專利名稱：氮源用于提高金藻生物量與油脂含量的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術領域，具體涉及海洋單細胞微藻金藻的生長培養(yǎng)以及油脂調控。
背景技術：
當前，能源問題已經成為主導國家經濟發(fā)展以及戰(zhàn)略安全的主要問題。按目前的探明儲量以及消耗速度上看，世界存儲石油僅可維持40年的使用。此外，以石油為主的傳統化石能源的消耗給環(huán)境帶來嚴重的污染，空氣中70%的C02和顆粒懸浮物均來自各種化石燃料的燃燒。因此，化石能源的日趨減少以及造成的環(huán)境污染使科研工作者把注意力集中到可再生能源的開發(fā)利用上。在各種可再生能源中，生物質能是地球上最普遍的具有廣泛實用價值的一種可再生能源資源。微藻，由于其具有光合效率高、繁殖快、油脂含量高、不占用農業(yè)耕地等特點，使微藻油脂成為目前第三代生物能源開發(fā)的原料。目前對于大部分微藻尤其是綠藻而言，提高其細胞油脂含量的主要培養(yǎng)調控方法是氮限制脅迫，即將藻細胞接種于氮限制或無氮環(huán)境的培養(yǎng)體系中以改變其體內碳流的途徑，使合成蛋白或碳水化合物的碳源用于向合成脂肪的方向流動，從而達到提高脂肪含量的目的。然而由于氮源的限制使藻細胞的分裂、生長受到限制，在培養(yǎng)后期藻細胞會出現分裂活動停止，細胞活力下降導致生物量急劇下降，最后藻細胞的總脂肪產量反而沒有得到極大的提升。湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)都是海洋微藻，屬于金藻門、普林藻綱、等鞭藻目、等鞭藻科、等鞭藻屬。據報道，金藻尤其是球等鞭金藻體內的總脂肪可以占其干重的20-40%，并且富含多不飽和脂肪酸，而迄今為止對于湛江等鞭金藻還未有報道。因此，找到一種既能提高金藻生物量又能提高其油脂含量的培養(yǎng)方法成為亟待解決的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對金藻(湛江等鞭金藻、球等鞭金藻)提供了一種生物量和油脂含量筒同時得以提高的培養(yǎng)方法。為了實現上述目的，本發(fā)明采用的培養(yǎng)方法包括以下步驟一種提高金藻生物量與油脂含量的培養(yǎng)方法1)藻細胞預培養(yǎng)于容器中，待生長至指數期；2)將指數期的藻細胞接種于添加氮源的傳統滅菌的f/2培養(yǎng)基中，于柱狀光生物反應器中通空氣培養(yǎng)；8-10天時間內將藻細胞收獲；其中，于f/2培養(yǎng)基中添加氮源的量為0. 4 200mmol/L。3)油脂提取與測定將生長平臺期的藻液收獲離心，所得的藻泥經冷凍干燥，得到干藻粉后采用氯仿_甲醇法分析測定油脂含量。添加氮源的添加方式為一次性加入、間歇補加或連續(xù)補加；其中一次性加入氮源，濃度為20 200mmol/L ；間歇補加為每12_72h內向培養(yǎng)體系中加入氮源，濃度為0. 2 IOOmmol/L ；連續(xù)補加的方式使培養(yǎng)體系中的氮源濃度維持在0. 88 50mmol/L。該方法適應的藻株為湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)或球等鞭金 ■ (Isochrysis galbana)。指數期的藻細胞采用高密度接種于添加氮源的傳統滅菌的m培養(yǎng)基中，接種終濃度至少為 6X IO6Cell. mr1 IOX 106cell. πιΓ1。藻細胞生長于添加氮源的傳統f/2培養(yǎng)基中，選用的氮源為硝酸鹽或尿素；所述硝酸鹽為硝酸鈉、硝酸鉀。所述培養(yǎng)溫度25 30°C，光強150 βΟΟμπιοΙ.πΓ、-1，光暗比為12 14h 12 10h，空氣中CO2體積濃度為 5%，通氣速率0.6 1.2vvm。所述光生物反應器為柱狀光生物反應器，柱體直徑為3-8厘米。本發(fā)明的優(yōu)點如下1.脂肪產量高本發(fā)明所得到的藻細胞生物量有顯著的提高，細胞密度最高可達 1. IXlO8 ~ 1. 3X 108cell/ml，干重最高2. 82 3. 2g/L，油脂含量最高達36 53%，而普通培養(yǎng)條件下細胞密度最高僅為2. 4 3. OX 107cell/ml，干重最高0. 9 1. 