輕搖晃使其溶解，避光儲(chǔ)存于-20°C的冰箱中。
9.按權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于a)①中磷酸鹽緩沖液含有0.牛血清蛋白；b)③和④中滅菌處理?xiàng)l件下121°C、30min；c)⑤中所述的搖晃不能振蕩；d)⑤中所述的生物發(fā)光試劑使用前從-20°C的冰箱中取出后，在室溫下放置1小時(shí)，使溫度恢復(fù)到室溫。
10.按權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于檢測(cè)時(shí)無(wú)需增菌或過(guò)濾，在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)食品中大腸桿菌0157:H7，檢測(cè)限可達(dá)IO2CFU · πιΓ1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用生物發(fā)光法結(jié)合免疫磁珠識(shí)別檢測(cè)特種致病菌的方法及檢測(cè)用試劑盒。本方法利用免疫磁珠上的單克隆抗體或者多克隆抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)捕獲菌懸液或者樣品中的細(xì)菌，然后加入裂解液釋放細(xì)菌內(nèi)的三磷酸腺苷(ATP)，最后通過(guò)熒光素(D-Luciferin)-熒光素酶(Luciferase)檢測(cè)ATP含量來(lái)判斷樣品中是否存在特定微生物，并通過(guò)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定來(lái)推測(cè)含有特定微生物的數(shù)量。本發(fā)明提供的試劑盒，包括包被抗體的免疫磁珠、微生物裂解液、熒光素酶及保護(hù)劑、檢測(cè)緩沖液等試劑。通過(guò)本發(fā)明能夠大大縮短檢測(cè)時(shí)間(2小時(shí)以?xún)?nèi))，無(wú)需增菌或者過(guò)濾，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性強(qiáng)，適合于食品、環(huán)境樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層普及應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102183648SQ20111002994
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者周洪波, 葛玉卿, 趙建龍, 金慶輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所