18g/L，油脂含量25 29 %，因此脂肪產量得到了大大提高，是普通培養(yǎng)條件下的3 4倍，彌補了目前由氮源限制帶來的油脂含量提高且生物量下降的缺陷。2、應用前景好本發(fā)明所選的藻種為海洋單細胞微藻，利用海水規(guī)模培養(yǎng)，緩解淡水資源危機。同時，對0)2作為藻細胞生長的碳源的利用也可以在一定程度上固定大氣中的 C02，起到緩解溫室效應的作用。此外，藻細胞生長快速，8 10天內即可達到平臺期。溫度適應性強，9 35°C范圍內均能生長繁殖，光照適應性強，20 600 μ mo 1. JiT2iT1范圍內均可生長繁殖。3、副產品價值高在藻細胞獲得高油脂含量的條件下，其蛋白含量也非?？捎^約占干重的37% (Lowrry法測定)。金藻的脂肪酸成分種類多達13種，其中DHA含量約占總脂肪酸的10 13%，在開發(fā)成生物燃料的同時可以提取出來開發(fā)成高附加值生物產品。本發(fā)明培養(yǎng)調控方法藻細胞密度最高可達1.3X108Cell/ml，干重最高達3. 12g/ L，油脂含量最高可達53%。該方法在獲得高生物量同時也獲得了藻細胞的高油脂含量，彌補了目前利用氮限制提高藻細胞油脂含量但降低生物量的不足。該藻株為海洋單細胞微藻，海水培養(yǎng)，并具有個體細胞小，生長速度快等特點，有潛力作為生物燃料的原料規(guī)模培養(yǎng)。
具體實施例方式傳統f/2培養(yǎng)基配方1)氮源75g/LNaN03 ；2)磷源5g/LNaH2P04 · H2O ；3)金屬元素3· 15g/L FeCl3 · 6Η20，4· 36g/L Na2EDTA, 0. 0098g/LCuS04 · 5H20, 0. 0063g/L Na2MoO4 · 2H20,0. 022g/L ZnSO4 · 7H20,0. 01g/LCoCl2 · 6H20, 0. 18g/L MnCl2 · 4H20 ；4)維生素 0. OOlg/L vitamin B12,0. 2g/L vitamin BijO. OOlg/L D-生物素·
向每升海水中添加上述氮源、磷源、金屬元素各1ml，維生素0. 5ml。滅菌方法采用高溫式滅菌，滅菌溫度為110°C，滅菌時間為lOmin。指數期是指藻細胞的快速生長期，金藻藻細胞在3L錐形瓶中生長至第5天進入指數期。實施例1首先將湛江等鞭金藻藻細胞預培養(yǎng)于3L錐形瓶中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)體積2L，光照培養(yǎng)架上生長至指數期，藻細胞密度在600 700X IO4Cell. ml—1時，將藻液離心，收集藻細胞。將指數期的藻液離心后接種于滅菌的m培養(yǎng)基中，于600ml直徑為5cm的柱狀光生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)體積500ml，接種終濃度為SXlO6Cell ·πιΓ1.氮源選用硝酸鈉， 培養(yǎng)過程中不補加氮源，每72h補加磷源、金屬元素、維生素1次，其補加濃度與f/2培養(yǎng)基的原配方濃度一致，培養(yǎng)溫度25士 1°C，光強200μπιΟ1 · HT2s-1,光暗比為14h IOh條件下通CO2培養(yǎng)，CO2濃度為2%，通氣速率0. 8vvm，第9天離心收獲藻細胞。藻細胞密度最高為2. 4X 107cell/ml，藻液過濾于預先干燥稱重的Whatman GF/C 纖維膜上，再用0. 5M碳酸氫銨洗滌兩遍，烘干至恒重測定干重，計算其生物量為1. 18g/L。 離心后所得藻泥經冷凍干燥得到干藻粉，氯仿-甲醇法測定其油脂含量為28%，總脂肪產量為 0. 33g/L (表 1)。實施例2首先將湛江等鞭金藻藻細胞預培養(yǎng)于3L錐形瓶中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)體積2L，光照培養(yǎng)架上生長至指數期，藻細胞密度在600 700 X IO4Cell · ml—1時，將藻液離心，收集藻細胞。將指數期的藻液離心后接種于滅菌的f/2培養(yǎng)基中，于600ml直徑為5cm的柱狀光生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)體積500ml，接種終濃度為SXlO6Cell ^mr115氮源選用尿素， 每24h內向培養(yǎng)體系中加入0. 03g/L尿素，每72h補加磷源、金屬元素、維生素1次，其補加濃度與f/2培養(yǎng)基原配方濃度一致，培養(yǎng)溫度25士 1°C，光強200 μ mol. HT2iT1,光暗比為 14h IOh條件下通CO2培養(yǎng)，CO2濃度為2%，通氣速率0.8vvm，第9天離心收獲藻細胞。藻細胞密度最高為1. 3X 108cell/ml，藻液過濾于預先干燥稱重的Whatman GF/C 纖維膜上，再用0. 5M碳酸氫銨洗滌兩遍，烘干至恒重測定干重，計算其生物量為3. Og/L。離心后所得藻泥經冷凍干燥得到干藻粉，氯仿_甲醇法測定其油脂含量為36%，總脂肪產量為 1.08g/L (表 1)。實施例3 首先將湛江等鞭金藻藻細胞預培養(yǎng)于3L錐形瓶中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)體積2L，光照培養(yǎng)架上生長至指數期，藻細胞密度在600 700X IO4Cell. ml—1時，將藻液離心，收集藻細胞。 將指數期的藻液離心后接種于滅菌的f/2培養(yǎng)基中，于600ml直徑為5cm的柱狀光生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)體積500ml，接種終濃度為SXlO6Cell. ml—1。氮源選用硝酸鈉， 每24h內向培養(yǎng)體系中加入4. 5g/L硝酸鈉，每72h補加磷源、金屬元素、維生素1次，其補加濃度與f/2培養(yǎng)基原配方濃度一致，培養(yǎng)溫度25士 1°C，光強200 μ mol. HT2iT1,光暗比為14h IOh條件下通CO2培養(yǎng)，CO2濃度為2%，通氣速率0.8vvm，第9天離心收獲藻細胞。藻細胞密度最高為5. 8X 107cell/ml，藻液過濾于預先干燥稱重的Whatman GF/C 纖維膜上，再用0. 5M碳酸氫銨洗滌兩遍，烘干至恒重測定干重，計算其生物量為2. lg/L。離心后所得藻泥經冷凍干燥得到干藻粉，氯仿_甲醇法測定其油脂含量為53%，總脂肪產量為 1. llg/L(表 1)。實施例4首先將湛江等鞭金藻藻細胞預培養(yǎng)于3L錐形瓶中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)體積2L，光照培養(yǎng)架上生長至指數期，藻細胞密度在600 700X IO4Cell. ml—1時，將藻液離心，收集藻細胞。將指數期的藻液離心后接種于滅菌的f/2培養(yǎng)基中，于600ml直徑為5cm的柱狀光生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)體積500ml，接種終濃度為SXlO6Cell. ml—1。氮源選用硝酸鈉， 采用連續(xù)補加的方式使培養(yǎng)體系中加入硝酸鈉的濃度維持在0. 068g/L，每72h補加磷源、 金屬元素、維生素1次，其補加濃度與f/2培養(yǎng)基原配方濃度一致，培養(yǎng)溫度25士 1°C，光強 20(^11101.111-28-1，光暗比為1411 IOh條件下通CO2培養(yǎng)，CO2濃度為2%，通氣速率0. 8vvm， 第9天離心收獲藻細胞。藻細胞密度最高為8X 107cell/ml藻液過濾于預先干燥稱重的WhatmanGF/C纖維膜上，再用0. 5M碳酸氫銨洗滌兩遍，烘干至恒重測定干重，計算其生物量為1. 6g/L。離心后所得藻泥經冷凍干燥得到干藻粉，氯仿-甲醇法測定其油脂含量為43%，總脂肪產量為 0. 69g/L (表 1)。實施例5首先將湛江等鞭金藻藻細胞預培養(yǎng)于3L錐形瓶中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)體積2L，光照培養(yǎng)架上生長至指數期，藻細胞密度在600 700 X IO4Cell · ml—1時，將藻液離心，收集藻細胞。將指數期的藻液離心后接種于滅菌的f/2培養(yǎng)基中，于600ml直徑為5cm的柱狀光生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)體積500ml，接種終濃度為SXlO6Cell. ml—1。氮源選用硝酸鉀， 一次性向培養(yǎng)體系中加入1.5g/L硝酸鉀，每72h補加磷源、金屬元素、維生素1次，其補加濃度與f/2培養(yǎng)基原配方濃度一致，培養(yǎng)溫度25士 1°C，光強200 μ mol. JiT2iT1,光暗比為 14h IOh條件下通CO2培養(yǎng)，CO2濃度為2%，通氣速率0.8vvm，第9天離心收獲藻細胞。藻細胞密度最高為1. IX 108cell/ml，藻液過濾于預先干燥稱重的Whatman GF/C 纖維膜上，再用0. 5M碳酸氫銨洗滌兩遍，烘干至恒重測定干重，計算其生物量為2. 5g/L。離心后所得藻泥經冷凍干燥得到干藻粉，氯仿_甲醇法測定其油脂含量為40%，總脂肪產量為 1.00g/L (表 1)。表 1
權利要求
1.氮源用于提高金藻生物量與油脂含量的培養(yǎng)方法，其特征在于藻細胞預培養(yǎng)于容器中，待生長至指數期；將指數期的藻細胞接種于添加氮源的傳統滅菌的f/2培養(yǎng)基中，于柱狀光生物反應器中通空氣培養(yǎng)；8-10天時間內將藻細胞收獲；其中，于f/2培養(yǎng)基中添加氮源的量為0. 4 200mmol/L。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于添加氮源的添加方式為一次性加入、間歇補加或連續(xù)補加；其中一次性加入氮源，濃度為20 200mmol/L ；間歇補加為每12_72h內向培養(yǎng)體系中加入氮源，濃度為0. 2 lOOmmol/L ；連續(xù)補加的方式使培養(yǎng)體系中的氮源濃度維持在0. 88 50mmol/L。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于該方法適應的藻株為湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhangjiangensis) 求更t· (Isochrysis galbana) 0
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于指數期的藻細胞采用高密度接種于添加氮源的傳統滅菌的f/2培養(yǎng)基中，接種終濃度為6X IO6Cell · ml—1 IOXlO6Cell · ml—1。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于藻細胞生長于添加氮源的傳統f/2培養(yǎng)基中，選用的氮源為硝酸鹽或尿素。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述硝酸鹽為硝酸鈉或硝酸鉀。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度25 30°C，光強150 30(^11101.111-28-1，光暗比為12-1411 12-lOh，空氣中CO2體積濃度為1 % 5 %，通氣速率 0. 6 1. 2vvm。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述光生物反應器為柱狀光生物反應器， 柱體直徑為3-8厘米。
全文摘要
一種提高金藻生物量與油脂含量的培養(yǎng)方法公開了一種利用氮源提高金藻生物量同時提高油脂含量的培養(yǎng)調控方法，是將藻株高密度接種于傳統的f/2滅菌培養(yǎng)基中，每12～72h內向培養(yǎng)體系中加入氮源，濃度為0.2～100mmol/L，培養(yǎng)溫度25～30℃，光強100～300μmol.m-2s-1，光暗比為14h∶10h條件下通CO2培養(yǎng)，通氣速率0.6～1.2vvm，8-10天時間內收獲，藻細胞密度最高可達1.3×108cell/ml，干重最高達3.12g/L，油脂含量最高可達53％。該方法在獲得高生物量同時也獲得了藻細胞的高油脂含量，彌補了目前利用氮限制提高藻細胞油脂含量但降低生物量的不足。
文檔編號C12N1/12GK102453684SQ20101052130
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月27日 優(yōu)先權日2010年10月27日
發(fā)明者馮迪娜, 張衛(wèi), 薛松, 陸洪斌, 陳兆安 申請人:中國科學院大連化學物理研究所